Das Protozoon Giardia duodenalis ist eine der Hauptursachen für infektiöse Magen-Darm-Erkrankungen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind jedoch nach wie vor unklar. Um die Pathogenität G. duodenalis‘ untersuchen zu können, wird ein Modellsystem benötigt, dass die Komplexität des Darmepithels widerspiegelt. Diese Arbeit zeigt die Etablierung eines Zellkultursystems auf der Basis von organoid-abgeleiteten Epithelien unter Verwendung von filter-basierten Zellkultureinsätzen. Wir haben Protokolle für die Etablierung von organoid-basierten Zellkulturen (ODMs) vier verschiedener Wirte zoonotischer Protozoen unter Verwendung eines einzigen Protokolls erstellt. Die Charakterisierung zeigte, dass das Modellsystem erfolgreich die Polarisierung des Darmepithels nachahmt, aus mehreren Zelltypen besteht und eine Infektion ermöglicht. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse der durch G. duodenalis induzierten Barrierestörung in ODMs auf Transkriptions-, Protein- und Funktionsebene. Die Infektion von humanen duodenalen Zellen führte zu einem Verlust der epithelialen Barrierefunktion. Mit Hilfe des transepithelialen elektrischen Widerstandes und Dextran Flux wurde eine Erhöhung der Barrieredurchlässigkeit beobachtet. Die Hemmung von zuvor in immortalisierten Zellmodellen beschriebenen Reaktionswegen konnte die Barrierefunktion nicht wiederherstellen. Stattdessen konnten Veränderungen der Ionenhomöostase sowie den Zusammenbruch der zonula occludens nachgewiesen werden. Der beobachtete Phänotyp konnte auf die Aktivierung des cAMP/PKA/CREB-Signalwegs, als einen von mehreren kausalen Faktoren, zurückgeführt werden. Hier zeigen wir die Etablierung eines aus Organoiden abgeleiteten Modells, das die Untersuchung von G. duodenalis Infektionen in vitro ermöglicht. Mit unserem Modell konnten wir eine neue Reihenfolge von Ereignissen entschlüsseln, die einen der Faktoren während symptomatischer Giardiasis darstellt. / The protozoan Giardia duodenalis is a one of the major causes of gastrointestinal illness. Underlying pathomechanisms remain unclear. An in vitro model system that also mimics the complexity of intestinal epithelium is needed to allow pathogenicity studies. This thesis shows the establishment of a cell culture system based on organoid-derived epithelia using permeable cell culture inserts. We have provided guidelines on the establishment of organoid-derived monolayers (ODMs) of four different hosts of zoonotic protozoa using a single protocol. Characterization showed that the model system successfully mimics intestinal polarization, is composed of multiple cell types and allows for infection with multiple protozoan parasites. As the main focus of the thesis, analysis of G. duodenalis-induced barrier breakdown in ODMs was performed on transcriptional, protein and functional level. Infection of human duodenal, organoid-derived monolayers resulted in a time- and dose-dependent breakdown of epithelial barrier function. Barrier permeability increases were observed ranging from ions to macromolecules as measured by transepithelial electrical resistance and Dextran flux. Inhibition of previously proposed key pathogen-induced pathways observed in immortalized cell models did not rescue barrier dysfunction. We could instead show changes in ion homeostasis, and tight junctional breakdown. While none of the previously proposed effector pathways appeared to be responsible, we could pin-point the observed phenotype to activation of the cAMP/PKA/CREB signaling pathway, as one of the factors of the multifactorial barrier breakdown. The establishment of an organoid-derived infection model is shown, allowing the study of in vitro Giardia duodenalis infections. Using this model, we could decipher a new series of events that may be one of the factors causing the intestinal barrier breakdown observed in symptomatic Giardiasis.

Les interactions entre les végétaux et les organismes telluriques sont déterminantes pour la décomposition des matières organiques et la nutrition minérale des plantes. L’objectif général de la thèse était de comprendre comment les interactions multi-trophiques dans la rhizosphere agissent sur la disponibilité en azote minéral et l’allocation en carbone dans la plante. Nous avons mis au point des dispositifs de culture de plante, permettant de contrôler l’environnement biotique des racines (inoculation par des espèces symbiotiques modèles : un protozoaire bactériophage et/ou une espèce mycorhizienne à arbuscules). Nous avons utilisé l’azote 15N et le carbone 13C pour tracer le cheminement de l’azote du sol vers la plante et le carbone assimilé par photosynthèse, de la plante vers le sol et les microorganismes du sol. L’allocation de C vers les racines et la rhizosphère est dépendante de la qualité de la litière foliaire enfouie. La structure de la communauté microbienne déterminée par l’analyse des profils d’acides gras (PLFA) est modifiée par la présence de protozoaires pour la litière à C/N élevé. Les mycorhizes à arbuscules et les protozoaires présentent une complémentarité pour l’acquisition du C et de N par la plante. Les protozoaires remobilisent l’azote de la biomasse microbienne par leur activité de prédation. Les hyphes fongiques transportent du C récent issu de la plante vers des sites riches en matière organique non accessibles aux racines. Ainsi, l’activité de la communauté microbienne est stimulée et la disponibilité en N augmentée lorsque des protozoaires sont présents. Les perspectives de ce travail sont de déterminer si (i) les interactions étudiées dans ce dispositif modèle peuvent être généralisées à d’autres interactions impliquant d’autres espèces de champignons mycorhiziens et de protozoaires (ii) la phénologie de la plante et la composition des communautés végétales influence la nature et l’intensité des réponses obtenues / Plants interact with multiple root symbionts for fostering uptake of growth-limiting nutrients. In turn, plants allocate a variety of organic resources in form of energy-rich rhizodeposits into the rhizosphere, stimulating activity, growth and modifying diversity of microorganisms. The aim of my study was to understand how multitrophic rhizosphere interactions feed back to plant N nutrition, assimilate partitioning and growth. Multitrophic interactions were assessed in a single-plant microcosm approach, with arbuscular mycorrhizal fungi (Glomus intraradices) and bacterial feeding protozoa (Acanthamoeba castellanii) as model root symbionts. Stable isotopes enabled tracing C (13C) and N (15N) allocation in the plant and into the rhizosphere. Plant species identity is a major factor affecting plant-protozoa interactions in terms of N uptake and roots and shoot morphology. Plants adjusted C allocation to roots and into the rhizosphere depending on litter quality and the presence of bacterial grazers for increasing plant growth. The effect of protozoa on the structure of microbial community supplied with both, plant C and litter N, varied with litter quality added to soil. AM-fungi and protozoa interact to complement each other for plant benefit in C and N acquisition. Protozoa re-mobilized N from fast growing rhizobacteria and by enhancing microbial activity. Hyphae of AM fungi acted as pipe system, translocating plant derived C and protozoan remobilized N from source to sink regions. Major perspectives of this work will be to investigate whether (i) multitrophic interactions in our model system can be generalized to other protozoa-mycorrhiza-plant interactions (ii) these interactions are depending on plant phenology and plant community composition

Bien que l’évolution de la résistance aux médicaments soit l'un des plus grands défis dans la lutte contre les maladies infectieuses, beaucoup de phénomènes restent inexpliqués. Dans le cas de la leishmaniose, la résistance est un problème majeur depuis plusieurs années. Cette maladie zoonotique négligée est causée par le parasite protozoaire Leishmania, transmis par des phlébotomes lors du repas sanguin. Chez l’humain, elle se décline en trois formes principales : viscérale, cutanée et muco-cutanée. La leishmaniose peut aussi se développer chez les chiens infectés, qui constituent un réservoir majeur de transmission. Sans vaccin efficace, le contrôle de la maladie repose principalement sur la chimiothérapie, mais peu de molécules homologuées sont disponibles. En outre, les mêmes produits sont utilisés chez les chiens et les humains, ce qui favorise l'émergence et la propagation de souches résistantes aux médicaments. Leishmania est en effet connu pour détenir d’incroyables particularités génomiques (telles que la formation d’amplicons circulaires contenant des gènes de résistance) qui lui permettent de survivre dans des conditions de stress, telles que la pression médicamenteuse. Par ailleurs, Leishmania est un eucaryote qui a conservé la capacité de produire des vésicules extracellulaires (EVs) au cours de l’évolution. Ces particules de taille nanométrique sont produites naturellement par la majorité des cellules biologiques et ont un contenu riche en protéines, lipides et acides nucléiques. Bien que des caractéristiques clés des EVs du protozoaire aient été découvertes, aucune étude n’a encore été réalisée sur les EVs de souches résistantes. Ainsi, cet aspect constitue le cœur de mon projet de recherche de doctorat : l’étude des EVs de Leishmania et leur rôle dans le phénomène de la résistance aux médicaments. Nos travaux sont les premiers à démontrer que les mécanismes de résistance aux médicaments peuvent induire des changements dans la morphologie, la taille et la distribution des EVs de Leishmania. Nous avons identifié le protéome de base des EVs du parasite et nous avons mis en évidence des protéines enrichies dans les EVs libérées par des parasites résistants à l'antimoine, à la miltéfosine et à l'amphotéricine B. Nous avons également étudié le contenu en ADN des EVs de parasites résistants et confirmé l'enrichissement des amplicons porteurs de gènes de résistance aux médicaments, associés aux EVs. En complément, nos tests de transferts d’EVs ont prouvé que ces vésicules permettent le transfert horizontal de gènes de résistance : un mécanisme alternatif de résistance aux médicaments. Finalement, nous avons montré que les EVs des parasites résistants améliorent la croissance des promastigotes et réduisent l'accumulation de ROS, ce qui favorise la survie et la propagation des populations résistantes aux médicaments. En conclusion, ces découvertes permettront le développement de nouveaux tests diagnostiques et de nouvelles approches thérapeutiques pour certaines maladies infectieuses zoonotiques, basés sur les profils des EVs. De plus, elles ont une importance majeure dans la compréhension de la résistance médicamenteuse et prouve que les EVs fonctionnent comme des médiateurs efficaces dans le transfert horizontal de gène. Ce nouveau mécanisme facilite ainsi la transmission des gènes de résistance aux médicaments entre les parasites et favorise leur survie lorsqu'ils sont confrontés à des environnements stressants. / Although the evolution of drug resistance is one of the greatest challenges in the fight against infectious diseases, many phenomena remain unexplained. In the case of leishmaniasis, resistance has been a major problem for several years. This neglected zoonotic disease is caused by the protozoan parasite Leishmania, transmitted by sandflies during the blood meal. In humans, it comes in three main forms: visceral, cutaneous, and mucocutaneous. Leishmaniasis can also develop in infected dogs, which constitute a major reservoir of transmission. Without an effective vaccine, the control of the disease relies mainly on chemotherapy, but few approved molecules are available. Furthermore, the same products are used in dogs and humans, which promotes the emergence and spread of drug-resistant strains. Leishmania is indeed known to possess incredible genomic peculiarities (such as the formation of circular amplicons containing resistance genes) which allow it to survive under stressful conditions, such as drug pressure. Furthermore, Leishmania is a eukaryote that has retained the ability to produce extracellular vesicles (EVs) during evolution. These nano-sized particles are produced naturally by most biological cells and have a rich content of proteins, lipids, and nucleic acids. Although key characteristics of the protozoan EVs have been discovered, no studies have yet been performed on the EVs of resistant strains. Thus, this aspect constitutes the heart of my doctoral research project: the study of Leishmania EVs and their role in the phenomenon of drug resistance. Our work is the first to demonstrate that drug resistance mechanisms can induce changes in the morphology, size, and distribution of Leishmania EVs. We have identified the basic proteome of parasite EVs, and we have demonstrated enriched proteins in EVs released by parasites resistant to antimony, miltefosine and amphotericin B. We also studied the DNA content of EVs from resistant parasites and confirmed the enrichment of amplicons carrying drug resistance genes associated with EVs. In addition, our EV transfer tests have proven that these vesicles allow the horizontal transfer of resistance genes: an alternative mechanism of drug resistance. Finally, we showed that EVs from resistant parasites enhance promastigote growth and reduce ROS accumulation, which promotes the survival and spread of drug-resistant populations. In conclusion, these discoveries will allow the development of new diagnostic tests and new therapeutic approaches for certain zoonotic infectious diseases, based on the profiles of EVs. Moreover, these findings are of major importance in the understanding of drug resistance and prove that EVs function as effective mediators in horizontal gene transfer. This new mechanism thus facilitates the transmission of drug resistance genes between parasites and promotes their survival when confronted with stressful environments.