Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T18:20:55Z No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T18:21:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-08T18:21:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Meloidogyne enterolobii vem sendo detectado parasitando goiabeiras e hortaliças. O impacto negativo dos agrotóxicos tem levado ao uso restrito de alguns nematicidas. O potencial de fungos nematófagos vem sendo avaliado como estratégia complementar de controle dessa doença. O objetivo do presente estudo foi avaliar a patogenicidade de isolados de Pochonia chlamydosporia e Purpureocillium lilacinum (=Paecilomyces lilacinus) em ovos de Meloidogyne enterolobii em ensaios in vitro e em casa de vegetação. Foram avaliados 19 isolados de P. chlamydosporia e 17 isolados de Paecilomyces-like pertencentes à Coleção de Fungos de Invertebrados (CFI) da Embrapa Cenargen. Foram conduzidos três experimentos em placas de Elisa com o objetivo de: 1) avaliar a ação patogênica dos isolados sobre ovos do nematoide 2) avaliar os quatro melhores isolados de cada gênero quanto a patogenicidade sobre massas de ovos; 3) avaliar os dois melhores isolados de cada gênero quanto a patogenicidade sobre ovos quando aplicados em conjunto. Foram selecionados os isolados: CG1006, CG1044 (P. chlamydosporia), CG179 (P. lilacinum) e o produto Rizotec® (P. chlamydosporia) para avaliação do controle exercido por esses fungos, sobre a reprodução de M. enterolobii, em cultura de ciclo curto (tomate) e longo (banana), em condições de casa de vegetação. Na avaliação in vitro os isolados CG1006, CG1044, CG1042 e CG1101 (P. chlamydosporia) e CG179, CG1038, CG348 e CG959 (Paecilomyces-like) proporcionaram reduções superiores a 66%, quando aplicados sobre ovos. Na avaliação sobre massas de ovos, os mesmos apresentaram um resultado inferior. A aplicação em conjunto, não alterou a eclosão dos juvenis de segundo estádio (J2) de M. enterolobii. Nos experimentos em casa de vegetação se observou uma alta suscetibilidade da bananeira ao nematoide, embora a cultivar Terra tenha apresentado tolerância ao parasita. O isolado CG1006 proporcionou uma redução de 33% no número de ovos nessa cultura. No experimento com tomateiros, o isolado CG179 apresentou redução de 44,2% no número de ovos no tratamento sob baixa densidade populacional do nematoide; o isolado CG1006 causou uma redução de 33,6%. Não houve controle do nematoide em tomateiros em altas infestações de M. enterolobii, em condições de casa de vegetação. Essa pesquisa sugere que os agentes de controle biológico não podem substituir outros métodos de controle, mas podem ser integrados a outras estratégias de manejo que visem o re-estabelecimento do equilíbrio biológico do solo. / Meloidogyne enterolobii has been detected parasitizing guava and vegetables. The negative impact of pesticides has led to restricted use of some nematicides. The potential of nematophagous fungi has been evaluated as a complementary strategy to control this disease. The aim of this study was to evaluate the pathogenicity of Pochonia chlamydosporia and Purpureocillium lilacinum (=Paecilomyces lilacinus) on Meloidogyne enterolobii eggs in vitro and in greenhouse conditions. Were evaluated 19 isolates of P. chlamydosporia and 17 isolates of P. lilacinum belonging to the Fungi Invertebrates Collection (CFI) of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology. Three experiments were conducted in Elisa plates in order to: 1) evaluate the pathogenic action of these isolates on nematode eggs; 2) select the best four isolates of each genus for pathogenicity on egg masses; 3) evaluate the best two isolates of each genus for pathogenicity on eggs when applied together. In vitro evaluation isolates CG1006, CG1044, CG1042 and CG1101 (P. chlamydosporia) and CG179, CG1038, CG348 and CG959 (P. lilacinum) provided reductions of more than 66% when applied on eggs. When applied on egg masses, they show a lower result. The application together, did not alter the hatching of second stage juveniles (J2) of M. enterolobii . The experiments in greenhouse showed a high susceptibility of banana cv. Terra to M. enterolobii, although this plant had shown tolerance to the parasite. The isolated CG1006 provided a 33% of reduction in the number of eggs on this culture. On the experiment with tomato, isolated CG179 decreased 44.2% the number of eggs in the treatment under low nematode; population density; the isolate CG1006 caused a reduction of 33.6%. No control was observed on high infestations of M. enterolobii on tomato, under greenhouse conditions. This research suggests that biological control agents cannot replace other methods of control, but can be integrated with other management strategies to re-establish the biological balance of the soil.

Actualmente las proteasas alcalinas son ampliamente utilizadas en la industria del cuero, en distintas formulaciones de detergentes, también en el proceso de recuperación de plata, y en la producción de hidrolizados de proteínas. Comúnmente, todas estas proteasas se obtienen de fuentes microbianas que crecen en sustrato relativamente caros. Muchos estudios demuestran que cerca del 40% del costo de producción de estas enzimas está relacionada con la composición del medio de cultivo. Para reducir el costo de producción es importante la búsqueda de microorganismos capaces de crecer y de producir suficiente cantidad de la enzima usando sustratos baratos. En este sentido desechos de naturaleza queratínica tienen un enorme potencial para ser utilizacos como sustrato para la producción de un grupo de enzimas proteolíticas llamado queratinasas, las cuales presentan la capacidad de hidrolizar la queratina, proteína sumamente resistente a la degradación por su estructura y por la presencia en su molécula de puentes disulfuro. En el presente trabajo de tesis seis cepas de hongos no patógenos aislados de suelos alcalinos de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Acremonium murorum, Aspergillus sidowii, Cladosporium cladosporioides, Neurospora tetrasperma, Purpureocillium lilacinum (ex Paecilomyces lilacinus) y Westerdikella dispersa) fueron evaluados de acuerdo a su capacidad de producir enzimas queratinolíticas. Entre estas cepas, P. lilacinum resultó ser el hongo con mayor producción de actividad proteolítica y queratinolítica, tanto en fermentación en sustrato solido como en sumergido, siendo seleccionado para continuar con este trabajo. Se establecieron las condiciones óptimas de cultivo para la producción enzimática utilizando diseños experimentales y la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas fueron: 7,10 g/l de glucosa; 0.0065 mg/l de CaCl<SUB>2</SUB> y pH inicial de 5.60; en estas condiciones de cultivo, el rendimiento máximo para la producción de queratinasas predijo por el modelo fue de 26,7 U azo/ml. La validación del modelo demostró que, tanto el polinomio como las correspondientes superficies de respuesta obtenidas describen adecuadamente la influencia de la concentración de glucosa, de calcio y el pH inicial en la producción de queratinasas. Luego de la optimización del medio de cultivo se procedió a la purificación de la enzima, las etapas involucradas en la purificación fueron la precipitación con sulfato de amonio y distintas técnicas cromatográficas de intercambio iónico y permeación en gel, con un factor de purificación de 19.8 veces y una actividad específica de 1430 U/mg de proteína. El peso molecular de la enzima, determinado por SDS-PAGE, fue de 37 kDa. La queratinasa extracelular de P. lilacinum se caracteriza por su apreciable estabilidad en un amplio intervalo de pH (4.0 a 9.0), y hasta 65°C. La inhibición que presenta frente a PMSF (98,2% de la inhibición) sugiere su naturaleza serínica. La enzima es activa y estable en presencia de solventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, metanol, e isopropanol; ciertos tensioactivos como Triton X-100, dodecilsulfato de sodio, y Tween 85, y agentes oxidante como el peróxido de hidrógeno. Sus parámetros cinéticos de inactivación térmica fueron estimados bajo diferentes condiciones y fue posible observar cómo afectan calcio, el glicerol y el propilenglicol a la estabilidad térmica de la enzima. Se investigó la inmovilización covalente de la queratinasa pura sobre un soporte de quitosán, optimizando la concentración de los agentes entrecruzantes glutaraldehído y genipina, así como también el tiempo de activación. La enzima inmovilizada presentó mayor estabilidad frente a pH y temperaturas extremas en comparación con la enzima libre, además retiene 61.37 % de la actividad enzimática inicial después de cinco ciclos de hidrolisis. Se estudiaron las potenciales aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático, entre ellas se estudió por su compatibilidad y estabilidad frente a detergentes comerciales (7 mg/ml) como Ariel y Skip, observándose que éste retiene más de 70 % de su actividad proteolítica inicial después de 1 h de incubación a 40ºC. La simulación de lavado reveló que el extracto era capaz de eliminar eficazmente las manchas de sangre. Se estudió también la posibilidad de utilizar este extracto enzimático en la recuperación de plata a partir de placas radiográficas usadas. En dosis de enzima de 6,9 U azoc/ml y a 60ºC, la eliminación completa de la capa de gelatina con la liberación completa de las partículas de plata se alcanzó en 6 min a pH 9.0. Por último, P. lilacinum además de producir enzimas queratinolíticas con la producción de paralela de amonio, mostró la capacidad producir sideróforos y ácido indolacético (IAA) al crecer con residuo pelo como sustrato en presencia de Trp y baja concentración de hierro. Se realizaron ensayos a nivel de invernadero con plantas de tomate, encontrándose que, en términos de peso seco, el hidrolizado mostró un efecto similar al del fertilizante de referencia. Además, el hidrolizado demostró poseer actividad antifúngica contra varios patógenos de las plantas. Estos resultados indican el potencial biotecnológico tanto del extracto enzimático como el de la enzima pura de P. lilacinum siendo interesante además la capacidad del hongo de producir esta enzima utilizando un como sustrato un residuo de valor nulo, con lo cual sería de esperar que su costo de producción resulte relativamente bajo.

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Resumo: A utilização de produtos naturais pela humanidade, como agentes terapêuticos, é descrita desde primórdios da antiguidade e representam um importante aliado no tratamento de doenças. Com isso a busca por novas ferramentas analíticas mais robustas, com abordagem metabolômica se faz necessária, de forma a otimizar e acelerar a busca por novas moléculas e substâncias com atividade biológica promissora. Nesse contexto, esse trabalho tem como alvo de estudo, os fungos Fusarium solani e Purpureocillium lilacinum isolados da rizosfera de Senna spectabilis. Essas espécies de microrganismos apresentam muitos estudos químicos relatados na literatura, o que influenciou o interesse em realizar os estudos de OSMAC (One Strain Many Compounds). Para, assim, verificar a variação metabólica que acontece com esses fungos em diferentes tipos de cultivo (variando meio de cultura e agitação) incluindo o co-cultivo. Para os extratos obtidos também foram realizados os ensaios biológicos citotóxico e antibacteriano. Foram utilizadas ferramentas analíticas do estado da arte como GC-MS (Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas) e LC-MS (Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas) fazendo uso das ferramentas de bioinformática Molecular Networking (ou Rede Molecular) com a plataforma GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking) e o UNIFI (Sistema de informação científica – Waters Corporation). A espectrometria de massas (MS) foi uma grande aliada que ajudou a d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of natural products by mankind, as therapeutic agents, has been described since ancient times and represents an important ally in the treatment of diseases. Thus, the search for new more robust analytical tools, with a metabolomic approach is necessary, in order to optimize and accelerate the search for new molecules and substances with promising biological activity. In this context, this study is aimed at studying Fusarium solani and Purpureocillium lilacinum fungi isolated from the rhizosphere of Senna spectabilis. These species of microorganisms have many chemical studies reported in the literature, which influenced the interest in carrying out the studies of OSMAC (One Strain Many Compounds). Thus, to verify the metabolic variation that happens with these fungi in different types of cultivation (varying culture medium and agitation) including co-culture. For the extracts obtained, cytotoxic and antibacterial biological tests were also performed. State-of-the-art analytical tools such as GCMS (Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry) and LC-MS (Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry) were used alongside the bioinformatics tools Molecular Networking with the platform GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking) and UNIFI (Scientific Information System - Waters Corporation). Mass spectrometry (MS) was a great ally that helped to demonstrate the variation of the metabolites profile of these microorganisms in different cultures, in whic... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor