Water crises are predicted to be amongst the risks of highest concern for the next ten years, due to availability, accessibility, quality and management issues. Knowledge of the microbial communities indigenous to drinking water is essential for treatment and distribution process control, risk assessment and infrastructure design. Drinking water distribution systems (DWDSs) ideally should deliver to the consumer water of the same microbial quality as that leaving a treatment plant (“biologically stable” according to WHO). At the start of this Ph.D. program water microbiology comprised conventional culturedependent methods, and no studies were available on microbial communities from source to tap. A method combining 16S rRNA gene pyrosequencing with flow cytometry was developed to accurately detect, characterize, and enumerate the microorganisms found in a water sample. Studies were conducted in seven fullscale Dutch DWDSs which transport low-AOC water without disinfectant residuals, produced from fresh water applying conventional treatment. Full-scale studies were also conducted at the desalination plant and DWDS of KAUST, Saudi Arabia where drinking water is produced from seawater applying RO membrane treatment and then transported with chlorine residual. Furthermore, biological stability was evaluated in a wastewater reuse application in the Netherlands. When low-AOC water was distributed without disinfectant residuals, greater bacterial richness was detected in the networks, however, temporal and spatial variations in the bacterial community were insignificant and a substantial fraction of the microbiome was still shared between the treated and transported water. This shared fraction was lower in the system transporting water with chlorine residual, where the eukaryotic community changed with residence time. The core microbiome was characterized and dominant members varied between the two systems. Biofilm and deposit-associated communities were found to drive tap water microbiology regardless of water source and treatment scheme. Network flushing was found to be a simple method to assess water microbiology. Biological stability was not associated with safety. The biological stability concept needs to be revised and quantified. Further research is needed to understand microbial functions and processes, how water communities affect the human microbiome, and what the “drinking” water microbiome is like in undeveloped countries. / The research presented in this doctoral dissertation was financially supported by and conducted in collaboration with Delft University of Technology (TU Delft) and Evides Waterbedrijf in the Netherlands.

No description available.

No description available.

A narrow germplasm base and a complex allotetraploid genome have historically made the discovery of single nucleotide polymorphism (SNP) markers difficult in cotton (Gossypium hirsutum). We conducted a genome reduction experiment to identify SNPs from two accessions of G. hirsutum and two accessions of G. barbadense. Approximately 2 million sequence reads were assembled into contigs with an N50 of 508 bp and analyzed for SNPs. A total of 11,834 and 1,679 SNPs between the accessions G. hirsutum and G. barbadense, respectively, were identified with highly conservative parameters (a minimum read depth of 8x at each SNP and a 100% identity of all reads within an accession at the SNP). Additionally, 4,327 SNPs were identified between accessions of G. hirsutum in and assembly of Expressed Sequence Tags (ESTs). 320 and 252 KASPAR assays were designed for SNP mapping in non-genic and genic regions respectively. 187 markers in total (136 non-genic, 51 genic) were mapped using KBioscience KASPar genotyping assays in a segregating F2 population using the Fluidigm EP1 system. EST The target genome of EST markers was successfully predicted bioinformaticly diploid reference sequences. Examination of nucleotide substitutions and SNP frequencies further confirms validity of new markers. A genetic map was constructed using a large G. hirsutum segregating F2 population. Genetic maps generated by these newly identified markers will be used to locate quantitative, economically important regions within the cotton genome.

No description available.

Eine Monotherapie mit Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) stellt eine hoch effiziente Therapie-option für multipel vorbehandelte Patienten mit chronischer Hepatitis-B-Virusinfektion (HBV) dar. Eine Resistenz gegen TDF wurde bislang nicht beschrieben, jedoch wird ein möglicher negativer Einfluss von Adefovir dipivoxil (ADV)-Resistenzvarianten auf die TDF-Ansprechrate diskutiert. Diese retrospektive Kohortenstudie untersucht die Dynamik von Nukleos(t)id-Analoga (NA)-Resistenzvarianten im HBV-Polymerasegen mit Fokus auf ADV-Resistenzvarianten bei 18 chronisch HBV-infizierten Patienten mit Therapieversagen auf eine vorangegangene Lamivudin (LAM)- und ADV-Therapie, sowie nur partiellem Therapieansprechen auf eine TDF-Monotherapie. Zur Detektion von NA-Resistenzvarianten wird eine HBV-Genomsequenzierung mit Tiefenpyrosequenzierung (Genome Sequencer FLX, Roche Diagnostics, Germany) (UDPS), direkte Sequenzierung (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing Sys-tem, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) (TG) und Line Probe Assay (INNO-LiPa DRv2 und v3, Innogenetics, Belgium) (INNO-LiPA) durchgeführt. Unter TDF kommt es zu einer quantitati-ven Shift zugunsten der ADV-Resistenzvarianten mit konstant bleibendem Anteil und deutlich höher persistierender Virämie zu Monat 12 im Vergleich zu Patienten ohne ADV-Resistenzvarianten. Vor allem werden die Varianten rtA181V und rtN236T selektiert, jedoch nicht die Variante rtA181T. Die absolute Anzahl der LAM-Resistenzvarianten hingegen halbiert sich. Varianten mit einem initial per UDPS detektierten Anteil von >20% der patientenspezifi-schen HBV-Population werden meist selektiert und nehmen im Verlauf den Hauptanteil der Quasispezies ein. UDPS stellte ein potentes Medium der Detektion, Identifikation und Quantifi-zierung von HBV-Varianten dar und ist INNO-LiPa und TG überlegen. Es ergibt sich kein Hin-weis auf TDF-Resistenzvarianten, jedoch zeigt das Vorliegen von ADV-Resistenzvarianten ei-nen tendentiell negativen Einfluss auf die virale Kinetik. Weitere größere Langzeitstudien sind zur Bestätigung dieser Beobachtung notwendig. / Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) is a highly efficient treatment option for nucleos(t)ide analogue (NA) pre-treated patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Little is known about the reasons for persistent virus replication in some rare cases. As of today, no TDF resistance variants have been identified, but a possible linkage to Adefovir dipivoxil (ADV) resistance associated variants negatively influencing HBV-DNA suppression by TDF has been suspected, based on the similarity of the chemical structure. In this retrospective cohort study the dynamics of NA resistance variants in the HBV polymerase gene with focus on ADV resistance variants were assessed. For this, we have chosen a cohort including patients with multiple failures to treatment with different NAs. Thus, data of 18 patients with previous treatment failure to LAM and ADV was analysed, showing a persistent viremia (HBV-DNA >35 copies/mL) despite switch to TDF monotherapy (median HBV-DNA at month 12 3,5±0,8 (2,1-4,9) log10 copies/mL). Sequencing analysis was performed with ultra-deep pyrosequencing (UDPS) (Genome Sequencer FLX, 454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT), direct sequencing (TG) (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) and line probe assay (INNO-LiPA) (INNO-LiPa DRv2/v3, Innogenetics, Belgium). Using TDF monotherapy, a quantitative shift in favour to ADV resistance variants was observed in this cohort. The percentage of substitutions conferring resistance to ADV at baseline (BL) and at the time of the last sequencing endpoint (EP) of the HBV genome remained constant (BL 35%, 13/37, EP 36%, 9/25). The variants rtA181V and rtN236T were mostly selected, whereas rtA181T was not selected. The total amount of substitutions conferring resistance to Lamivudin (LAM) showed a strong decline, however remained the majority part of all NA resistance variants (BL 51% (19/37), EP 40% (10/25)). The percentage of ETV resistance variants increased slightly (BL 14% (5/37), EP 24% (6/25)). Known ADV, Lam and ETV resistance variants emerged in variable abundance (1,0-99,6%) of quasispecies during TDF therapy. A homogenization of HBV quasispecies took place. Especially mutations occurring in higher abundance (>20% of viral population) were mostly selected (BL 51% (19/37), EP 80% (20/25)). No new HBV variants with possible association to resistance against TDF were identified, but patients with ADV resistance variants showed the highest HBV-DNA level at month 12 of TDF therapy (median HBV-DNA 3,57±0,72 (2,14-3,96) log10 copies/mL, not significant). A negative influence of ADV resistance variants on viral suppression with TDF monotherapy may be assumed, however more long-term studies are needed to confirm the role of ADV resistance variants in TDF therapy. UDPS is a potent medium for detection, identification and quantification of dominant to low level variants in HBV-DNA. It is superior to direct sequencing and line probe assay in the detection of variants.

Dans cette étude de trois lacs sujets aux efflorescences de cyanobactéries, nous avons examiné la diversité des bactéries diazotrophes et des cyanobactéries toxiques. Nous avons tenté de définir les facteurs environnementaux influençant la composition des communautés phytoplanctoniques, la concentration ainsi que la composition des microcystines (MCs). Nous avons émis l’hypothèse que l’azote jouerait un rôle majeur dans le façonnement des communautés cyanobactériennes et influencerait la concentration et composition des MCs. Des concentrations de cette toxine ainsi que le gène mcyE codant pour l’enzyme microcystine synthétase ont été détectés à chaque échantillonnage dans tous les lacs. L’azote, particulièrement sous sa forme organique dissoute (AOD) ainsi que la température de l’eau étaient les facteurs environnementaux expliquant le mieux les concentrations des MCs, tandis que la biomasse de Microcystis spp. était globalement le meilleur prédicteur. Le gène nifH codant pour l’enzyme nitrogénase (fixation d’azote) a aussi été détecté dans chaque échantillon. Malgré les concentrations faibles en azote inorganique dissous (AID) et les densités importantes d’hétérocystes, aucun transcrits du gène n’a été détecté par réverse-transcription (RT-PCR), indiquant que la fixation d’azote n’avait pas lieu à des niveaux détectables au moment de l’échantillonnage. De plus, le pyroséquençage révèle que les séquences des gènes nifH et mcyE correspondaient à différents taxons, donc que les cyanobactéries n’avaient pas la capacité d’effectuer les deux fonctions simultanément. / In this study of three eutrophic lakes prone to cyanobacterial blooms, we examined the diversity of diazotrophic bacteria and toxic cyanobacteria. We evaluated the environmental factors effects on the community composition, the concentration and composition of the family of toxins microcystins (MCs). Since the assimilation of nitrogen and the synthesis of MCs in cyanobacteria are thought to be under the same control of the NtcA transcriptor, we hypothesised that nitrogen played a major role in shaping cyanobacterial communities and influenced indirectly the concentration and composition of MCs. The mcyE gene coding for the microcystin synthetase enzyme and MCs concentrations were detected at each sampling date in all lakes. Nitrogen, particularly under its organic dissolved form (DON) as well as water temperature were the environmental factors explaining the most variation in MC concentration although Microcystis spp. biomass was overall the best predictor. The nifH gene coding for the nitrogenase enzyme (N2-fixation) was also detected at all times. Even though the concentrations of dissolved inorganic nitrogen were relatively low, and that heterocysts were present in high densities, no nifH transcripts were detected by RT-PCR, indicating that no N2-fixation was going on at detectable levels at the time of sampling. Moreover, pyrosequencing revealed that sequences of the genes nifH and mcyE corresponded to different taxa, thus cyanobacteria did not have the capacity to perform both functions simultaneously.

Les champignons endophytes sont des organismes qui vivent à l’intérieur de plantes sans causer de symptômes de maladie apparents. Ils sont trouvés dans virtuellement toutes plante, et la nature des interactions peut aller de mutualiste à pathogène dépendant des conditions. La diversité et la structure des communautés des champignons endophytes dans les plantes poussant en milieu extrêmement pollué, ainsi que leur rôle potentiel pour améliorer la phytorémédiation, demeurent peu compris. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux communautés de champignons endophytes de racines de deux espèces de plantes (Eleocharis erythropoda et Populus sp.). Ces espèces poussaient de manière spontanée dans trois bassins de sédimentation d’un ancienne usine pétro-chimique ayant des niveaux de contaminations différents, en utilisant à la fois une approche d’isolation d’organisme ainsi que des analyses de pyroséquençage de l’ITS d’ADN ribosomal. Nos résultats indiquent que les niveaux de contamination ont un effet significatif sur la composition taxonomique des champignons endophytes des racines de E. erythropoda. Une majorité des données de séquences appartiennent à la classe des Dothideomycetes dans les échantillons de forte concentration en hydrocarbures pétroliers, dont une majorité appartient au genre Alternaria. La comparaison des données d’isolation et de pyroséquençage suggère que l’isolation de souches ne permet pas l’obtention des souches les plus représentées dans les données de pyroséquençage. Ces résultats pourront potentiellement aider à l’élaboration de stratégies pour améliorer la phytorémédiation en utilisant les champignons endophytes. / Endophytic fungi are organisms that live inside plant tissues without any apparent disease symptoms. They are found in virtually all plant species and their interactions can vary widely from mutualism to parasitism depending chiefly on environmental conditions and stresses. The diversity and community structure of fungal endophytes in extremely polluted sites and their role in phytoremediation remain largely unexplored. In this study we investigated the community structure of endophytic fungi in roots of two plant species (Eleocharis eryhtropoda and Populus sp.) growing spontaneously in three petroleum-contaminated sedimentation basins of a former petro-chemical plant with different contamination levels. We used both a culture-dependent method of strain isolation as well as a culture-independent method of pyrosequencing of ITS ribosomal DNA. Our results indicate that levels of contamination shape the taxonomic composition of endophytic fungi in E. erythropoda roots. A majority of the reads belonged to the Dothydeomycetes class in smaples from high petroleum-hydrocarbon levels, with the Alternaria genus accounting for the majority of these reads. In addition comparison between culture-dependent and -independent methods showed that strain isolation does not promote the most abundant species found in pyrosequencing. This could help to develop strategies for improving phytoremediation using fungal endophytes.

La biohydrogénation (BH) ruminale des acides gras polyinsaturés (AGPI) est à l'origine de la production d'intermédiaires trans retrouvés dans les productions de ruminants (essentiellement le lait). Il existe deux voies de BH produisant des acides gras (AG) trans qui auraient des propriétés différentes : les isomères t11 auraient des effets bénéfiques pour la santé des consommateurs et les isomères t10 seraient responsables d'une forte diminution du taux butyreux du lait, représentant une contrainte majeure pour les éleveurs. Dans des conditions physiologiques normales, la voie t11 est fortement majoritaire, par contre avec des rations à base d'ensilage de maïs, riches en concentrés et surtout si elles comprennent des suppléments lipidiques riches en AGPI, une déviation de la voie t11 à la voie t10 peut se produire avec une augmentation significative des isomères t10 au détriment des isomères t11. L'objectif de cette thèse est d'expliquer les modalités de cette déviation, afin de mieux la maîtriser en élevage. Nos travaux permettent de conclure que les facteurs alimentaires de maîtrise de la déviation de la voie t11 vers la voie t10, sont la teneur en amidon rapidement fermentescible et la teneur en c9,c12-C18:2. Lorsque la quantité de c9,c12-C18:2 présente dans le rumen est faible, même avec une ration riche en amidon et un pH bas dans le rumen, la déviation n'a pas lieu, la voie t11 suffisant à assurer l'hydrogénation des AGPI puisque dans ces conditions, la ∆9 isomérisation est elle aussi peu efficace à pH bas. En revanche, lorsqu'en plus de l'amidon, du c9,c12-C18:2 est ajouté dans la ration, la voie t11 devient insuffisante et c'est la voie t10 qui prend le relais. Le pyroséquençage 454 couplé à une régression multiple SPLS nous ont permis d'établir des corrélations entre les taxons identifiés et la proportion d'AG (t10 ou t11) dans le rumen. Il s'avère que les genres bactériens corrélés fortement et positivement aux AG t10 sont plus ou moins impliqués dans le métabolisme ruminal du lactate ainsi qu'au faible pH ruminal. Cependant, l'identification des taxons les plus corrélés aux AG t11 était moins précise, elle s'arrête à l'ordre des Clostridiales. Enfin, dans des conditions de déviation de la voie t11 à la voie t10, l'addition de vitamine E dans la ration des vaches n'a pas permis de restaurer un ratio déjà élevé. Ces résultats ont abouti à une meilleure compréhension de cette déviation et orientent vers une meilleure maîtrise en élevage. / Rumen biohydrogenation (BH) of polyunsaturated fatty acids (PUFA) is responsible of the production of trans intermediates found in ruminant products (mainly milk). There are two BH pathways leading to trans fatty acids (FA) with different biological properties: t11 isomers have beneficial effects for consumer's health and t10 isomers result in low milk fat content, representing a major constraint for farmers. In most conditions, t11 FA are the major trans FA, but in some conditions, especially with diets based on corn silage and including lipid supplements rich in PUFA, a shift from t11 to t10 pathway can occur with a significant increase of t10 isomers at the expense t11 isomers. The objective of this work was to explain modalities of this shift to better control it in animal production. Our results demonstrated that dietary factors responsible of the shift from t11 to t10 pathway are starch rapidly fermentable and c9, c12-C18:2 contents. When the amount of c9, c12-C18:2 present in the rumen is low, even though the diet is rich in starch and the pH is low in the rumen, the shift does not occur, t11 pathway being sufficient to ensure the hydrogenation of PUFA since in these conditions, the 9 isomerization is also poorly effective at low pH. However, when c9, c12-C18:2 is supplemented to the diet in addition to starch, t11 pathway becomes insufficient for FA BH, and t10 pathway becomes dominant. 454 pyrosequencing coupled to a multiple sPLS regression allowed us to establish correlations between some identified taxa and FA proportions (t10 or t11) in the rumen. It appears that bacterial genera that are strongly and positively correlated with t10 FA are more or less involved in the metabolism of ruminal lactate and also positively correlated with a low ruminal pH. However, identification of taxa correlated with t11 FA was less accurate, stopping at Clostridiales order. Finally, once the shift occurred, the subsequent addition of vitamin E was not able to counteract this process. These results lead to a better understanding of this shift to better control it in animal livestock.

La lutte pour les ressources est un phénomène qui a débuté dès l'apparition d'organismes reproductifs et dont la description a été initiée par Malthus puis remarquablement synthétisée et étendue à la biologie sous le terme d'évolution par Darwin en 1859 dans « De l'origine des espèces ». Si le concept est ancien à l'échelle des sciences biologiques, il continue à caractériser des domaines à l'époque insoupçonnés par son auteur tels que la virologie. En effet, les virus hautement variables tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), de l'hépatite B (VHB) et de l'hépatite C (VHC) sont présents sous forme de quasi espèce au sein de leur environnement réplicatif, c'est à dire qu'une multitude de virus génétiquement proche mais distincts coexistent au sein de cet espace qu'ils doivent partager selon les mêmes règles générales que les êtres vivants. Ainsi, lorsque des pressions de sélection s'exercent (immunitaires, antivirales…), une redistribution des variants majoritaires est observé au bénéfice de variants minoritaires mieux adaptés à cet environnement changeant. La modélisation mathématique et informatique de la capacité mutationnelle et la dynamique d'adaptation des variants minoritaires au travers de 6 études de cohortes de patients infectés, par la technique ultra-sensible de pyroséquençage haut débit associée à des logiciels originaux ont permis de mettre en évidence, caractériser et évaluer l'impact de marqueurs diagnostics permettant de prédire la résistance aux antiviraux mais aussi de caractériser de nouvelles cibles antivirales. / Struggle for resources is a worldwide rule which has been first described by Malthus and extended to whole world of living organisms by Darwin in 1859 in “Origin of species”. Today, this concept has been enlarged to virological field, and is particularly adapted to describe highly variable viruses like Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B Virus (HBV) and Hepatitis C Virus (HCV) which have a quasispecies distribution in infected patients characterized by the co-existence of a number of distinct but related viral populations. Selection pressure on viral replicative environment (immune, antiviral drug treatment…), generally lead to a redistribution of the viral quasispecies with an increasing of the best adapted minor viral variants at the expense of major viral populations. Mathematical and bioinformatic modelization of this phenomenon through 6 infected patients cohorts by means of ultra-deep sequencing and an original bioinformatic package allowed discovery, characterization and evaluation of new diagnostic markers that could be used to prevent resistance emergence to antiviral drugs and to characterized new therapeutics antiviral targets.