Le phénomène de multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif causant des infections sévères du sang est un problème mondial grandissant. La détection du niveau de sensibilité aux antibiotiques avec des tests phénotypiques requière un minimum de 48 h avant l'obtention des résultats. Il est donc nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires pour améliorer le traitement des septicémies. Ce mémoire de maîtrise présente le développement d'un test de diagnostic moléculaire permettant la détection rapide des gènes de résistance aux antibiotiques cliniquement importants associés aux bactéries à Gram positif causant des septicémies. Ce test comprend 4 essais PCR multiplex combinés à une hybridation microfluidique sur puces à ADN intégrées à un disque compact. Les corrélations obtenues entre les résultats génotypiques et phénotypiques étaient de 98% pour les P-lactamines et de 100% pour la vancomycine, la clindamycine et la gentamicine. Cette approche moléculaire pourrait éventuellement être utilisée pour le diagnostic clinique afin de guider l'antibiothérapie des patients atteints d'une septicémie.

Le tissu adipeux épicardique (TAE) est localisé à la surface du cœur en contact avec les artères coronaires, ce qui suggère un rôle dans la pathogénèse de la maladie coronarienne. Les objectifs de cette étude étaient d’identifier les gènes différentiellemment régulés entre les tissus graisseux épicardique, médiastinal et sous-cutané à l’aide des biopuces d’ADN et d’étudier leurs rôles dans le développement des maladies cardiovasculaires. Les résultats ont montré une grande similarité d’expression entre les tissus adipeux épicardique et médiastinal. Toutefois, certains gènes impliqués dans les maladies cardiovasculaires étaient régulés différemment entre ces deux tissus. L’expression des gènes codant pour le récepteur A1 de l’adénosine (ADORA1) et la prostaglandine D2 synthase (PTGDS), impliqué dans les ischémies myocardiques et la progression de l’athérosclérose, respectivement, était significativement élevée dans le TAE. Cette étude est une première étape pour comprendre le rôle biologique du TAE et ses implications dans les maladies cardiovasculaires. / Increased visceral adipose tissue has been associated with the development of cardiovascular diseases (CVD). Epicardial adipose tissue (EAT) is the visceral fat depot located on the surface of the heart especially around the epica rdial coronary vessels with extension into the myocardium. The proximity of EAT to the coronary arteries suggests a role in the pathogenesis of coronary artery disease (CAD). EAT thickness was significantly correlated with the severity of CAD. However, the biological functions of EAT and its relationship with the development of CVD remain largely elusive. The objectives of this study were to identify genes that were up- or down-regulated among three distinct adipose tissues, namely EAT, mediastinal and subcutaneous using whole-genome gene expression microarrays and to study the possible relationships of these genes with the development of CVD. Overall, the transcriptional profiles of EAT and mediastinal adipose tissue were similar compared to subcutaneous adipose tissue. Despite this similarity, a number of genes involved in cardiovascular diseases were up-regulated in EAT. The expression of the adenosine A1 receptor (ADORA1), involved in myocardial ischemia, was significantly up-regulated in EAT. Levels of the prostaglandin D2 synthase (PTGDS) gene, recently associated with the progression of atherosclerosis, were significantly different in the three pairwise comparisons (epicardial > mediastinal > subcutaneous). Overexpression of ADORA1 and PTGDS in EAT may confer cardioprotection against myocardial ischemia and CAD. This study is an important first step to understand the biological function of EAT and its potential implications in CVD.

Le processus biologique fondamental que représente la spéciation permet l’émergence d’une diversité fulgurante sur Terre. L’un des défis qui se posent actuellement pour les biologistes évolutionnistes est de comprendre les mécanismes moléculaires fondamentaux qui sous-tendent l’expression de cette diversité observée en milieu naturel. Advenant la colonisation d’un nouvel environnement par une espèce donnée, ces mécanismes peuvent se mettre en place rapidement afin de permettre une exploitation différentielle et indépendante des niches écologiques disponibles. La divergence entre populations exploitant différentes niches s’exprime alors, au niveau génétique, par l’établissement de barrières au flux génique de façon hétérogène à l’intérieur des génomes. La situation évolutive du grand corégone en Amérique du Nord correspond précisément à ce contexte. En effet, on retrouve en milieu lacustre des populations sympatriques de deux écotypes, soit la forme normale benthique et la forme naine limnétique, qui démontrent des signes évidents de divergence morphologique et génétique. Dans le cadre de cette récente divergence entre écotypes, nous avons utilisé les plus récents développements biotechnologiques afin d’identifier et caractériser les régions génomiques fortement différenciées entre écotypes de grand corégone. Les objectifs de la présente étude étaient de i) mettre au point une bio-puce de capture ciblée d’ADN génomique, ii) d'hybrider de l’ADN génomique de plusieurs corégones appartenant aux populations sympatriques à l’aide de la puce conçue, iii) d’assembler et annoter un maximum de gènes capturés et iv) de caractériser la nature et l’ampleur des régions génomiques de divergence entre nains et normaux. L'utilisation de cette technique a permis de capturer et d'assembler avec précision 2 728 gènes (~10% du génome) afin de procéder à une étude à large spectre des différences génétiques entre les deux écotypes. Ce travail a permis d'identifier 267 marqueurs SNP, situés dans 210 gènes, fortement différenciés et potentiellement impliqués dans la divergence écologique qui s’exerce entre écotypes de grand corégone. Les résultats suggèrent que la régulation de l’expression des gènes et un ensemble de mutations, chacune de faible effet, interviennent tôt dans le processus de spéciation chez le corégone, par opposition aux mutations structurales qui modifient la séquence codante des gènes. / The fundamental process of speciation allows the emergence of an astonishing diversity on Earth. One of the main challenges in evolutionary biology is to understand and document the fundamental molecular mechanisms underlying this diversity observed in nature. The establishment of these mechanisms can be extremely rapid when a species colonizes new environments, which gives birth to niche specialization. On the genetic level, this population divergence appears by the emergence of heterogeneous barriers to gene flow in the genome. Lake Whitefish species pairs in North America represent a good model to study the ongoing process of speciation given its particular evolutionary situation. Various lakes in northeastern North America harbor sympatric populations of dwarf (limnetic) and normal (benthic) whitefish showing clear signs of morphological and genetic divergence. In this study, we have taken advantage of recent biotechnological developments in order to identify and document genomic regions of divergence between whitefish ecotypes. The objectives were to i) develop an exon capture chip, ii) enrich and capture genomic regions from multiple samples in natural populations, iii) assemble and annotate a maximum of captured genes and, ultimately, iv) document the extent of genetic differentiation between whitefish ecotypes. This new approach available with the technology of sequence capture allowed us to specifically capture and assemble 2,728 genes (~10% of the genome) to document on a large scale the extent of genetic differentiation between both ecotypes. In total, 267 SNP loci, located in 210 genes, were significantly divergent. This vast array of genes associated to many different biological processes potentially and partly explains the ecological divergence between whitefish ecotypes. Results suggest a greater role of regulation of gene expression and the role of many changes, each of small effect, as explaining early divergence between dwarf and normal whitefish, compared to functional mutations in the protein coding regions.

Le syndrome de Werner (SW) est une maladie génétique de transmission autosomique récessive qui cause le vieillissement prématuré. La maladie est causée par une mutation dans le gène Werner (WRN). Étant donné que le niveau d'espèces réactives d'oxygène (EROs) est élevé chez les personnes atteintes du SW et que c'est probablement un facteur causant une partie du phénotype, nous avons vérifié le phénomène au niveau cellulaire. Pour ce faire, nous avons analysé des fibroblastes de souris embryonnaires (FSEs) de type sauvage (TS) et des FSEs ayant une deletion dans une partie du domaine hélicase de la protéine homologue de WRN (Wrn[delta]hel/[delta]hel). Nous avons mesuré le niveau d'EROs dans ces cellules. Après avoir constaté que le niveau d'EROs est plus élevé dans les FSEs Wrn[delta]hel/[delta]hel que dans les FSEs TS, nous avons mesuré les effets directs et indirects de cette augmentation du niveau d'EROs au plan de la transcription globale dans ces cellules. Finalement, pour mieux comprendre l'impact des EROs dans le phénotype, nous avons étudié l'effet de l'addition d'EROs exogènes sur les cellules en culture. Nous avons donc traité des FSEs TS et Wm mutants avec du peroxyde d'hydrogène. À l'aide de biopuces à ADN, nous avons comparé le profil d'expression génique des FSEs traités au peroxyde d'hydrogène par rapport aux cellules non traitées. Nous avons par la suite validé les résultats des biopuces à ADN par transcriptase inverse suivi d'une réaction de polymerase en chaîne quantitative (TI-RPC) et analysé les données avec le programme PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships). Les EROs exogènes ont peu d'impact sur le profil d'expression des gènes chez les FSEs Wrn mutants en comparaison avec les FSEs TS car ces cellules démontrent déjà un niveau d'EROs plus élevé que la normale. Toutefois, plusieurs sentiers biologiques déjà affectés chez les FSEs Wrn mutants ont été affectés de la même façon dans les FSEs TS traités au peroxyde d'hydrogène. D'ailleurs, plusieurs de ces sentiers biologiques sont étroitement reliés au phénotype observé chez notre modèle de souris Wrn mutantes ainsi que chez les patients atteints du SW.

Les biopuces à ADN permettent d’étudier à une échelle génomique une très grande variété de questions sur la physiologie et la différenciation cellulaires. Elles ont ainsi contribué de manière considérable aux progrès récents de nombreux domaines de la biologie et occuperont bientôt une place de choix dans le secteur du diagnostic médical. C’est la levure Saccharomyces cerevisiae qui a servi de modèle pour le développement de la première biopuce génomique. L’application de cette approche à la levure a permis d’explorer sous un angle nouveau l’étude de ses différents états de différenciation, de son cycle cellulaire, et de sa capacité d’adaptation à diverses conditions nutritionnelles ou à des conditions environnementales induisant un stress cellulaire. Plusieurs études ont plus particulièrement examiné la réponse des cellules de levure à une carence en azote ou en acides aminés. Cependant, une étude systématique de la réponse transcriptionnelle de la cellule aux différentes sources d’azote n’a jamais été entreprise en croissance confinée à l'état de régime. S. cerevisiae est capable d’utiliser plus d’une vingtaine de substances en tant que sources uniques d’azote pour la croissance. On distingue parmi les sources d’azote celles qui permettent une croissance optimale, appelées « bonnes » sources d’azote, des autres, appelées « mauvaises » sources d’azote. La levure possède plusieurs systèmes de régulation lui permettant de s'adapter à la condition azotée. Au niveau transcriptionnel, on recense trois régulations générales – la NCR (répression catabolique azotée), le GAAC (le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés) et le système SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) – et une multitude de régulations plus spécifiques. En utilisant la technique des puces à ADN, nous avons généré une matrice d'expression de l'ensemble des gènes de la levure en croissance confinée à l'état de régime dans un milieu de culture contenant une parmi 21 sources d'azote différentes. Nous avons pu ainsi recenser systématiquement 506 gènes soumis à une régulation transcriptionnelle dépendante de l'azote. En nous basant sur ces résultats, nous avons pu décrire l'ensemble des régulations transcriptionnelles engagées dans l'adaptation à la source d'azote fournie dans le milieu de culture. Parallèlement, nous avons défini deux grands groupes de sources d'azote en fonction du transcriptome de S. cerevisiae. Le premier groupe rassemble les composés qui exercent une répression catabolique azotée forte et dont la liste a été complétée. Fait nouveau, nous montrons que ces mêmes composés enclenchent aussi l'activation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Au contraire, lorsque la source d'azote appartient au second groupe que nous avons défini, non seulement la croissance des levures est plus lente, la NCR levée et la réponse aux protéines mal repliées réprimée, mais nous montrons de façon inattendue que le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés est activé. Plusieurs autres régulations qui ne sont pas impliquées dans le métabolisme azoté présentent un comportement différent en fonction de la source d'azote fournie. C'est le cas notamment des gènes dont l’expression est régulée selon l’apport en zinc et qui sont moins exprimés sur le milieu urée. De même, les gènes impliqués dans les résistances multiples aux drogues sont activés par le tryptophane. En confrontant nos résultats à ceux obtenus dans le cadre de travaux indépendants, nous avons proposé plus d'une cinquantaine de nouveaux gènes cibles de la NCR. Beaucoup d'entre eux n'ont jamais été caractérisés expérimentalement. En utilisant des techniques avancées d'analyse de séquences primaires de protéines, nous avons pu proposer une fonction pour plusieurs de ces gènes. Ces analyses bioinformatiques et la réalisation d’expériences complémentaires à l’aide de biopuces à ADN nous ont permis de proposer que l'un d'entre eux code pour une protéine impliquée dans la déstabilisation d'ARN messagers lors de la carence azotée. Nous avons aussi identifié plusieurs nouveaux gènes appartenant à des régulons spécifiquement activés en réponse à un nombre restreint de sources d'azote. Il est probable que ces gènes soient impliqués dans le catabolisme des sources d'azote sur lesquelles ils sont activés.

Les microorganismes constituent la plus grande diversité du monde vivant et restent encore largement méconnus. La compréhension du fonctionnement des écosystèmes et les rôles joués par les microorganismes reste un enjeu majeur de l'écologie microbienne. Le développement de nouvelles approches de génomique permet d'appréhender la complexité de ces systèmes. Dans ce contexte, les puces à ADN représentent des outils à haut débit de choix capables de suivre l'expression ou la présence de plusieurs milliers de gènes en une seule expérience. Cependant, l'une des étapes les plus difficiles, de part sa complexité et la quantité de données à traiter, est la sélection de sondes qui doivent être à la fois sensibles et spécifiques. Pour répondre à ces besoins en termes de performance et de qualité, d'une part, nous avons développé un algorithme de conception de sondes pour biopuces phylogénétiques que nous avons entièrement déployé sur la grille de calcul européenne EGEE, et d'autre part, nous avons proposé un deuxième algorithme pour biopuces fonctionnelles que nous avons déployé sur un cluster. Les deux algorithmes ont nécessité une phase importante d'ingénierie logicielle. Nous avons donc proposé une démarche d'ingénierie dirigée par les modèles (IDM) et notamment de transformation de modèle pour résoudre le problème de traduction inverse d'oligopeptide. Les deux algorithmes sont destinés à une utilisation massive et permettent de concevoir tout type de sondes

La technologie des microarrays demeure à ce jour un outil important pour la mesure de l'expression génique. Au-delà de la technologie elle-même, l'analyse des données provenant des microarrays constitue un problème statistique complexe, ce qui explique la myriade de méthodes proposées pour le pré-traitement et en particulier, l'analyse de l'expression différentielle. Toutefois, l'absence de données de calibration ou de méthodologie de comparaison appropriée a empêché l'émergence d'un consensus quant aux méthodes d'analyse optimales. En conséquence, la décision de l'analyste de choisir telle méthode plutôt qu'une autre se fera la plupart du temps de façon subjective, en se basant par exemple sur la facilité d'utilisation, l'accès au logiciel ou la popularité. Ce mémoire présente une approche nouvelle au problème de la comparaison des méthodes d'analyse de l'expression différentielle. Plus de 800 pipelines d'analyse sont appliqués à plus d'une centaine d'expériences sur deux plateformes Affymetrix différentes. La performance de chacun des pipelines est évaluée en calculant le niveau moyen de co-régulation par l'entremise de scores d'enrichissements pour différentes collections de signatures moléculaires. L'approche comparative proposée repose donc sur un ensemble varié de données biologiques pertinentes, ne confond pas la reproductibilité avec l'exactitude et peut facilement être appliquée à de nouvelles méthodes. Parmi les méthodes testées, la supériorité de la sommarisation FARMS et de la statistique de l'expression différentielle TREAT est sans équivoque. De plus, les résultats obtenus quant à la statistique d'expression différentielle corroborent les conclusions d'autres études récentes à propos de l'importance de prendre en compte la grandeur du changement en plus de sa significativité statistique. / Microarrays remain an important tool for the measurement of gene expression, and a myriad of methods for their pre-processing or statistical testing of differential expression has been proposed in the past. However, insufficient and sometimes contradictory evidence has prevented the emergence of a strong consensus over a preferred methodology. This leaves microarray practitioners to somewhat arbitrarily decide which method should be used to analyze their data. Here we present a novel approach to the problem of comparing methods for the identification of differentially expressed genes. Over eight hundred analytic pipelines were applied to more than a hundred independent microarray experiments. The accuracy of each analytic pipeline was assessed by measuring the average level of co-regulation uncovered across all data sets. This analysis thus relies on a varied set of biologically relevant data, does not confound reproducibility for accuracy and can easily be extended to future analytic pipelines. This procedure identified FARMS summarization and the TREAT gene ordering statistic as algorithms significantly more accurate than other alternatives. Most interestingly, our results corroborate recent findings about the importance of taking the magnitude of change into account along with an assessment of statistical significance.

Notre travail s’est intéressé aux anomalies du développement embryonnaire d’origine génétique en étudiant : -d’une part des patients associant des malformations congénitales multiples plus ou moins associées à un retard mental et à un syndrome dysmorphique, -et d’autre part des patients présentant un phénotype particulier : le spectre oculo-auriculo-vertébral (OAVS) incluant le syndrome de Goldenhar. L’analyse a consisté en l’étude pangénomique de ces patients au moyen de puces à ADN (CGH-array), dans le but d’identifier de nouveaux remaniements chromosomiques avec anomalie du nombre de copies. Nous avons identifié différentes régions variantes et analysé pour chacune leur caractère pathogène potentiel en fonction de leur nature, de leur taille, de leur caractère hérité ou de novo, de leur contenu en gènes et en polymorphismes du nombre de copies, des éléments déjà décrits dans les bases de données et la littérature. Les régions variantes identifiées ont été vérifiées par d’autres techniques de recherche d’anomalies de dosage génique. L’ensemble de ces résultats permet de formuler des hypothèses quant à de nouveaux gènes candidats pour plusieurs symptômes observés, et pour l’OAVS. Ils permettent d’ajouter de nouvelles données à l’ensemble des anomalies décrites depuis quelques années grâce à ces techniques innovantes. / Our work focused on embryonic development abnormalities of genetic origin by studying: - patients with multiple congenital malformations associated or not associated with mental retardation and a dysmorphic syndrome; - patients presenting with the oculo-auriculo-vertebral spectrum (OAVS) that includes the Goldenhar syndrome. Patients were analysed by array-CGH in order to identifying novel chromosomal rearrangements with copy number abnormalities. We have identified several chromosomal regions with copy number variations and analysed for each of those their pathogenic potential, according to their nature, size, either inherited or de novo status, genes and copy number polymorphisms content, and data already reported both in databases and in the literature. The existence of a copy number variation was confirmed by other experimental approaches able to detect gene dosage abnormalities. Our results allowed discussing the possible involvement of candidate genes with respect to the symptoms observed in the patients and to OAVS. They also allowed to add new data to the growing field of copy number variations gathered over the recent years.

Les mesures des niveaux d'expression de tous les gènes d'un génome requièrent une analyse<br />statistique afin d'obtenir des conclusions fiables. Les biologistes ont du mal à faire un choix dans la<br />foule de méthodes existantes. Afin de déterminer quelle méthode est la plus adéquate pour la<br />problématique abordée, des comparaisons de méthodes d'analyse disponibles sont nécessaires.<br />Actuellement les critères de comparaison se révèlent soit lacunaires ou soit non pertinents du point de<br />vue biologique.<br />Nous avons introduit un nouveau critère biologique de comparaison des méthodes d'analyse du<br />transcriptome fondé sur une structure des génomes bactériens : les opérons. Les gènes d'un opéron<br />sont généralement transcrits sur un même ARNm. Si un gène d'un opéron bactérien est identifié, les<br />autres gènes de l'opéron devraient l'être également. Nous avons ainsi comparé des méthodes<br />d'analyse appliquées au transcriptome : l'ACP et l'ACI, respectivement analyses en composantes<br />principales et indépendantes, l'ANOVA, analyse de variance, la régression des moindres carrés<br />partiels PLS et différents t-tests. Chaque méthode aborde le nuage de données d'un point de vue<br />différent ce qui donne des résultats complémentaires. Globalement, l'ACI a fourni les meilleurs<br />résultats tant en sensibilité qu'en terme de précision.<br />Un autre aspect, en plein développement, de l'analyse du transcriptome est la méta-analyse de<br />données d'origines diverses malgré les biais inhérents à cette technologie. Généralement ces métaanalyses<br />visent à préciser les résultats concernant des gènes différentiellement exprimés ou coexprimés.<br />Elles ouvrent également la possibilité d'étudier de nouveaux champs en biologie. Nous<br />avons utilisé des données de transcriptome indépendantes afin d'étudier l'organisation de l'expression<br />des gènes et, ainsi, celle du chromosome bactérien. L'étude du transcriptome de trois bactéries, B.<br />subtilis, E. coli et S. meliloti a révélé des corrélations d'expression à longue distance valables quel que<br />soit le gène étudié. Les structures en opéron se manifestent clairement au travers de cette étude, qui<br />a également permis de préciser que la co-expression de gènes proches s'étend au-delà des opérons<br />dans une région qui se répand jusqu'à une centaine de gènes.<br />Pour conclure, l'analyse du transcriptome n'a pas réellement nécessité la mise au point de méthodes<br />d'analyse statistiques spécifiques. Cependant, elle permet d'aborder de nouveaux horizons dans la<br />biologie, et notamment l'organisation chromosomique du génome bactérien.

Ce mémoire synthétise les travaux que j'ai menés de 2000 à 2004, au sein de deux laboratoires des facultés de Clermont-Ferrand : l'Equipe de Recherche en Imagerie Médicale (ERIM, Université d'Auvergne), où j'ai effectué ma thèse, et le Laboratoire d'Informatique, de Modélisation et d'Optimisation des Systèmes (LIMOS, Université Blaise Pascal) dans lequel j'ai été accueilli suite à mon recrutement en tant que maître de conférences dans cette même université. Ce changement de laboratoire s'est accompagné d'une modification de mon thème principal de recherche, passant du traitement d'images médicales multimodales par des techniques de fusion d'informations, au domaine de la bioinformatique en général, et de l'étude des puces à ADN en particulier. Plutôt que d'essayer de regrouper artificiellement ces deux thèmes au sein d'un même plan, j'ai préféré diviser ce mémoire en deux parties distinctes et cohérentes, chacune traitant d'un des deux aspects de recherche que je mène actuellement de front. Ainsi, la première partie résume les travaux que j'ai effectués depuis 2001 dans le domaine de la fusion de données appliquée au traitement d'images 3D du cerveau, soit directement soit dans le cadre du co-encadrement de deux doctorants. Le dernier chapitre de cette partie met en particulier en perspective les nouveaux développements espérés sur la stimulation magnétique transcrânienne, à travers l'encadrement d'une thèse CIFRE que j'assure par délégation à temps plein. La seconde partie se concentre sur les recherches que je mène depuis septembre 2001 au LIMOS, concernant l'étude des images de puces à ADN. J'expose dans cette partie au travers de trois chapitres mon projet de recherche dans ce domaine, et je présente pour chaque choix retenu ma contribution sous la forme d'un simulateur d'images de biopuces transcriptome et de nouvelles méthodes d'analyse de ces images. Si les deux parties sont clairement décorrélées, j'ai néanmoins essayé de dégager une problématique générale commune à mes travaux, que j'ai nommée sans forfanterie modélisation, classification et fusion de données biomédicales, et qui constitue le titre de ce manuscrit.