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Massenspektrometrische Charakterisierung von labilen Protein- und Peptidphosphorylierungen

Penkert, Martin 14 June 2019 (has links)
Kovalente posttranslationale Modifikationen (PTMs) beeinflussen die Struktur und Funktion von Proteinen. Zu den bedeutendsten PTMs zählt die Proteinphosphorylierung. Labile Phosphorylierungen an Cystein- und Lysinresten, sowie Pyrophosphorylierungen an Serin- und Threoninbausteinen sind vermehrt in den Fokus der Wissenschaft gerückt. Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Massenspektrometrie (MS) bleibt die Analyse dieser empfindlichen Modifikationen mittels Tandem-MS eine große Herausforderung. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Elektronentransferdissoziation (ETD) in Kombination mit zusätzlicher HCD Aktivierung (EThcD) in der Lage ist, Peptide mit labilen Phosphorylierungen in der Seitenkette unter Erhalt der Modifikation zu fragmentieren. In verschiedenen proteomischen Ansätzen wird demonstriert, dass EThcD eine zweifelsfreie Identifizierung natürlich vorkommender Cysteinphosphorylierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde unter dem Gesichtspunkt der Labilität von Lysinphosphorylierungen ein bottom-up-Phosphoproteomikansatz etabliert. Das MS-Verfahren beruht auf der Generierung eines diagnostischen Phospholysinimmoniumions, welches im zweiten Schritt die Erfassung eines zusätzlichen EThcD-Spektrums desselben Precursorions veranlässt (triggert). Darüber hinaus wird im Zuge dieser Arbeit gezeigt, dass sich pyrophosphorylierte Peptide unter CID-Bedingungen in ihrem Neutralverlustmuster von isobaren diphosphorylierten Peptiden unterscheiden. Dieses Verhalten stellt einen Schlüsselschritt in einer neutralverlustgetriggerten EThcD Methode dar, welche die zweifelsfreie Identifizierung von Pyrophosphorylierungen ermöglicht. Darauf basierend konnten in Hefezellen und humanen embryonalen Nierenzellen die ersten Proteinpyrophosphorylierungen, einer neuen endogenen posttranslationalen Modifikation, nachgewiesen werden. / Covalent posttranslational modifications (PTMs) influence the structure and function of proteins. Protein phosphorylations belong to the most important PTMs. Rarely characterized labile phosphorylations, for instance phosphorylations of cysteine and lysine and pyrophosphorylations of serine and threonine residues got into the focus of science. However, the analysis of those delicate modifications via tandem mass spectrometry remains a challenge. In the present work, it is shown that electron-transfer dissociation (ETD) combined with HCD supplemental activation (EThcD) is able to fragment peptides with labile phosphorylations at the side chains without losing the modification. In several bottom-up proteomic approaches, EThcD allowed the reliable identification of a naturally occurring cysteine phosphorylation. Moreover, methods for identification of lysine phosphorylations were developed. For the proteome wide analysis of lysine phosphorylations, considering the lability, a bottom-up phosphoproteomic approach with a highly selective mass spectrometry method was established. The MS-method relies on the generation of diagnostic phospholysine immonium ions during HCD, which trigger in a second step an additional EThcD spectrum of the same precursor ion. This strategy ensures the confident identification of lysine phosphorylated peptides. Furthermore, the present work shows that isobaric pyro- and diphosphorylated peptides differ in their neutral loss pattern during CID. This behavior was a key step in a specific neutral loss triggered EThcD method, which enabled the reliable identification of pyrophosphorylations. This method allowed the identification of the first protein pyrophosphorylations, a new endogenous PTM, in yeast and human embryonic kidney cells.
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Unconventional signaling properties of inositol pyrophosphates

Kurz, Leonie 22 November 2024 (has links)
Inositolpyrophosphate (PP InsPs) sind Signalmoleküle in eukaryotischen Zellen, die u.a. als Sensoren für ATP- und Phosphat fungieren, und insbesondere durch allosterische Regulation und posttranslationale Modifikationen (PTMs) wirken. Diese Arbeit ist in zwei Teile unterteilt, die sich auf zwei verschiedene ungewöhnliche Eigenschaften dieser Moleküle konzentrieren. Der erste Teil untersucht PP-InsPs in Lösung, mit Schwerpunkt auf ihrer Fähigkeit, abhängig von pH und Metallionen ihre Konformation zu ändern. Diese Eigenschaft ist einzigartig unter biologisch vorkommenden kleinen Molekülen. Drei eng verwandte Moleküle, InsP6, 5PP InsP5 und InsP8, wurden mittels NMR Spektroskopie charakterisiert, um herauszufinden, ob sie unter annähernd zytosolischen Bedingungen ihre Konformation ändern können. Dies war der Fall für InsP8, welches deshalb bezüglich Protonierung und Komplexbildung genauer untersucht wurde. Zu guter Letzt konnten ITC Experimente demonstrieren, dass eine Lösungsumgebung, die die Konformationsänderung von InsP8 begünstigt, auch seine Bindung an eine damit interagierende Proteindomäne verstärkt. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Pyrophosphorylierung von Proteinen, einer PTM, die nach derzeitigem Wissen non-enzymatisch von PP InsPs auf phosphorylierte Aminosäurereste übertragen wird – im Gegensatz zur enzymatischen Phosphorylierung durch Kinasen. Ein Probenvorbereitungsprotokoll zum Nachweis von endogener Pyrophosphorylierung in Zellen wurde entwickelt und mit synthetischen Standardpeptiden validiert. Anschließend wurde es an drei menschlichen Zelllinien erprobt, und konnte über einhundert Modifikationsstellen identifizieren, zumeist auf Proteinen im Zellkern. Dies beweist zum ersten Mal die Existenz von endogener Pyrophosphorylierung. Proteomics an Knockout-Zelllinien bestätigten die Hypothese, dass Pyrophosphorylierung von 5PP-InsP5 (InsP7) abhängig ist. Mikroskopie und qPCR-Experimente lieferten Hinweise auf eine Funktion in der Regulation der Ribosomenbiogenese. / Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are messenger molecules in eukaryotic cells, that serve as sensors of phosphate and ATP, among other functions, signaling e.g. through allosteric regulation and posttranslational modifications. This work is structured into two parts, focusing on two different unusual features of these molecules. The first part investigates PP-InsPs in solution, with emphasis on the messengers’ ability to undergo a pH and metal ion dependent conformational change, a feature unique among biological small molecules. Three closely related molecules, InsP6, 5PP InsP5 and InsP8 were characterized by NMR, to determine if they could change conformation under conditions approximating a cytosolic environment. This was the case for InsP8, which was therefore studied in more detail regarding protonation and complexation. Finally, ITC experiments showed that solution conditions favoring the conformational change of InsP8 also improved its binding to a known interacting protein domain. The second part of the thesis is concerned with protein pyrophosphorylation, a post-translational modification thought to be transferred non-enzymatically from PP InsPs to phosphorylated amino acid residues – opposed to the usual enzymatic phosphorylation through kinases. A sample preparation workflow for detection of endogenous pyrophosphorylation in cells has been developed and validated using synthetic standard peptides. It was then applied to three human cell lines, discovering more than one hundred modified sites, mostly on nuclear proteins, and proving for the first time the existence of endogenous pyrophosphorylation. Proteomics on knockout cell lines confirmed the hypothesis that pyrophosphorylation depends on 5PP-InsP5 (InsP7). Finally, microscopy and qPCR experiments suggested a regulatory role in ribosome biogenesis.

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