Thesis (M.S.)--University of Delaware, 2009. / Principal faculty advisors: Thomas M. Church and Thomas E. Hanson, College of Earth, Ocean & Environment. Includes bibliographical references.

El sistema de centrifugación bifásico para la extracción del aceite de oliva, genera un único subproducto denominado alperujo que, debido a sus características fisicoquímicas se convierte en un desecho poco amigable para el medio ambiente. El sudoeste de la provincia de Buenos Aires (SOB) constituye una nueva área de producción olivícola, con importante intensificación de la actividad, que impulsa la necesidad de analizar opciones para su reutilización. En esta Tesis se plantea la reconversión del alperujo, como sustrato de bajo costo para la producción de pigmentos carotenoides. Para tal fin, se evaluaron levaduras del género Rhodotorula (Rh. mucilaginosa LPSC 638, Rh. graminis Y52 y Rh glutinis Y54). En primer lugar, se prepararon y caracterizaron diferentes medios derivados del alperujo: Extractos acuosos (EAs) de diferentes concentraciones (5, 10, 20 y 30 % p/V) y la fracción líquida del alperujo (AA). Por otra parte, se desfenolizaron los medios con mayor concentración de biofenoles (EA 30% y AA), mediante la técnica partición líquido-líquido. Todos estos medios, se utilizaron para evaluar el desarrollo y la biosíntesis de carotenoides en Rh. mucilaginosa LPSC638. Asimismo, se evaluó la influencia del inhibidor Imidazol en su vía carotenogénica. También, se estudió el metabolismo de la levadura asociado a fuentes de C y N. Al mismo tiempo, se realizaron ensayos de fitotoxicidad en EAs y AA normales y desfenolizados, sobre semillas de Lactuca sativa L. En segundo lugar, se analizó al alperujo en conjunto con el bagazo de cebada (BSG), como medios de cultivo sólidos. Finalmente, se analizó la estrategia de acoplar la producción de carotenoides con la recuperación de biofenoles desde el alperujo. Para ello, se utilizó como medio de cultivo, la fracción líquida del alperujo tratado hidrotermalmente (Sevilla, España. Patent No. US 6,849,770 B2 , 2005), para analizar el desarrollo y producción de carotenoides en Rh. mucilaginosa LPSC 638 y dos especies aisladas desde residuos olivícolas (Rh. graminis Y52 y Rh glutinis Y54). Los resultados obtenidos fueron: Capítulo 1. Los EAs y AA ofrecen fuentes de C y N, además de un rango de pH adecuado para el desarrollo de Rh. mucilaginosa LPSC 638. La técnica de desfenolización utilizada redujo el 45% y 30% de biofenoles en EAs y AA, respectivamente. Capítulo 2: La levadura se desarrolló y sintetizó carotenoides en todas las concentraciones de EAs y AA. Metabolizó azúcares presentes y no consumió biofenoles. Los carotenoides sintetizados fueron: toruleno, torularodina, β-caroteno y γ-caroteno. Capítulo 3: La presencia de imidazol no afectó el desarrollo de Rh. mucilaginosa LPSC 638. Se obtuvo la mayor cantidad del caroteno en el medio con mayor concentración de imidazol (1000 ppm). Esta cantidad fue muy inferior respecto a la reportada en bibliografía. Capítulo 4: Rh. mucilaginosa LPSC 638 pudo desarrollarse en medios sólidos, formados por alperujo, BSG y combinación. Los carotenoides sintetizados fueron: toruleno, torularodina y β-caroteno. Capítulo 5: La fitotoxicidad sobre semillas de Lactuca sativa L., se reduce en tratamientos con medios desfenolizados y después del desarrollo de la levadura. No hay efectos fitotóxicos cuando las semillas son tratadas con medios más diluídos (EAs de 5 % y 10%). Capítulo 6: El proceso de desfenolización favorece el desarrollo y síntesis de carotenoides en Rh. mucilaginosa LPSC 638. En el AA tratado hidrotermalmente, Rh. glutinis Y54, Rh. graminis Y52 y Rh. mucilaginosa LPSC 638 producen: torularodina, toruleno, β-caroteno y γ-caroteno. Rh. glutinis Y54 y Rh. graminis Y52, se desarrollaron mejor con respecto a Rh. mucilaginosa LPSC 638. La técnica favorece la recuperación del hidroxitirosol. / The two-phase centrifugation system for extracting olive oil generates a single by- product called alperujo. Due to its physicochemical characteristics, alperujo is a non- ecological waste. The southwest of Buenos Aires province (SOB) constitutes a new area of olive oil production, with a significant intensification of the activity, which drives the need to analyze options for its reuse. This thesis proposes the reconversion of alperujo as a low-cost substrate for producing carotenoid pigments. For this purpose, yeasts of the genus Rhodotorula (Rh. mucilaginosa LPSC 638, Rh. graminis Y52 and Rh. glutinis Y54) were evaluated. First, different alperujo-derived media were prepared and characterized: aqueous extracts (AE) of different concentrations (5, 10, 20 and 30 % w/V) and the liquid fraction of alperujo (AA). On the other hand, the media with the highest concentration of biophenols (EA 30% and AA) were dephenolized using the liquid-liquid partitioning technique. All these media were used to evaluate the development and biosynthesis of carotenoids in Rh. mucilaginosa LPSC 638. The influence of the inhibitor Imidazole on the carotenogenic pathway was also evaluated. Also, yeast metabolism associated with different C and N sources was studied. At the same time, phytotoxicity tests were performed on normal and dephenolized AE and AA on seeds of Lactuca sativa L. Secondly, alperujo was analyzed together with beer spent grain (BSG) as solid culture media. Finally, the strategy of coupling carotenoid production with biophenol recovery from alperujo was analyzed. For this purpose, the liquid fraction of hydrothermally treated alperujo (Sevilla, España. Patent No. US 6,849,770 B2, 2005), was used as a culture medium to analyze the development and production of carotenoids in Rh. mucilaginosa LPSC 638 and two species isolated from olive residues (Rh. graminis Y52 and Rh. glutinis Y54). The results obtained in each chapter were: Chapter 1. EAs and AA provide sources of C and N, as well as a suitable pH for the development of Rh. mucilaginosa LPSC 638. The dephenolization technique used reduced 45% and 30% of biophenols in EAs and AA, respectively. Chapter 2: The yeast developed and synthesized carotenoids at all concentrations of EAs and AA. It metabolized the sugars present and did not consume biophenols. The carotenoids synthesized were: torulene, torularhodin β-carotene and γ-carotene. Lycopene was found only when media contained the inhibitor imidazole. Chapter 3: The presence of imidazole did not affect the development of Rh. mucilaginosa LPSC 638. The highest amount of carotene was obtained in the medium with the highest concentration of imidazole (1000 ppm). This amount was lower than that reported in literature. Chapter 4: Rh. mucilaginosa LPSC638 can grow on solid media, consisting of alperujo, BSG and a combination of both. The carotenoids synthesized were: torulene, torularodine and β-carotene. Chapter 5: Phytotoxicity on Lactuca sativa L. seeds is reduced in treatments with dephenolized media and after yeast development. There are no phytotoxic effects when seeds are treated with more diluted media (5 % and 10 % EAs). Chapter 6: The dephenolization process favors the development and synthesis of carotenoids in Rh. mucilaginosa LPSC 638. In the dephenolized liquid fraction of hydrothermally treated alperujo, Rh. glutinis Y54, Rh. graminis Y52 and Rh. mucilaginosa LPSC 638 produce: torularhodin, torulene, β-carotene and γ-carotene. Rh. glutinis Y54 and Rh. graminis Y52 performed better than Rh. mucilaginosa LPSC 638. The technique facilitates the recovery of Hydroxytyrosol.

Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2800985 bytes, checksum: 40fca2e6fae55c6c55dc0ea1697df826 (MD5) Previous issue date: 2013-10-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In pigmented microorganisms, carotenoids are pigments, precursors of vitamin A that provide protective effects against oxidative damage. Extrinsic environmental factors such as temperature, specific carbon sources and inducers of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and light associated with physiological conditions (maximum exponential growth phase, early and late stationary phase) influence the accumulation of carotenoids in microbial cells. A pigmented yeast was isolated from an orchard in Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The main aims were to identify the isolated yeast and analyze the influence of environmental (light, temperature and arabinose) and physiological conditions (log phase, early and late stationary phase) on the production of carotenoids and the growth rate of the yeast. The taxonomical identification of the yeast strain was accomplished through analysis of 5.8S and 26S rRNA by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) and biochemical and molecular approaches. The yeast was identified as Rhodotorula mucilaginosa. In order to analyze the influence of factors on production of carotenoids and growth rate we used a methodology of response surface (RSM), and a central composite factorial design (CCD) with three factors and six replicates of central point was applied. The 20 experiments were done in batch in 91h and samples were collected at different physiological stages of the culture, at maximum growth rate (log phase), at deceleration growth phase (2h initial at the entrance of the stationary phase) and at stationary phase (60h after reaching the maximum cell mass). It implicates that carotenogenesis is not associated with cellular growth. The maximum carotenoid yield per cell mass (&#956;g/g) occurred at deceleration growth phase. The growth rate (&#956;) and total carotenoid yield (&#956;g/g) calculations well- adjusted to the mathematical model, with R2 of 0.96 and 0.91, respectively, and the lack of fit was not significant (p>0.05). The levels of light (&#956;mol m-2s-1), arabinose (%w/v) and temperature (°C) that created a maximum answer of total carotenoid yield (93.92 &#956;g/g) were 100 &#956;mol m-2s-1; 5% and 18 °C and growth rate (0.31h-1) were 63.6 &#956;mol m-2s-1; 3.7% and 24.6 °C. / Em micro-organismos produtores, carotenoides são pigmentos, precursores de vitamina A, que os protegem contra o estresse oxidativo. Fatores ambientais extrínsecos tais como temperatura, fontes específicas de carbono e indutores de espécies reativas de oxigênio (ROS) como luz e peróxido de hidrogênio associados a condições fisiológicas (fase de crescimento exponencial máxima, fase estacionária inicial e tardia) influenciam no acúmulo de carotenoides pelas células microbianas. Uma levedura pigmentada foi isolada do horto da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Os objetivos desse trabalho foram identificar esta levedura isolada no horto da UFV e analisar a influência dos fatores ambientais (temperatura, intensidade de luz e concentração de arabinose) e das diferentes condições fisiológicas (fase log, estacionária inicial e tardia) na produção de carotenoides e na velocidade de crescimento da levedura. A identificação taxonômica da levedura foi feita pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) por meio das análises das sequências 5,8S e 26S do rRNA e por ferramentas moleculares e bioquímicas, resultando na identificação da espécie como Rhodotorula mucilaginosa. A influência das condições ambientais e fisiológicas na produção de carotenoides e na taxa de crescimento foi verificada pela metodologia de superfície de resposta (RSM) por meio de um delineamento composto central (CCD) com três fatores e seis replicatas do ponto central. Os 20 experimentos foram feitos em 91h de batelada e as amostras foram coletadas em diferentes estados fisiológicos da cultura, isto é na fase de crescimento máximo (fase log), fase de desaceleração do crescimento (2h iniciais na entrada da fase estacionária) e fase estacionária (60h após alcançar a massa celular máxima). Demonstrou-se que a formação de carotenoides pela levedura não é associada ao crescimento. O rendimento máximo de carotenoides por massa celular (&#956;g/g) ocorreu na fase de desaceleração do crescimento. A velocidade específica máxima de crescimento (&#956;max) e o rendimento em carotenóide total por massa celular (&#956;g/g) foram ajustados ao modelo matemático, com R2 de 0,96 e 0,91 respectivamente, e o desajuste não foi significante (p>0,05). Os níveis de intensidade de luz (&#956;mol m-2s-1), arabinose (%p/v) e temperatura (°C) que criaram a resposta máxima de rendimento de carotenóides totais (93,92 &#956;g/g) foram 100 &#956;mol m-2s-1; 5%; 18 °C e da velocidade de crescimento (0,31h-1) foram 63,6 &#956;mol m-2s-1; 3,7% e 24,6 °C.

Das MMS stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung großwüchsiger Hunde dar. Die ansteigenden Inzidenzzahlen der letzten Jahre, die ungeklärte Ätiologie sowie die hohe Mortalitätsrate rechtfertigen weitere Untersuchungen zu diesem Krankheitskomplex. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit Mageninhalte (30 Tiere mit MMS / 13 Kontrolltiere) und Blutproben (102 Tiere mit MMS / 116 Kontrolltiere) mikrobiologisch, biochemisch (kurz-kettige Fettsäuren, Amylase, Lipase, Laktat, pH) und immunologisch (BotNt, CRP, Gesamt-immunglobuline, IgA-, IgG- und IgM-Spiegel ausgewählter mikrobieller Antigene) untersucht. Die Untersuchung des Mageninhaltes der Tiere mit MMS erbrachte signifikant gesteigerte Nachweishäufigkeiten für Hefen, hier v.a. von Rhodotorula mucilaginosa. Des Weiteren konnten in der Gruppe der Tiere mit MMS signifikant gesteigerte pH-Werte sowie signifikant erhöhte Mengen an Acetat, Butyrat und Gesamtfettsäuren im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt werden. Die gesteigerte bakterielle Fermentation, die ursächlich mit der Entstehung des MMS zusammenhängen dürfte, ist vermutlich auf ein gesteigertes Vorkommen gasbildender Kokken zurückzuführen. Ein Einfluss von Clostridium perfringens an der Entstehung des MMS lässt sich anhand der ermittelten bakteriologischen Ergebnisse nicht belegen. BotNt haben nach den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten keinen Einfluss auf die Entstehung des MMS. Serologisch konnten in der Gruppe der Tiere mit MMS signifikant erhöhte CRP-Spiegel gemessen werden. Das CRP ließ aber keine prognostische Aussage über die Überlebenschancen der Tiere zu. Der erhöhte Gesamtimmunglobulin A-Spiegel, bei signifikant erniedrigtem Gesamtimmunglobulin G-Titer weist auf eine vermehrte Auseinandersetzung mit Antigenen hin, die über die geschädigten Schleimhäute eindringen können. Während der Serumlaktatspiegel eine prognostische Aussage über das Outcome der Tiere erlaubt, erscheint eine Bestimmung der Amylase und Lipase beim MMS nicht sinnvoll. Über einen Fragebogen konnte ein gesteigertes Risiko mit zunehmendem Alter, steigender Futtermenge pro Mahlzeit und niedriger Fütterungsfrequenz ermittelt werden. Eine gesteigerte Freßgeschwindigkeit übt einen tendenziellen Einfluss auf die Ausbildung des MMS aus. Keinen Einfluss dahingegen haben das Geschlecht und der Charakter der Tiere, bestehende gastrointestinale Störungen sowie vorangegangene Antibiotikumgaben.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-03-30T19:00:59Z No. of bitstreams: 1 DissTBO.pdf: 1573981 bytes, checksum: e4e97b3faf18cb39cb38dffdf87ccfc6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-17T19:48:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTBO.pdf: 1573981 bytes, checksum: e4e97b3faf18cb39cb38dffdf87ccfc6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-17T19:49:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTBO.pdf: 1573981 bytes, checksum: e4e97b3faf18cb39cb38dffdf87ccfc6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T20:04:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissTBO.pdf: 1573981 bytes, checksum: e4e97b3faf18cb39cb38dffdf87ccfc6 (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Não recebi financiamento / Microorganisms Plant Growth Promoters (MPCV) have the ability to produce compounds which stimulate plant growth by different mechanisms, such as the production of plant hormones and solubilization of minerals. Considering these aspects, this study aimed to evaluate the potential of yeast strains as plant growth promoters by producing indole acetic acid (IAA) and phosphate solubilization, and its inoculation of tomato seedlings. Six yeast strains were evaluated belonging to bank microorganisms Agricultural Microbiology and Molecular Laboratory (LAMAM - CCA, UFSCar). For the evaluation of IAA production by isolates the colorimetric method was used, modified DiMenna (1957); for quantification of tricalcium phosphate solubilization was used to colorimetric method of molybdenum blue. The test with tomato seedlings was conducted in a greenhouse with different cell concentrations of T. globosa (5S55) and with or without addition of glucose and tryptophan. The results showed that isolates of T. globosa and Rh. mucilaginosa produced IAA in the presence of tryptophan; the isolates of T. globosa and M. guilliermondii solubilized inorganic phosphate in a liquid medium. The isolate T. globosa (5S55) promoted the growth of tomato seedlings, with significant increases in the length of shoot and root. In conclusion, the isolates of T. globosa, Rh. mucilaginosa and M. guilliermondii have the potential for improving plant production by IAA production and / or phosphate solubilization; the yeast T. globosa (5S55) was shown to promote growth of tomato plants. / Micro-organismos Promotores de Crescimento Vegetal (MPCV) apresentam a habilidade de produzir compostos que estimulam o desenvolvimento das plantas por meio de diferentes mecanismos, como a produção de hormônios vegetais e a solubilização de minerais. Considerando estes aspectos, este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de linhagens de leveduras como promotoras de crescimento vegetal, através da avaliação in vitro da produção de ácido indolacético e solubilização de fosfato, e da avaliação in vivo através da inoculação da linhagem com melhores resultados em mudas de tomate. Foram avaliadas seis linhagens de levedura pertencentes ao banco de micro-organismos do Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular (LAMAM - CCA, UFSCar). Para a avaliação da produção de AIA pelos isolados foi utilizada a metodologia colorimétrica, modificada de diMenna (1957); para quantificação da solubilização de fosfato tricálcico foi utilizada o método colorimétrico do azul de molibdênio. O ensaio com mudas de tomate foi realizado em casa de vegetação com diferentes concentrações de células de T. globosa (5S55), e com adição ou não de glicose e triptofano. Os resultados mostraram que os isolados de T. globosa e o isolado de Rhodotorula mucilaginosa produziram AIA na presença de triptofano; os isolados de T. globosa e o isolado de Meyerozyma guilliermondii solubilizaram fosfato inorgânico em meio líquido. A levedura T. globosa (5S55) promoveu o crescimento das mudas de tomate, com aumentos significativos no comprimento da parte aérea e raiz. Conclui-se que os isolados de T. globosa, Rh. mucilaginosa e M. guilliermondii apresentam potencial para a melhoria da produção vegetal através da produção de AIA e/ou solubilização de fosfato; a levedura T. globosa, isolado 5S55, mostrou ser capaz de promover o crescimento de mudas de tomate.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2018-04-11T14:25:22Z No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2018-04-23T20:27:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T20:27:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Suellen Emilliany Feitosa Machado.pdf: 24739108 bytes, checksum: 438a71a15a2d959f1a98b9e35d78fdb3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Proteases are essential constituents of all living beings, since they are involved in essential biological processes such as blood clotting, cell death, tissue differentiation, protein transport across the membrane etc. They also have important biotechnological applicability, because they can be used in food processing, manufacture of detergents, leather processing, meat softening, drug formulation, in the textile industry etc. These enzymes represents about 60% of the global market for industrial enzymes; so, they are considered an important group of enzymes. This work was divided into two stages and aimed to isolate filamentous fungi collected from coconut trees and soil from a coconut located in Varzeas de Sousa, Paraiba, Brazil and do a screening for the production of proteases and to evaluate, in a bioreactor, the production of proteases by the yeast Rhodotorula mucilaginosa L07. In all, 32 fungi were isolated in Paraiba semiarid. They were grown in rotary shaker and sent to the analysis of proteolytic activity. The specie, originally called Fung1, showed better results in the qualitative stage and was taken to the molecular identification and selected for production in rotary shaker (30°C / 200rpm / 240h). R. mucilaginosa L07, originally from Antarctica, was cultivated in a bioreactor (25°C / 72h), varying agitation and aeration. The maximum enzyme activity by the Fung1, identified as Aspergillus tubingensis, was 29 U.mL^-1, after 144h cultivation. This fungus is not a fumonisin B2 and ochratoxin A producer. The greatest value of proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 was 124.88 U.mL^-1 with agitation of 500rpm and aeration 1,0vvm. The results indicated that A. tubingensis produces proteases, but other studies are needed to optimize production and classify proteases. The supply of oxygen to R. mucilaginosa L07 were positive for proteolytic activity, because it increased from 33.36 to 124.88 U.mL^-1 in rotary shaker and bioreactor, respectively. / Proteases são constituintes essenciais em todos os seres vivos, pois estão envolvidas em processos biológicos essenciais como coagulação sanguínea, morte celular, diferenciação de tecidos, transporte de proteínas através da membrana etc. Também possuem importante aplicabilidade biotecnológica, pois podem ser usadas no processamento de alimentos, formulação de detergentes, processamento de couro, amaciamento de carnes, formulação de medicamentos, na indústria têxtil etc. Por representarem aproximadamente 60% do mercado mundial de enzimas industriais, são consideradas um importante grupo de enzimas. Este trabalho foi dividido em duas etapas e objetivou isolar fungos filamentosos coletados em coqueiros e solo de um coqueiral localizado nas Várzeas de Sousa, Paraíba, Brasil e fazer um screening quanto à produção de proteases, além de avaliar, em biorreator, a produção de proteases pela levedura Rhodotorula mucilaginosa L07. Ao todo, 32 fungos foram isolados no semiárido paraibano, cultivados em agitador rotatório e encaminhados à análise da atividade proteolítica. A espécie inicialmente denominada Fung1 apresentou melhor resultado na etapa qualitativa, foi encaminhada à identificação molecular e selecionada para a produção em agitador rotatório (30°C/ 200rpm/ 240h). A R. mucilaginosa L07, coletadada na Antártida, foi cultivada em biorreator (25°C/ 72h), variando agitação e aeração. A atividade enzimática máxima do Fung1, identificado como Aspergillus tubingensis, foi 29 U.mL , após 144h de cultivo. Este fungo não é produtor de fumonisina B2 e ocratoxina A. O maior valor de atividade proteolítica da R. mucilaginosa L07 foi de 124,88 U.mL^-1 , com agitação de 500rpm e aeração de 1,0vvm. Os resultados indicaram que A. tubingensis produz proteases, porém outros estudos são necessários para otimizar a produção e classificar as proteases. O fornecimento de oxigênio em cultivos da R. mucilaginosa L07 foi positivo para a atividade proteolítica, pois a mesma aumentou de 33,36 para 124,88 U.mL^-1, em agitador rotatório e biorreator, respectivamente.

This diploma thesis is focused on controlled production of lipolytic enzymes, bioactive substances and lipids by carotenogenic yeasts. Theoretical part deals with characterization of lipolytic enzymes, carotenoids, lipids and their properties, possibility of production and application. In experimental part the enzymes, carotenoids and lipids were produced by red yeasts Rhodotorula mucilaginosa, Cystofilobasidium macerans and Sporidiobolus salmonicolor by submerged cultivation in mineral medium with different additions: glucose, glycerol, fat, fat with glucose, fat with polysorbate 80, fat with glycerol, fat with polyethylene glycol, fat with higher and lower addition of palmitic acid, enzymatic fat hydrolysate, acidic hydrolysate a basic hydrolysate. The activity of extracellular lipase was monitored in medium after 96-hour cultivation. Concentration of -carotene, total carotenoids, ergosterol and ubiquinone was determined by HPLC, concentration of fatty acids and amount of fat by GC. Production had differed depending on used yeasts and substrate. As the best producer of carotenoids Cystofilobasidium macerans was found, ergosterol was highly produced by Sporidiobolus salmonicolor. The production of ubiquinone was almost equivalent in all yeasts and lipolytic activity was the highest in Sporidiobolus salmonicolor. The patricular medium sample with high lipolytic activity was further separated and analysed by ultrafiltration and PAGE-SDS electrophoresis. This diploma thesis was done within the international project ,,LipoFungi“.

Das MMS stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung großwüchsiger Hunde dar. Die ansteigenden Inzidenzzahlen der letzten Jahre, die ungeklärte Ätiologie sowie die hohe Mortalitätsrate rechtfertigen weitere Untersuchungen zu diesem Krankheitskomplex. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit Mageninhalte (30 Tiere mit MMS / 13 Kontrolltiere) und Blutproben (102 Tiere mit MMS / 116 Kontrolltiere) mikrobiologisch, biochemisch (kurz-kettige Fettsäuren, Amylase, Lipase, Laktat, pH) und immunologisch (BotNt, CRP, Gesamt-immunglobuline, IgA-, IgG- und IgM-Spiegel ausgewählter mikrobieller Antigene) untersucht. Die Untersuchung des Mageninhaltes der Tiere mit MMS erbrachte signifikant gesteigerte Nachweishäufigkeiten für Hefen, hier v.a. von Rhodotorula mucilaginosa. Des Weiteren konnten in der Gruppe der Tiere mit MMS signifikant gesteigerte pH-Werte sowie signifikant erhöhte Mengen an Acetat, Butyrat und Gesamtfettsäuren im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt werden. Die gesteigerte bakterielle Fermentation, die ursächlich mit der Entstehung des MMS zusammenhängen dürfte, ist vermutlich auf ein gesteigertes Vorkommen gasbildender Kokken zurückzuführen. Ein Einfluss von Clostridium perfringens an der Entstehung des MMS lässt sich anhand der ermittelten bakteriologischen Ergebnisse nicht belegen. BotNt haben nach den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten keinen Einfluss auf die Entstehung des MMS. Serologisch konnten in der Gruppe der Tiere mit MMS signifikant erhöhte CRP-Spiegel gemessen werden. Das CRP ließ aber keine prognostische Aussage über die Überlebenschancen der Tiere zu. Der erhöhte Gesamtimmunglobulin A-Spiegel, bei signifikant erniedrigtem Gesamtimmunglobulin G-Titer weist auf eine vermehrte Auseinandersetzung mit Antigenen hin, die über die geschädigten Schleimhäute eindringen können. Während der Serumlaktatspiegel eine prognostische Aussage über das Outcome der Tiere erlaubt, erscheint eine Bestimmung der Amylase und Lipase beim MMS nicht sinnvoll. Über einen Fragebogen konnte ein gesteigertes Risiko mit zunehmendem Alter, steigender Futtermenge pro Mahlzeit und niedriger Fütterungsfrequenz ermittelt werden. Eine gesteigerte Freßgeschwindigkeit übt einen tendenziellen Einfluss auf die Ausbildung des MMS aus. Keinen Einfluss dahingegen haben das Geschlecht und der Charakter der Tiere, bestehende gastrointestinale Störungen sowie vorangegangene Antibiotikumgaben.