Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-06Bitstream added on 2014-06-13T19:35:10Z : No. of bitstreams: 1 felipe_lm_me_jabo.pdf: 356871 bytes, checksum: 16d6d5f606db8c2a71fd32fc4c6570dc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A deterioração “blown pack” é caracterizada por abundante produção de gás, induzindo a completa distensão da embalagem durante o processo de estocagem sob refrigeração. Quando a embalagem é aberta, há um odor desagradável, levemente fecal. O gás presente na embalagem é composto por dióxido de carbono e hidrogênio e por vários tipos butíricos do metabolismo fermentativo. O objetivo deste experimento foi determinar possíveis causadores deste tipo de deterioração, quantificando as populações de bactérias da família Enterobacteriaceae, e caracterizando-as nos principais gêneros e espécies encontradas, o número de bactérias ácido-lácticas, a freqüência de Clostridium estertheticum e do Clostridium gasigenes, em carnes próprias para o consumo e em carnes que apresentaram a deterioração “blown pack”. Para contagem e identificação dos membros da família Enterobacteriaceae e contagem de bactérias ácido-lácticas utilizou-se de técnicas microbiológicas clássicas. Já para pesquisa do C. estertheticum e C. gasigenes fez-se uso de técnicas de biologia molecular. Os microrganismos da família Enterobacteriaceae e bactérias ácido-láticas estavam presentes em populações elevadas e em maior número nas carnes com deterioração “blown pack”. A espécie mais freqüentemente encontrada foi a Hafnia alvei. As amostras com deterioração “blown pack’ apresentaram maior positividade para o C. estertethicum que amostras não deterioradas. Não houve diferença estatística de positividade para a presença do C. gasigenes entre amostras com deterioração “blown pack” e carnes não deterioradas. A principal forma de controle desta deterioração é a prevenção da contaminação da carne por material fecal. / The blown pack spoilage is characterised by abundant gas production, leading to complete gross distention pack during refrigerated storage. When the packaging is opened, there is an unpleasant smell, lightly fecal. The gas present in the package is composed of carbon dioxide and hydrogen and also of several butyric types of metabolism fermentation. The purpose of this experiment was to determine possible causes of this spoilage type, quantifying the populations of bacteria of the family Enterobacteriaceae, and characterizing them in the major genera and species found, the number of lactic acid bacteria, the frequency of Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes in meat proper for consumption and meat which showed the blown pack spoilage. In order to enumerate and identify the members of the Enterobacteriaceae family, and to enumerate the lactic acid bacteria the procedure was classical microbiological techniques. However to search the C. estertheticum and C. gasigenes the procedure was molecular biology techniques. The microorganisms of the family Enterobacteriaceae and lactic acid bacteria were present in large populations and in greater numbers in meat with blown pack spoilage. The species which were found more often was the Hafnia alvei. Samples of blown pack“ spoilage had greater positive features for C. estertethicum than samples not damaged. There was no statistical difference of positive features for the presence of C. gasigenes between samples of blown pack spoilage and not damaged meat. The main way to control this spoilage is the prevention of contamination of meat by fecal material.

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Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Cette thèse porte sur deux aspects complémentaires, le développement et l’implémentation de nouvelles approches de cristallisation et de cristallographie sérielle ainsi que leur mise en œuvre dans l’étude structurale de complexes enzymes : ARNt. La cristallographie est la méthode la plus employée en biologie structurale, mais elle présente encore des points délicats. Plusieurs méthodes avancées ont été déployées dans ce travail pour y pallier qui ont conduit à la résolution de la structure de l’ARNt nucléotidyltransférase du psychrophile Planococcus halocryophilus et à l’étude de son adaptation structurale au froid ; des puces microfluidiques de cristallisation qui ont servi à la résolution de plusieurs structures à température ambiante par cristallographie sérielle ; enfin le Xtal Controller utilisé pour l’étude d’évènements de nucléation et de croissance cristalline dans un but de préparation d’échantillons pour analyse sous rayonnement XFEL. Entre autres systèmes biologiques, cette thèse présente la caractérisation de deux familles d’inhibiteurs visant les aspartyl-ARNt synthétases, notamment du pathogène Pseudomonas aeruginosa. / This thesis focuses on two complementary aspects, the development and implementation of new approaches of crystallization and of serial crystallography as well as their use in the structural study of enzymes/tRNA complexes. Crystallography is the most used method in structural biology, but it presents delicate points. Different methods were implemented in this work to overcome these points, which led to the resolution of the structure of the CCA-adding enzyme of the psychrophilic organism Planococcus halocryophilus and to the study of its structural adaptation to the cold; novel microfluidic crystallization chips that have been used for the resolution of several structures by serial crystallography at room-temperature; finally the Xtal Controller used for the study of nucleation and crystal growth events with the purpose of preparing samples for analysis under XFEL radiation. Among other biological systems, this thesis presents the study and characterization of two families of inhibitors targeting aspartyl-tRNA synthetases, including the one of the pathogenic organism Pseudomonas aeruginosa.

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