Le protozoaire flagellé Histomonas meleagridis est responsable d'une maladie chez les oiseaux galliformes, nommée histomonose. La culture in vitro de ce parasite anaérobie est qualifiée d'agnobiotique car il y a présence d'une flore bactérienne non déterminée. L'identification des bactéries dans cette flore montre l'existence d'une flore très diversifiée. Des essais de culture axénique et monoxénique suggèrent que les bactéries sont essentielles au développement in vitro du parasite. Par des stratégies de PCR, RT-PCR et RACE-PCR, nous avons les gènes complets codant trois protéines intervenant dans le métabolisme énergétique chez H. meleagridis : une enzyme malique, la sous-unité alpha de la succinyl coenzyme A synthétase et une hydrogénase à fer. Ces trois protéines sont localisées dans des organites particuliers à double membrane, produisant de l'énergie sous forme d'ATP, appelés hydrogénosomes. Une partie du travail a porté sur le suivi d'élevages de dindes pour surveiller l'apparition éventuelle d'histomonose et sur la réalisation de tests anti-parasitaire à base de produits naturels

Reproduction de : Thèse doctorat : Pharmacie. Paléoparasitologie : Université de Reims : 2005. / Bibliogr. p.194-231. Index.

Les protozoaires du genre Leishmania sont responsables de différentes pathologies présentant des taux importants de morbidité et de mortalité à travers le monde. En l'absence de vaccin efficace, le contrôle de ces infections repose sur l'utilisation d'agents chimiothérapeutiques. Ce parasite étant dépourvu de promoteurs classiques, la régulation génique repose essentiellement sur des mécanismes post-transcriptionnels, ce qui rend l'étude des protéines primordiale. Toutefois, les protéines peu abondantes sont souvent sous-représentées avec les méthodes protéomiques classiques et le fractionnement protéique est donc à privilégier. L'étude des protéines exprimées de manière préférentielle chez l'un des deux stades de vie, soit les promastigotes présents chez l'insecte-vecteur et les amastigotes présents dans les macrophages de l'hôte mammifère infecté, peut mener à l'élaboration de vaccins et/ou de nouveaux traitements. Il est également essentiel de mieux caractériser les mécanismes de résistance aux médicaments actuels. Les objectifs de cette thèse étaient i) de mieux caractériser le protéome des deux stades de vie du parasite en étudiant les protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire par la mise au point de méthodes protéomiques innovantes et ii) d'étudier les mécanismes de résistance de Leishmania à l'antimoine trivalent et l'amphotéricine B par protéomique quantitative et par séquençage à haut débit du génome complet. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont permis l'élaboration de méthodes de fractionnement protéique permettant une meilleure représentation des protéines peu abondantes chez Leishmania. Les analyses protéomiques subséquentes des protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire ont permis l'identification de nombreuses protéines impliquées dans la différenciation entre les deux formes de vie du parasite. Des études de protéomique quantitative ont également permis de découvrir des protéines impliquées dans la résistance à l'antimoine trivalent et à l'amphotéricine B. De plus, l'aneuploïdie a également été impliquée dans la résistance à ces deux molécules. La formation d'amplicons circulaires extrachromosomiques a été observée en lien avec la résistance à l'antimoine trivalent. Finalement, deux nouvelles mutations ponctuelles ont été impliquées dans la résistance aux médicaments chez Leishmania, soit LinJ.33.1810-E629K dans le cas de l'antimoine trivalent et LinJ.13.1590-G433S dans le cas de l'amphotéricine B.

Chez la paramécie, l'épiplasme se présente sous forme d'écailles indépendantes disposées autour de chaque appareil ciliaire et composées d'une multitude de protéines appelées épiplasmines. Dans une première partie, nous avons contribué à l'annotation du génome macronucléaire de Paramecium tetraurelia à partir de la séquence de 2 épiplasmines (EPI-1 et EPI-2) et identifié 39 gènes supplémentaires. L'analyse des séquences indique que la signature de cette nouvelle famille est un domaine de 79 acides aminés. L'expression de l'épiplasmine 1 couplée à la GFP confirme la localisation de cette protéine au niveau des écailles épiplasmiques. La deuxième partie porte sur l'analyse fonctionnelle d'épiplasmines à partir d'une approche ARN interférence. Nous avons obtenu un phénotype caractérisé par un blocage répété de la cytocinèse conduisant à des organimes monstrueux qui sont finalement lysés après 72 h d'induction. L'analyse en microscopie à fluorescence a révélé l'absence de sillon de division.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.

Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la jonction mobile contrôlant l'invasion de la cellule hôte par Toxoplasma gondii. Les apicomplexes sont des parasites eucaryotes responsables d'infections humaines et animales, dont le paludisme et la toxoplasmose. La plupart sont des parasites intracellulaires obligatoires ; l'entrée dans la cellule hôte est donc un évènement crucial dans leur cycle de développement. Ce processus, conservé au sein du phylum, implique la sécrétion séquentielle du contenu de deux organites : les micronèmes et les rhoptries. Lors de l'invasion, le parasite établit un contact étroit entre son extrêmité apicale et la membrane plasmique de la cellule hôte, appelé la jonction mobile (JM). La JM est un point d'ancrage à la cellule hôte qui est initié chez Toxoplasma par la sécrétion de protéines du col des rhoptries appelées TgRON2/RON4/RON5/RON8 (complexe de RONs). Ces protéines sont sécrétées dans la cellule hôte et TgRON2 est insérée dans la membrane de la cellule hôte. TgRON2 peut servir de récepteur à la protéine TgAMA1 (Apical Membrane Antigen 1) qui est une protéine de micronèmes sécrétée à la surface du parasite durant l'invasion. L'interaction AMA1-RON2 est également conservée chez Plasmodium, mais il n'existe pas de réactivité croisée entre espèces d'apicomplexes. La résolution de la structure de la protéine recombinante TgAMA1 en complexe avec un peptide TgRON2 nous a permis de déterminer des résidus critiques à l'interaction entre ces deux protéines in vitro et à l'invasion du parasite in vivo, et de définir les bases structurales de la spécificité intra-espèce de l'interaction AMA1-RON2. Par l'obtention d'une souche dépourvue de TgAMA1, nous montrons qu'AMA1 n'est pas essentielle à la survie du toxoplasme, comme il avait été supposé depuis longtemps. Nous confirmons le rôle clé de cette protéine dans l'invasion et la formation de la JM. Les mutants dépourvus d'AMA1 sont capables d'insérer le complexe de RONs dans la cellule hôte mais se détachent plus fréquemment, entrainant des invasions abortives. L'invasion résiduelle observée en absence d'AMA1 pourrait impliquer des protéines homologues à TgAMA1, TgRON2 et TgRON4, dont nous avons entamé la caractérisation moléculaire et fonctionnelle.Mot-clés : Apicomplexes, Toxoplasma gondii, invasion, jonction mobile, micronèmes, rhoptries / Molecular and functional characterisation of the moving junction controlling host cell invasion by Toxoplasma gondiiAbstract:Apicomplexa are eukaryotic parasites responsible for a variety of human and animal diseases, including malaria or toxoplasmosis. Most of them have an obligatory intracellular stage; thus, the invasive process is a crucial step in their developmental cycle. It implies the sequential secretion of two organelles: micronemes and rhoptries. During invasion, the parasite establishes a structure called the moving junction (MJ), which is a close apposition between the apical end and the plasma membrane of host cell. The MJ is an anchoring point for invasion that is initiated in Toxoplasma by the secretion of rhoptry neck proteins named TgRON2/RON4/RON5/RON8 (the RONs complex). These proteins are exported to the host cell cytoplasm and TgRON2 spans the host cell membrane. There, TgRON2 will function as a receptor to Apical Membrane antigen 1 (TgAMA1), which is a micronemal protein displayed on the surface of the parasite during the invasion process. The AMA1-RON2 interaction is conserved in Plasmodium but there is no interspecies cross-binding.We have determined the structure of a TgAMA1 recombinant protein in complex with a TgRON2 peptide, which allowed us to determine which residues are critical for the interaction between both proteins in vitro and for parasite invasion in vivo. Moreover, the co-structure explains at the structural level the evolutionary constraint of the AMA1-RON2 interaction. By generating an AMA1 null strain in T. gondii, we demonstrate that TgAMA1 is not an essential gene, as claimed before. We confirm the importance of AMA1 in invasion and its key role in MJ formation. AMA1 null parasites insert the RON complex into the host cell but are more frequently detached from it, causing abortive invasions. The residual invasion might involve proteins homologous to TgAMA1, TgRON2 and TgRON4, for which the molecular and functional characterization is undertaken.Keywords: Apicomplexes, Toxoplasma gondii, invasion, moving junction, micronemes, rhoptries

Thesis--Catholic Univ. of America. / Includes bibliographical references (p. 70-73).

L’augmentation des interactions entre humains et animaux sauvages en lisière des habitats naturels pourrait faciliter la transmission d’agents pathogènes entre les humains et les différentes espèces animales d’un écosystème et ainsi favoriser l’émergence de maladies. Nous avons effectué une étude transversale portant sur l’infection par Giardia et Cryptosporidium chez les humains, les animaux domestiques, les rongeurs et les lémuriens au sein de l’écosystème de Ranomafana, Madagascar. Des échantillons de fèces ont étés collectés de manière non invasive chez des personnes volontaires, des mammifères domestiques et des rongeurs introduits habitant trois villages situés en lisière du Parc National de Ranomafana (PNR) ainsi que quatre espèces de lémuriens (Propithecus edwardsii, Prolemur simus, Eulemur rubriventer et Microcebus rufus) du PNR. Des analyses coproscopiques par la technique d’immunofluorescence directe ont été réalisées afin de détecter la présence de Cryptosporidium et Giardia. Leur prévalence a été estimée et certaines variables reliées à l’infection par les parasites ont été identifiées. Cryptosporidium et Giardia ont été détectés avec une prévalence estimée à 22,9 % et 13,6 % respectivement chez les humains. La prévalence de ces deux parasites variait de 0 % à 60 % chez les animaux domestiques et les rongeurs au sein des villages. L’espèce hôte, l’âge ainsi que la co-infection par un autre protozoaire sont les seules variables associées à l’infection par Cryptosporidium et Giardia dans cet écosystème tandis qu’aucune association avec une coinfection par un ordre de nématode n’a été détecté. De plus, Cryptosporidium a été détecté chez 10,5 % des lémuriens du PNR. Cette étude documente pour la première fois la présence de Cryptosporidium chez deux espèces de lémuriens du PNR. Par contre, Giardia n’a pas été détecté dans les échantillons issus de lémuriens du PNR. / Increasing human activities in the vicinities of natural habitats may facilitate the emergence and transmission of diseases between humans and domestic animals and wildlife species. We conducted a cross-sectional study investigating the prevalence of Giardia and Cryptosporidium, two ubiquitous and potentially zoonotic protozoan parasites in various populations of humans and animals from the Ranomafana National Park ecosystem (RNP), Madagascar. Fecal samples were obtained non-invasively from human volunteers, domestic animals and introduced rodents inhabiting three villages in the vicinity of the national park and from four species of free-ranging lemurs (Propithecus edwardsi, Prolemur simus, Eulemur rubriventer and Microcebus rufus) from the RNP. Samples were analyzed using the direct immunofluorescence technique. Prevalences of Giardia and Cryptosporidium were estimated and variables associated with infections by the protozoa were identified. Cryptosporidium and Giardia were detected with a prevalence of 22.9 % and 13.6 % in humans respectively. The prevalences of these two parasites varied from 0 % to 60 % in domestic animals and introduced rodents from the villages. Species, age category and co-infection with the other protozoan were significantly associated with the infection by Cryptosporidium and Giardia in this ecosystem, whereas coinfections by different helminths order were not significantly associated with Cryptosporidium or Giardia. Moreover, Cryptosporidium was detected in 10.5 % of lemurs sampled from the RNP. This study reports for the first time the occurrence of Cryptosporidium in two species of lemurs from the RNP. Giardia was not detected in fecal samples from lemurs inhabiting the RNP.

La recherche de nouvelles molécules à activité antiparasitaire pour lutter contre les parasites responsables de maladies telles que le paludisme ou la trypanosomiase humaine africaine est un enjeu primordial car il n’existe pas de vaccin pour ces maladies qui peuvent être mortelles et qui touchent près de 1/6 de la population mondiale. Dans ce contexte, il a été observé au laboratoire que l’amélioration de l’activité des molécules sur une cible isolée ne se retrouvait pas toujours sur les parasites. Une faible entrée de la molécule dans la cellule pourrait être une des causes de ce manque de corrélation, comme cela est souvent le cas dans la recherche de molécules actives.Pour valider ou non cette cause, ces travaux de thèse ont eu pour but de concevoir, synthétiser et évaluer de nouvelles sondes fluorescentes qui permettraient de visualiser la pénétration de molécules actives dans des cellules, en nous intéressant en particulier aux parasites responsables de la maladie du sommeil et du paludisme.Notre concept se base sur le principe de la chimie « click », sans catalyseur, impliquant une fonction alcyne et un groupement azoture. Ceci est possible lorsque la fonctionalcyne est insérée dans un cycle tendu comme celui d’un cyclooctyne qui lui confère une plus grande réactivité (Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition).Nous avons synthétisé des dérivés de la dibenzocyclooctynone, une molécule fluorescente décrite pour réagir sans catalyseur avec des azotures, de manière à obtenir des sondes à détection « on-on’ ». Ainsi, sept nouvelles sondes fluorescentes ont été obtenues, dont trois réagissent avec des azotures avec une cinétique adéquate. Les propriétés photophysiques de ces molécules ont été caractérisées et nous avons vérifié qu’elles traversent bien la membrane des protozoaires parasites que nous étudions. La fluorescence n’est observée qu’à l’intérieur du parasite.La détection d’un azoture in cellulo a été vérifiée par HPLC- MS/MS avec une des sondes.Parmi les sept cyclooctynones obtenues, une sonde forme un adduit triazole fluorescent avec une cinétique acceptable, ce qui constitue le premier exemple de sonde « on-on’ » de cette série et une véritable avancée dans la chimie bio-orthogonale. / The discovery of new molecules with antiparasitic activity is crucial today to fight against infectious diseases such as malaria and HAT since no vaccine is available to cure these diseases. In our search for new antiparasitic compounds, we observed that activity improvement on an isolated target was not seen on parasite. We suspected an ineffective entry of the molecule into the cell to be one of the reasons for these uncorrelated results.To explore this possibility, this PhD work aimed to design, synthetize and evaluate new fluorescent probes that would allow the visualization of drug entry into parasites responsible for HAT and malaria.Our concept is based on “click” chemistry that can be achieved without catalyst, between an azide and a strained alkyne like cyclooctyne (Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition).We synthetized derivatives of dibenzocyclooctynone, a fluorescent molecule described to undergo SPAAC reaction with azides, in order to obtain “on-on’” detection probes. Seven new fluorescent probes were therefore synthetized, among which three of them displayed adequate SPAAC kinetics. Photophysical properties of these molecules were characterized and their penetration into protozoan cells was demonstrated. Fluorescence was only observed in the parasitic cytosol.In cellulo azide detection was achieved and verified by LC- MS/MS with one of our probes.One out of the seven probes formed a fluorescent triazole adduct, which constitutes the first example of an « on-on’ » probe for this series and a real progress in bioorthogonal chemistry.