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Primary sensory axons fail to regenerate into the spinal cord following dorsal root injury leading to permanent sensory deficits. Re-entry is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the CNS-PNS interface. Current approaches for promoting DR regeneration across the DREZ have had some success, but sustained, long-distance regeneration, particularly of large-diameter myelinated axons, still remains a formidable challenge. Our lab has previously shown that induced expression of constitutively active B-RAF (kaBRAF) enhanced the regenerative competence of injured DRG neurons in adult mice. In this study, I investigated whether robust intraspinal regeneration can be achieved by selective expression of kaBRAF alone or in combination with deletion of the myelin-associated inhibitors or neuron-intrinsic growth suppressors (PTEN or SOCS3). To this end, I used LSL-kaBRAF: brn3a-CreERT2 transgenic mice in which kaBRAF can be induced selectively in sensory neurons. I have also bred LSL-kaBRAF: brn3a-CreERT2 mice with triple knock-out mice lacking Nogo, Mag and OMgp or mouse lines carrying floxed alleles of PTEN or SOCS3. Single, double, and triple conditional mice were subjected to cervical DR crush and AAV2-eGFP vectors were used to selectively label regenerating axons of large-diameter neurons. I compared the extent of regeneration at 3 weeks or 2 months after DR injury using conventional anatomical and behavioral analyses. I found that kaBRAF alone promoted axon regeneration across the DREZ but did not produce significant functional recovery by two months. Supplementary deletion of Nogo, MAG, and OMgp did not improve kaBRAF-induced regeneration. Deletion of PTEN or SOCS3 individually or in combination failed to promote axon regeneration across the DREZ. In marked contrast, simultaneous deletion of PTEN, but not SOCS3, dramatically enhanced kaBRAF-mediated regeneration enabling many more axons to penetrate the DREZ and grow deep into the spinal cord. This study shows that dual activation of BRAF-MEK-ERK and PI3K-Akt signaling is an effective strategy to stimulate robust intraspinal DR regeneration and may lead to recovery of sensory function after DR injury. / Biomedical Sciences

Inicialmente caracterizada como proteína supressora de tumor, a PTEN (phosphatase and tensin deleted on chromosome 10) tem sido objeto de estudo de trabalhos relacionados a outros processos envolvendo proliferação, sobrevivência e migração celulares, apresentando um potencial papel modulatório na neurogênese e plasticidade sináptica. Fatores ambientais, como a dieta intermitente e o exercício físico, também podem modular estes processos, podendo ser utilizados como intervenções para neuroproteção e melhora de déficits de aprendizado e memória. A ausência de PTEN em neurônios ocasiona anomalias anatômicas e funcionais, culminando em sinaptogênese aumentada e redução do LTP e LTD. Levando-se em consideração a potencial modulação da via PI3K/AKT pela dieta intermitente e pelo exercício físico, a avaliação da influência destas intervenções sobre os efeitos da deleção neuronal da PTEN constitui uma interessante ferramenta de estudo para melhor elucidação dos mecanismos associados à plasticidade sináptica. Este trabalho objetivou caracterizar bioquímica e funcionalmente o hipocampo e o córtex de camundongos adultos com deleção neuronal da PTEN, avaliando seus efeitos sob influência de intervenções não-farmacológicas. Para isto, foram utilizados camundongos com nocaute neuronal condicionado da PTEN (PtenloxP/+;Nse-Cre+). Os animais foram submetidos à dieta intermitente ou exercício físico voluntário por um período de 30 dias, avaliados por ensaios comportamentais (labirinto em cruz elevado, campo aberto, reconhecimento do objeto novo ou da localização do objeto, labirinto aquático de Morris e esquiva inibitória) e, posteriormente, foram realizadas as análises de Western Blotting, da atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) e dosagem do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). A deleção neuronal da PTEN induziu macrocefalia por aumento da massa cortical. A deleção condicionada da PTEN, sob estímulo de intervenção não-farmacológica dieta intermitente ou exercício físico induz um efeito ansiolítico nos animais, no labirinto em cruz elevado. Os resultados do campo aberto, porém, paradoxalmente não reforçam este resultado. Interessantemente, o isolamento social intrínseco ao estudo do exercício físico induziu um aumento do perfil de ansiedade nos animais, independentemente do genótipo ou tratamento. Os resultados do labirinto aquático de Morris não foram conclusivos, porém apontam para um possível déficit de memória espacial nos animais HT, além de, supreendentemente, um efeito deletério do exercício físico também observado nos níveis corticais de BDNF. Na esquiva inibitória, o déficit dos animais HT foi efetivamente resgatado pela dieta e pelo exercício físico. O hipocampo não apresentou alterações bioquímicas significativas. No córtex, pode-se confirmar a diminuição da expressão da PTEN e possível ativação da AKT, embora nenhum efeito sobre os receptores ionotrópicos glutamatérgicos tenha sido observado. O perfil de expressão da Cre recombinase foi validado por meio da linhagem Nse-Cre+;tdTomato+. O estudo da linhagem PtenloxP/+;Nse-Cre+ demonstrou um interessante potencial para avaliação dos efeitos da PTEN sobre a cognição e a plasticidade sináptica, porém um melhor balizamento dos ensaios faz-se necessário, visando a busca de condições de análise dos efeitos observados. Ainda, a expansão dos estudos com a linhagem por meio da utilização de outros estímulos pode constituir uma interessante forma de revelar os efeitos não observados. / First characterized as a tumor suppressor, PTEN (phosphatase and tensin deleted on chromosome 10) has been a target studied in many projects related to processes involving cell proliferation, survival and migration, showing a potential modulatory role in controlling neurogenesis and synaptic plasticity. Environmental factors, such as intermittent fasting and physical exercise, can also modulate those processes, thus having the potential of being applied as neuroprotective interventions aiming to improve learning and memory deficits. PTEN absence in neurons cause anatomical and functional anomalies, culminating in increased synaptogenesis and LTP and LTD reduction. Considering the potential of intermittent fasting and physical exercise to exert a modulatory role over the PI3K/AKT pathway, the assessment of the influence of these interventions over the effects of PTEN neuronal deletion is of great interest, as it can help better elucidate the mechanisms of synaptic plasticity. This work aimed to functionally and biochemically assess the hippocampus and the cortex of adult mice with a conditioned neuronal deletion of PTEN (PtenloxP/+;Nse-Cre+), evaluating its effects under the influence of non-pharmacological interventions. Animals were submitted to an intermittent fasting or to a voluntary physical exercise protocol for 30 days, then assessed by behavioral (elevated plus maze, open field, novel object or object location recognition tests, Morris water maze, and passive avoidance) and biochemical (Western blotting, nitric oxide synthase activity, BDNF levels) assays. The neuronal PTEN deletion induced macrocephaly through an increase in cortical mass. Also, under the stimuli of non-pharmacological interventions intermittent fasting or physical exercise the deletion induced an anxiolytic effect on the elevated plus maze assay. On the other hand, the open field results were paradoxical. Interestingly, social isolation an intrinsic factor from the physical exercise protocol induced an increase in the anxiety behavior, independently of genotype or treatment. Results from the Morris water maze assay were not conclusive, however they pointed to a likely spatial memory deficit on animals with the PTEN deletion. Surprisingly, a deleterious effect of physical exercise was also observed an effect found on BDNF levels as well. At the passive avoidance test, the deficit from the HT group was effectively rescued by either intermittent fasting and physical exercise. The hippocampus did not show any significant biochemical alterations. However, the decreased PTEN expression was confirmed in the cortex, as well as the possible AKT activation, although any effect over the glutamatergic ionotropic receptor was found. The Cre recombinase expression profile was validated through the reporter lineage Nse-Cre+;tdTomato+. The study of PtenloxP/+;Nse-Cre+ lineage showed great potential of assessing PTEN effects on cognition and synaptic plasticity. However, a deeper standardization of parameters is recommended in order to better evaluate the observed effects. In addition, by expanding the study of this lineage through the application of other stimuli could constitute an interesting way of revealing these non-observed results.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do Wnt e PI3K, quando células de carcinoma epidermóide (HN6 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), foram estimulados com 50nM Wortmannin (metabólito fúngico que mimetiza a função da PTEN) e 10ng/ml EGF (fator de crescimento epitelial). Para isto, proteínas-chave, pertencentes a estas vias, foram localizadas e quantificadas no interior celular: PTEN, ?-catenina, Akt, pAkt e Ciclina D1. As técnicas de imunofluorescência e western blot foram utilizadas, respectivamente, para observar a localização e os níveis destas proteínas, nos diferentes compartimentos celulares. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, independentemente da via de sinalização do Wnt. Quando as células foram tratadas com wortmannin, houve depleção dos níveis citosólicos e totais de pAkt associada ao acúmulo citoplasmático de ciclina D1. Igualmente, não houve alteração nos níveis da proteína ?-catenina. Ademais, detectou-se a presença de PTEN nuclear em todas as linhagens estudadas. Desta forma, estas células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, apresentaram mecanismos de bloqueio e de ativação da proliferação celular, predominantemente, por atividade das proteínas PTEN (atividades citoplasmática e nuclear) e Akt, após o tratamento com wortmannin e EGF. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation between PI3K and Wnt signaling pathways in two different HNSCC cell lines (HN6 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), treated with 50nM wortmannin and 10ng/ml EGF (epidermal growth factor). Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze Wnt, PTEN and PI3K signaling key target proteins: PTEN, Akt, CyclinD1 and ?-catenin. Results showed that ?-cateninindependent cellular proliferation was promoted by PI3K signaling pathway EGF-dependent activation. After wortmannin treatment, correlation between decreased phospho-Akt levels and cytosolic cyclin D1 accumulation was found. Also, all cell lines exhibited nuclear PTEN activity. Taking these results together, we conclude that the Cyclin D1 positive and negative modulations, after EGF and wortmannin treatments, were due to, respectively, Akt and PTEN proteins.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do PTEN, Akt, Mdm2 e p53 em quatro linhagens de células de carcinoma epidermóide (HN6, HN19, HN30 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), estimulados com EGF (fator de crescimento epitelial) e 17-AAG. Para observar a localização e os níveis de PTEN, Akt, Mdm2 e p53 nos diferentes compartimentos celulares estas proteínas foram localizadas e quantificadas no interior celular através das técnicas de imunofluorescência e western blot, respectivamente. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K/Akt, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, sendo HN31 a linhagem celular de melhor resposta proliferativa. Quando as células foram tratadas com 17-AAG a linhagem HN31 foi a que melhor traçou um perfil apoptótico com diminuição dos níveis de Akt, ausência de Mdm2 e aumento dos níveis de PTEN e p53. As linhagens celulares HN6 e HN19 continuaram apresentando níveis significativos de Akt e Mdm2, o que sugere um potencial mais agressivo devido a manutenção do comportamento proliferativo e anti-apoptótico destas linhagens. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation among PTEN, Akt, Mdm2 and p53 signaling pathways in four different HNSCC cell lines (HN6, HN19, HN30 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), all of than treated with 10ng/ml EGF (epidermal growth factor) and 2?M 17-AAG. Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze PI3K/Akt signaling key target proteins: PTEN, Akt, Mdm2 and p53. Treatment of HNSCC cell lines with EGF resulted in activation of the PI3K/Akt pathway and enhanced cell proliferation. The results showed higher proliferative activity in HN31 cell line. The treatment of HNSCC cell lines with 17-AAG inhibited the proliferation in various levels. HN31 cell lines expressed PTEN and p53 in high levels and low expression for Akt and Mdm2 proteins. These findings suggest that 17-AAG can induce p53-dependent apoptosis in HN31 cell lines. On the contrary, HN6 and HN19 cell lines displayed high levels of Akt and Mdm2 proteins, resulting in decreased apoptosis and increased aggressive potential.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do PTEN, Akt, Mdm2 e p53 em quatro linhagens de células de carcinoma epidermóide (HN6, HN19, HN30 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), estimulados com EGF (fator de crescimento epitelial) e 17-AAG. Para observar a localização e os níveis de PTEN, Akt, Mdm2 e p53 nos diferentes compartimentos celulares estas proteínas foram localizadas e quantificadas no interior celular através das técnicas de imunofluorescência e western blot, respectivamente. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K/Akt, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, sendo HN31 a linhagem celular de melhor resposta proliferativa. Quando as células foram tratadas com 17-AAG a linhagem HN31 foi a que melhor traçou um perfil apoptótico com diminuição dos níveis de Akt, ausência de Mdm2 e aumento dos níveis de PTEN e p53. As linhagens celulares HN6 e HN19 continuaram apresentando níveis significativos de Akt e Mdm2, o que sugere um potencial mais agressivo devido a manutenção do comportamento proliferativo e anti-apoptótico destas linhagens. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation among PTEN, Akt, Mdm2 and p53 signaling pathways in four different HNSCC cell lines (HN6, HN19, HN30 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), all of than treated with 10ng/ml EGF (epidermal growth factor) and 2?M 17-AAG. Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze PI3K/Akt signaling key target proteins: PTEN, Akt, Mdm2 and p53. Treatment of HNSCC cell lines with EGF resulted in activation of the PI3K/Akt pathway and enhanced cell proliferation. The results showed higher proliferative activity in HN31 cell line. The treatment of HNSCC cell lines with 17-AAG inhibited the proliferation in various levels. HN31 cell lines expressed PTEN and p53 in high levels and low expression for Akt and Mdm2 proteins. These findings suggest that 17-AAG can induce p53-dependent apoptosis in HN31 cell lines. On the contrary, HN6 and HN19 cell lines displayed high levels of Akt and Mdm2 proteins, resulting in decreased apoptosis and increased aggressive potential.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do Wnt e PI3K, quando células de carcinoma epidermóide (HN6 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), foram estimulados com 50nM Wortmannin (metabólito fúngico que mimetiza a função da PTEN) e 10ng/ml EGF (fator de crescimento epitelial). Para isto, proteínas-chave, pertencentes a estas vias, foram localizadas e quantificadas no interior celular: PTEN, ?-catenina, Akt, pAkt e Ciclina D1. As técnicas de imunofluorescência e western blot foram utilizadas, respectivamente, para observar a localização e os níveis destas proteínas, nos diferentes compartimentos celulares. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, independentemente da via de sinalização do Wnt. Quando as células foram tratadas com wortmannin, houve depleção dos níveis citosólicos e totais de pAkt associada ao acúmulo citoplasmático de ciclina D1. Igualmente, não houve alteração nos níveis da proteína ?-catenina. Ademais, detectou-se a presença de PTEN nuclear em todas as linhagens estudadas. Desta forma, estas células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, apresentaram mecanismos de bloqueio e de ativação da proliferação celular, predominantemente, por atividade das proteínas PTEN (atividades citoplasmática e nuclear) e Akt, após o tratamento com wortmannin e EGF. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation between PI3K and Wnt signaling pathways in two different HNSCC cell lines (HN6 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), treated with 50nM wortmannin and 10ng/ml EGF (epidermal growth factor). Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze Wnt, PTEN and PI3K signaling key target proteins: PTEN, Akt, CyclinD1 and ?-catenin. Results showed that ?-cateninindependent cellular proliferation was promoted by PI3K signaling pathway EGF-dependent activation. After wortmannin treatment, correlation between decreased phospho-Akt levels and cytosolic cyclin D1 accumulation was found. Also, all cell lines exhibited nuclear PTEN activity. Taking these results together, we conclude that the Cyclin D1 positive and negative modulations, after EGF and wortmannin treatments, were due to, respectively, Akt and PTEN proteins.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreiaFC_DISSERT.pdf: 3035785 bytes, checksum: a9769f0a294924c551036d1a098b7d2a (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / A displasia epitelial (DE) oral ? uma desordem potencialmente maligna (DPM), cujo diagn?stico e grada??o histol?gica se baseiam nas suas altera??es arquiteturais e citol?gicas. Para avaliar o risco de transforma??o maligna dessas les?es de forma mais precisa ? fundamental entender e localizar altera??es gen?ticas e epigen?ticas nas c?lulas displ?sicas, as quais podem ajudar a compreender melhor a progress?o para a malignidade. Dessa forma, o presente estudo objetivou avaliar a imunoexpress?o de EGFR e PTEN nas DEs orais e relacionar esse aspecto com as caracter?sticas cl?nicas e grada??o histol?gica pelo sistema bin?rio (baixo e alto risco de transforma??o maligna). Para tanto, foram selecionados 20 casos de DE de alto risco e 20 de baixo risco para serem submetidos ? an?lise imunoistoqu?mica para os biomarcadores supracitados. A imunomarca??o de cada caso foi avaliada semiquantitativamente atrav?s de escores e quanto ? localiza??o nos estratos epiteliais. A an?lise estat?stica foi realizada atrav?s dos testes de Mann-Whitney, Qui-quadrado de Pearson, Exato de Fisher e de correla??o de Spearman com n?vel de signific?ncia estabelecido em 5%. Os resultados mostraram que 57,5% dos pacientes eram do g?nero feminino, a m?dia de idade foi de 57,5 anos, 42,5% foram diagnosticados clinicamente como leucoplasia e a maioria dos casos foi proveniente de les?es localizadas na l?ngua (32,5%). De forma geral, g?nero e idade n?o exerceram influ?ncia na imunoexpress?o do EGFR e PTEN. A express?o do EGFR foi observada em 100% dos casos, nos quais houve predom?nio do escore 3 (75%) e imunoreatividade em todas as camadas epiteliais (55%), independente da grada??o histol?gica (p = 0,453 e p = 0,204, respectivamente). O PTEN revelou positividade de marca??o em 87,5% dos casos, nos quais observou-se predom?nio do escore 0 (55%) e imunoreatividade limitada ? camada basal (40%), por?m sem diferen?as significativas entre os grupos histol?gicos (p = 0,904 e p = 0,915, respectivamente). Por fim, quando analisados, em conjunto, os 40 casos de DEs, foi observada uma fraca correla??o positiva, estatisticamente significativa, entre os padr?es de imunoexpress?o do EGFR e do PTEN (r = 0,317; p = 0,046). Com base nesses resultados, altera??es no padr?o de express?o do EGFR e PTEN sugerem que essas prote?nas participam de processos moleculares relacionados com a carcinog?nese em mucosa oral