Self-assembly of polysaccharide derivatives at liquid/solid interfaces was studied by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). Carboxymethyl cellulose (CMC) adsorption onto cellulose surfaces from aqueous solutions was enhanced by electrolytes, especially by divalent cations. A combination of SPR and QCM-D results showed that CMC formed highly hydrated layers on cellulose surfaces (90 to 95% water by mass). Voigt-based viscoelastic modeling of the QCM-D data was consistent with the existence of highly hydrated CMC layers with relatively low shear viscosities of ~ 10-3 N·s·m-2 and elastic shear moduli of ~ 105 N·m-2. Adsorption of pullulan 3-methoxycinnamates (P3MC) and pullulan 4-chlorocinnamates (P4CC) with different degrees of cinnamate substitution (DSCinn) onto cellulose, cellulose acetate propionate (CAP), poly(L-lactic acid) (PLLA), and methyl-terminated self-assembled monolayer (SAM-CH3) surfaces was also studied by SPR and QCM-D. Hydrophobic cinnamate groups promoted the adsorption of pullulan onto all surfaces and the adsorption onto hydrophobic surfaces was significantly greater than onto hydrophilic surfaces. SPR and QCM-D results showed that P3MC and P4CC also formed highly hydrated layers (70 to 90% water by mass) with low shear viscosities and elastic shear moduli. Finally, cellulose adsorption and activity on pullulan cinnamate (PC) and cellulose blend films were studied via QCM-D and in situ atomic force microscopy (AFM). The hydrophobicity of PC surfaces was controlled by adjusting the degree of cinnamate substitution per anhydroglucose unit (DSCinn). It was found that cellulase showed weak adsorption onto low DSCinn PC surfaces, whereas cellulase adsorbed strongly onto high DSCinn PC surfaces, a clear indication of the role surface hydrophobicity played on enzyme adsorption. Moreover, cellulase catalyzed hydrolysis of cellulose/PC and cellulose/polystyrene (PS) blend surfaces was studied. The QCM-D results showed that the cellulase hydrolysis rate on cellulose in cellulose/PC blend surfaces decreased with increasing DSCinn. AFM images revealed smooth surfaces for cellulose/PC (DSCinn = 0.3) blend surfaces and laterally phase separated morphologies for cellulose/PC (DSCinn ≥ 0.7) blend surfaces. The combination of QCM-D and AFM measurements indicated that cellulase catalyzed hydrolysis was strongly affected by surface morphology. The cellulase hydrolysis activity on cellulose in cellulose/PS blend surfaces was similar with cellulose/PC blend surfaces (DSCinn ≥ 0.7). These studies showed self-assembly of macromolecules could be a promising strategy to modify material surfaces and provided further fundamental understanding of adsorption phenomena and bioactivity of macromolecules at liquid/solid interfaces. / Ph. D.

Durch die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ist es erfolgreich gelungen die beiden gram-positiven Mikroorganismen Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 unter geregelten und idealen Kultivierungsbedingungen im Bioreaktor in hinreichenden Biomasseausbeuten zu kultivieren. Aus der Biomasse beider Stämme ist es anschließend gelungen, die primären Zellwandkomponenten bestehend aus Membranlipiden, Peptidoglykan mit sekundären Zellwandpolymeren und S-Layer-Proteinen in reiner Form und in guten Ausbeuten zu extrahieren. Diese Zellwandkomponenten wurden dann unter Verwendung von biochemischer und strukturanalytischer Methoden charakterisiert. Dabei ist es erstmals gelungen, die Membranlipide beider genutzter Mikroorganismen in Bezug auf deren Zusammensetzungen der enthalten hydrophoben Fettsäuren und der hydrophilen phosphathaltigen Kopfgruppen zu charakterisieren. Durch die vergleichend durchgeführten Metallbindungsversuche im Batch-Verfahren konnten Bindungspräferenzen intakter Zellen von Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 und deren isolierten Zellwandkomponenten mit den Metallen As, Au, Cd, Eu, Pb, Pd, Pt bzw. U untersucht werden. Dabei konnten sowohl in den Untersuchungen intakter Zellen und der primären Zellwandbestandteile deutlich höhere Metallsorptionsraten und Metallentfernungseffizienzen für Lysinibacillus sphaericus JG-B53 festgestellt werden als dies bei Lysinibacillus sphaericus JG-A12 nachzuweisen war. Dies macht diesen Stamm für potentielle technische Anwendungen als metallselektives biosorptives Material weitaus interessanter. Die Untersuchungen der Einzelkomponenten in Suspension lieferten jedoch nur begrenzt Informationen zur Interaktion der Metalle mit den Schichten wie sie unter natürlichen Bedingungen in der Zelle vorkommen. Daher wurden unter Verwendung der QCM-D erstmals die primären Zellwandkomponenten beider Mikroorganismen (S-Layer und Peptidoglykan) sowie von Referenzlipiden an Grenzflächen erfolgreich im nanoskaligen Bereich abgeschieden und online verfolgt. Dadurch war es möglich vereinfachte Einzelschichtsysteme der gram-positiven bakteriellen Zellwand nachzubilden. In den Untersuchungen konnten stabile Schichten generiert werden, welche vergleichbar zu dem Schichtsystem vitaler Zellen sind. Zusätzlich konnte bei den Abscheidungen der S-Layer-Proteine SlfB und Slp1 der positive Effekt von Polyelektrolytmodifizierungen auf das Rekristallisationsverhalten, die Schichtstabilität und den Bedeckungsgrad auf der technischen Oberfläche aufgezeigt werden. Zur Untersuchung der Metallinteraktion zellulärer Einzelschichtsysteme wurden in dieser Arbeit exemplarisch nach den erfolgreichen Untersuchungen zur Rekristallisation, die S-Layer-Proteine als erste Interaktionsschicht des Gesamtzellsystems mit der QCM-D untersucht. Diese stabilen und intakten Schichten konnten analog zu den Schichtuntersuchungen der reinen biologischen Komponenten und nach den QCM-D Metallinteraktionsstudien mit den S-Layer Strukturen mittels der Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht und bildgebend dargestellt werden. In weiteren spektroskopischen Untersuchungen (TRLFS) der Zellwandkomponenten konnten die lumineszierenden Eigenschaften von Europium ausgenutzt werden, um das Metallbindungsverhalten der einzelnen Komponenten als auch des Gesamtsystems der Zellen beider Mikroorganismen zu bestimmen. Somit konnte Europium als spektroskopische Sonde eingesetzt werden um Rückschlüsse die Biomolekül-Metallwechselwirkungen zu ermöglichen. Dabei konnten vor allem mit den beiden oberflächennahen Zellschichten Lösung teilweise sehr starke Metall-Biomolekül-Wechselwirkungen beobachtet werden.

This work reports on the successful formation of supported multicomponent lipid bilayer membranes (sLBMs) from natural occurring lipids as well as synthetic lipids on a set of polymer cushions consisting of alternating maleic acid copolymers. Maleic acid copolymers provide a versatile platform to adjust the physico-chemical behaviour by the choice of the comonomer unit. The formation of sLBMs was triggered by a transient reduction of the electrostatic repulsion between the polymer cushions and the lipid vesicles by lowering the solutions pH to 4. Upon formation the stability of sLBMs was not affected by subsequent variations of the environmental pH to 7.2. Even drastic changes in the environmental pH (between pH 2 and pH 9) did not lead to delamination and proved the stability of the polymer sLBM. The degree of hydrophilicity and swelling of the anionic polymer cushions was found to determine both the kinetics of the membrane formation and the mobility of the lipid bilayer with lipid diffusion coefficients in the range from 0.26 to 2.6 µm2 s-1. An increase in cushion hydrophilicity correlated with a strong increase in the diffusion coefficient of the lipids. This trend was found to correlate with the kinetics of bilayer formation in the process of vesicle spreading. The observations strongly support the important role of the support’s polarity for the fluidity of the sLBM, which is probably related to the presence of a water layer between support and bilayer. The investigated polymer cushions are considered to open new options for the in situ modulation of lipid bilayer membranes characteristics to match the requirements for the successful integration of functional transmembrane proteins (TMPs). As each cushion exhibits different physico-chemical properties, the resulting behaviour of the sLBMs and TMPs could be exactly adjusted to the specific requirements of biological samples. This is exemplarily shown by the integration of the TMP beta amyloid precursor protein cleaving enzyme (BACE). Integrated BACE was observed to be mobile on all polymer cushions. On the contrary, no lateral mobility of BACE was found in solid sLBM. Furthermore, the activity of integrated BACE was analysed by the cleavage of an amyloid precursor protein analogue. Remarkably, the polymer cushions did not only enhance the mobility but were also found to increase the activity of BACE by a factor of 1.5 to 2.5 in comparison to solid sLBM. From the obtained results it is obvious that even small cytoplasmic domains of transmembrane proteins might not be preserved upon the integration in silica sLBM. The observed beneficial effects of the utilised polymer cushions on the mobility and activity of transmembrane proteins motivate further studies to clarify the general applicability of the polymer platform. Altogether, this polymer platform provides valuable options to form sLBM with varying characteristics to reconstitute transmembrane proteins for a wide range of possible future applications in biology. / Die vorliegende Arbeit beschreibt die Bildung von polymer unterstützten Lipiddoppelschichten zur Integration von transmembranen Proteinen. Das Polymerkissensystem besteht aus alternierenden Maleinsäurecopolymeren. Lipiddoppelschichten wurden durch die Steuerung der elektrostatischen Repulsion erzeugt: die Verringerung des pH-Wertes auf 4 wurde eine Erhöhung der adsorbierten Vesikelmenge auf den Polymeroberflächen induziert. Nach der erfolgten Bildung der Lipiddoppelschichten kann der pH-Wert beliebig variiert werden, ohne dass die Stabilität der Lipiddoppelschichten beeinflusst wird. Auch drastische Veränderungen des pH-Milieus (pH 2 - pH 9) führten zu keinen Veränderungen in der Membranintegrität. Der Grad der Hydrophilie und der Quellung der anionischen Polymerschichten beeinflusst sowohl die Bildung der Modellmembranen als auch die Mobilität der integrierten Lipidmoleküle. Dabei reichen die erzielten Lipiddiffusionskoeffizienten von 0.26 bis 2.6 µm2 s-1. Dabei ist die Mobilität direkt von der Hydrophilie des Substrates abhängig. Die beobachteten Ergebnisse zeigen deutlich die entscheidende Rolle der Polarität der verwendeten Substratoberflächen auf die Lipidmobilität, die sehr wahrscheinlich mit der Präsenz einer variablen Wasserschicht zusammenhängt. Die untersuchten Polymerkissen eröffnen neue Möglichkeiten für die insitu Modulierung der Charakteristika von Lipidschichten, um funktionale transmembrane Proteine zu integrieren. Aufgrund der unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften kann das Verhalten der Lipidschichten und der transmembranen Proteine nach den spezifischen Anforderungen des Modellsystems angepasst werden. Die funktionale Integration wurde am Beispiel des transmembranen Proteins BACE nachempfunden. Die Mobilität des integrierten BACE wurde auf allen Polymerkissen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde auf harten Substraten keine BACE Mobilität gefunden. Die Aktivität des integrierten BACE wurde durch die enzymatische Spaltung eines APP-Analogons nachgewiesen. Bemerkenswerteweise wurde ein Anstieg der BACE Aktivität auf den Polymerkissen um den Faktor 1,5 bis 2,5 im Vergleich zu den auf harten Substraten integrierten BACE beobachtet. Zusammenfassend, die verwendeten Polymerkissen bieten vielfältige Möglichkeiten Lipidschichten mit variierenden Eigenschaften für die Integration von transmembranen Proteinen zu erzeugen.

Poly(3,4-ethylendioxythiophen) (PEDOT) ist ein Kunststoff der zur Gruppe der intrinsisch leitfähigen Polymere (ILP) zählt. Aufgrund seiner chemischen und thermischen Stabilität findet er Verwendung in antistatischen Verkleidungen und als Elektrodenmaterial. PEDOT (und andere ILP) zeigen aufgrund ihrer Schaltbarkeit zwischen (reduzierten, ) neutralen und oxidierten Zuständen unterschiedliche Eigenschaften wie Leitfähigkeit, Farbe oder Viskoelastizität. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die elektrochemischen und viskoelastischen Eigenschaften von PEDOT-Filmen untersucht. Dabei wurde die Quarzmikrowaage (QCM) in Verbindung mit potentiostatischen (Potentialsprung, PS) und potentiodynamischen (Cyclovoltammetrie, CV) elektrochemischen Methoden verwendet, so dass in situ elektrochemische und mechanische Eigenschaften der Filme zugänglich waren. Zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften wurde ein Auswertealgorithmus entwickelt, welcher auf ein mathematisches Modell zur Bestimmung des Schermoduls nach Efimov zurückgreift. Während der Herstellung wurden Parameter wie Lösungsmittel, Leitsalz, Vorpolarisations- und Abscheidungspotential variiert und die erhaltenen Filme bezüglich Schermodul und Morphologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Elektrolytzusammensetzung einen entscheidenden Einfluss auf die viskoelastischen Eigenschaften der Filme besitzt, welche mit der Morphologie der Filme korrelieren. Des Weiteren wurden die Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften dieser Filme untersucht, welche während dem elektronischen Schalten zwischen neutralem und oxidiertem Zustand aufgrund des Ionenaustausches erfolgen. CV- und PS-Experimente zeigten, dass die viskoelastischen Eigenschaften durch Konzentration und pH-Wert des Elektrolyten beeinflusst werden und in unterschiedlicher Weise auf die Potentialänderungen reagieren. Durch den Einbau von Magnetit-Partikeln in die Schichten konnten Hybridfilme erhalten werden, deren Eigenschaften durch das Anlegen eines äußeren Magnetfeldes beeinflusst werden können. Solche Filme zeigten in einem äußeren Magnetfeld (0,7T) höhere Schermodule und einen stark unterdrückten Ionenaustausch.

La miniaturisation des composants microélectroniques est nécessaire pour des gains de coûts, de place ou de performance. Des capteurs de gaz, faciles d'utilisation (transportables et non encombrants) peuvent alors être envisagés et ouvrir la possibilité à la détection de certains gaz toxiques en très faible quantité (tels que les COV, composés organiques volatils) qui ne sont que trop peu détectés actuellement. Les performances d'un capteur de gaz sont en premier lieu liées à sa couche mince sensible qui permet la détection par interaction avec le gaz cible. Ces travaux se focalisent sur le développement de couches sensibles de polymères réalisées par une technique de synthèse novatrice de dépôt chimique en phase vapeur par une polymérisation amorcée in-situ (iCVD). Cette technique possède de nombreux avantages pour la réalisation de composants nanométriques comme par exemple l'absence de solvant dans son procédé ou les faibles températures mises en jeu. L'impact des paramètres du procédé iCVD sur les propriétés du film mince est dans un premier temps discuté, et le mécanisme de croissance du film mince de polymère est par la suite étudié. Pour la première fois, deux régimes de croissance sont décrits. Le premier régime, ainsi visible pour de faibles temps de dépôt, est caractérisé par une vitesse de croissance faible. Le second régime apparaît à des temps de dépôt plus important et se traduit par une vitesse de croissance plus élevée et constante dans le temps. Grâce à de nombreuses caractérisations macroscopiques et microscopiques des couches minces de poly(méthacrylate de néopentyle), un modèle pour le mécanisme de croissance de film mince de polymère est proposé. Ce régime en deux temps semble être corrélé à l'épaisseur du film mince et une épaisseur critique est identifiée. De plus, pour comprendre cette croissance, un facteur primordial est mis en évidence. En effet, la concentration en monomère sur le lieu de la polymérisation est déterminante pour la croissance et permet la réalisation des films minces maîtrisés et reproductibles, nécessaires dans le domaine des capteurs de gaz. Différents polyméthacrylates déposés en couche mince par iCVD sont testés comme couche sensible. Ces films ont permis la détection du toluène en très faible quantité (ppm) et ont l'avantage de conduire à des capteurs réversibles / Miniaturization of microelectronic devices is mandatory for cost, space and performance benefits. Easy-to-use gas sensors can then be designed and detection of low level of toxic gases can be achieved. The sensor performances are closely dependent on the sensitivity of the thin film towards the targeted gas. This study focuses on sensitive polymer thin films deposited by initiated Chemical Vapor Deposition (iCVD). This innovative deposition method has the advantage to be solvent-free and does not require high reaction temperatures, which allows its use in many fields, including nanocomponent fabrication. The iCVD process parameters are investigated and their influence on the thin film properties discussed. The study of the growth mechanism reveals an unexpected two-regime growth of the deposited films. The first regime, in the early stage of the deposition process, is characterized by a relatively slow growth. In the second regime, the growth rate slightly increases and the film thickness increases linearly with the deposition time. Based on microscopic and macroscopic data gained on poly(neopentyl methacrylate) thin films, a model for the growth mechanism of the polymer thin film is proposed. The change of regime appears to be correlated to the thin film thick-ness. This study shows the presence of a critical thickness. Moreover, the monomer concentration building up where the polymerization takes place is the most significant parameter to understand the film growth. It is also the key parameter to enable the deposition of reproducible and thickness controlled films, which is required for gas sensor applications. Finally, polymethacrylate films, obtained by iCVD, are tested as sensitive layers and low toluene gas concentration (ppm) can be detected, while the gas sensors are reversible

[EN] Different electronic interfaces have been proposed to measure major parameters for the characterization of quartz crystal microbalance (QCM) during the last two decades. The measurement of the adequate parameters of the sensor for a specific application is very important, since an error in this measure can lead to an error in the interpretation of the results. The requirements of the system of characterization depend on the application. In this thesis we propose two characterization systems for two types of applications that involve the majority of sensor applications: 1) Characterization of materials under variable damping conditions and 2) Detection of substances with high measurement resolution. The proposed systems seek to solve the problems detected in the systems currently in use. For applications in which the sensor damping varies during the experiment, we propose a system based on a new configuration of the technique of automatic capacitance compensation (ACC). This new configuration provides the measure of the series resonance frequency, the motional resistance and the parallel capacitance of the sensor. Moreover, it allows an easy calibration of the system that improves the precision in the measurement. We show the experimental results for 9 and 10 MHz crystals in fluid media, with different capacitances in parallel, showing the effectiveness in the capacitance compensation. The system presents some deviation in frequency with respect to the series resonance frequency, as measured with an impedance analyser. These deviations are due to the non-ideal, specific behaviour of some of the components of the circuit. A new circuit is proposed as a possible solution to this problem. For high-resolution applications we propose an integrated platform to characterize high-frequency acoustic sensors. The proposed system is based on a new concept in which the sensor is interrogated by means of a very stable, low-noise external source at a constant frequency, while the changes provoked by the charge in the phase of the sensor are monitored. The use of high-frequency sensors enhances the sensitivity of the measure, whereas the design characterization system reduces the noise in the measurement. The result is an improvement in the limit of detection (LOD). This way, we achieve one of the challenges in the acoustic high-frequency devices. The validation of the platform is performed by means of an immunosensor based in high fundamental frequency QCM crystals (HFF-QCM) for the detection of two pesticides: carbaryl and thiabendazole. The results obtained for carbaryl are compared to the results obtained by another high-frequency acoustic technology based in Love sensors, with the optical technique based in surface plasmonic resonance and with the gold standard technique Enzyme Linked Immunoassay (ELISA). The LOD obtained with the acoustic sensors HFF-QCM and Love is similar to the one obtained with ELISA and improves by one order of magnitude the LOD obtained with SPR. The conceptual ease of the proposed system, its low cost and the possibility of miniaturization of the quartz resonator, allows the characterization of multiple sensors integrated in an array configuration, which will allow in the future to achieve the challenge of multianalyte detection for applications of High-Throughput Screening (HTS). / [ES] Durante las dos últimas décadas se han propuesto diferentes interfaces electrónicos para medir los parámetros más importantes de caracterización de los cristales de microbalanza de cuarzo (QCM). La medida de los parámetros adecuados del sensor para una aplicación específica es muy importante, ya que un error en la medida de dichos parámetros puede resultar en un error en la interpretación de los resultados. Los requerimientos del sistema de caracterización dependen de la aplicación. En esta tesis se proponen dos sistemas de caracterización para dos ámbitos de aplicación que comprenden la mayoría de las aplicaciones con sensores QCM: 1) Caracterización de materiales bajo condiciones de amortiguamiento variable y 2) detección de sustancias con alta resolución de medida. Los sistemas propuestos tratan de resolver la problemática detectada en los ya existentes. Para aplicaciones en las que el amortiguamiento del sensor varía durante el experimento, se propone un sistema basado en una nueva configuración de la técnica de compensación automática de capacidad (ACC). La nueva configuración proporciona la medida de la frecuencia de resonancia serie, la resistencia dinámica y la capacidad paralelo del sensor. Además, permite una fácil calibración del sistema que mejora la precisión en la medida. Se presentan resultados experimentales para cristales de 9 y 10MHz en medios fluidos, con diferentes capacidades en paralelo, demostrando la efectividad de la compensación de capacidad. El sistema presenta alguna desviación en frecuencia con respecto a la frecuencia resonancia serie, medida con un analizador de impedancias. Estas desviaciones son explicadas convenientemente, debidas al comportamiento no ideal específico de algunoscomponentes del circuito. Una nueva propuesta de circuito se presenta como posible solución a este problema. Para aplicaciones de alta resolución se propone una plataforma integrada para caracterizar sensores acústicos de alta frecuencia. El sistema propuesto se basa en un nuevo concepto en el que el sensor es interrogado, mediante una fuente externa muy estable y de muy bajo ruido, a una frecuencia constante mientras se monitorizan los cambios producidos por la carga en la fase del sensor. El uso de sensores de alta frecuencia aumenta la sensibilidad de la medida, por otro lado, el sistema de caracterización diseñado reduce el ruido en la misma. El resultado es una mejora del límite de detección (LOD). Se consigue con ello uno de los retos pendientes en los dispositivos acústicos de alta frecuencia. La validación de la plataforma desarrollada se realiza con una aplicación de un inmunosensor basado en cristales QCM de alta frecuencia fundamental (HFF-QCM) para la detección de dos pesticidas: carbaryl y tiabendazol. Los resultados obtenidos para el Carbaryl se comparan con los obtenidos con otra tecnología acústica de alta frecuencia basada en sensores Love, con la técnica óptica basada resonancia superficial de plasmones (SPR) y con la técnica de referencia Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA). El LOD obtenido con los sensores acústicos HFFQCM y Love es similar al obtenido con las técnicas ELISA y mejora en un orden de magnitud al obtenido con SPR. La sencillez conceptual del sistema propuesto junto con su bajo coste, así como la capacidad de miniaturización del resonador de cuarzo hace posible la caracterización de múltiples sensores integrados en una configuración en array, esto permitirá en un futuro alcanzar el reto de la detección multianalito para aplicaciones High-Throughput Screening (HTS). / [CAT] Durant les dues últimes dècades s'han proposat diferents interfases electrònics per a mesurar els paràmetres més importants de caracterització dels cristalls de microbalança de quars (QCM). La mesura dels paràmetres adequats del sensor per a una aplicació específica és molt important, perquè un error en la interpretació dels resultats pot resultar en un error en la interpretació dels resultats. Els requeriments del sistema de caracterització depenen de l'aplicació. En aquesta tesi, es proposen dos sistemes de caracterització per a dos àmbits d'aplicació que comprenen la majoria de les aplicacions amb sensors QCM: 1) Caracterització de materials sota condicions d'amortiment variable i 2) detecció de substàncies amb alta resolució de mesura. Els sistemes proposats tracten de resoldre la problemàtica detectada en els ja existents. Per a aplicacions en les quals l'amortiment del sensor varia durant l'experiment, es proposa un sistema basat en una nova configuració de la tècnica de compensació automàtica de capacitat (ACC). La nova configuració proporciona la mesura de la freqüència de ressonància sèrie, la resistència dinàmica i la capacitat paral¿lel del sensor. A més, permet un calibratge fàcil del sistema que millora la precisió de la mesura. Es presenten els resultats experimentals per a cristalls de 9 i 10 MHz en mitjans fluids, amb diferents capacitats en paral¿lel, demostrant l'efectivitat de la compensació de capacitat. El sistema presenta alguna desviació en freqüència respecte a la freqüència ressonància sèrie, mesurada amb un analitzador d'impedàncies. Aquestes desviacions són explicades convenientment, degudes al comportament no ideal específic d'alguns components del circuit. Una nova proposta de circuit es presenta com a possible solució a aquest problema. Per a aplicacions d'alta resolució es proposa una plataforma integrada per a caracteritzar sensors acústics d'alta freqüència. El sistema proposat es basa en un nou concepte en el qual el sensor és interrogat mitjançant una font externa molt estable i de molt baix soroll, a una freqüència constant mentre es monitoritzen els canvis produïts per la càrrega en la fase del sensor. L'ús de sensors d'alta freqüència augmenta la sensibilitat de la mesura, per altra banda, el sistema de caracterització dissenyat redueix el soroll en la mateixa. El resultat és una millora en el límit de detecció (LOD). S'aconsegueix amb això un dels reptes pendents en els dispositius acústics d'alta freqüència. La validació de la plataforma desenvolupada es realitza amb una aplicació d'un immunosensor basat en cristalls QCM d'alta freqüència fonamental (HFF-QCM) per a la detecció de dos pesticides: carbaryl i tiabendazol. Els resultats obtinguts per al carbaryl es comparen amb els obtinguts amb altra tecnologia acústica d'alta freqüència basada en sensors Love, amb la tècnica òptica basada en ressonància superficial de plasmons (SPR) i amb la tècnica de referència Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA). El LOD obtingut amb els sensors acústics HFF-QCM i Love és similar al obtingut amb les tècniques ELISA i millora en un ordre de magnitud el obtingut amb SPR. La senzillesa conceptual del sistema proposat junt amb el seu baix cost, així com la capacitat de miniaturització del ressonador de quars fa possible la caracterització de múltiples sensors integrats en una configuració en array, el que permetrà en un futur assolir el repte de la detecció multianalit per a aplicacions High-Throughput Screening (HTS). / García Narbón, JV. (2016). Improved characterization systems for quartz crystal microbalance sensors: parallel capacitance compensation for variable damping conditions and integrated platform for high frequency sensors in high resolution applications [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63249 / TESIS

Durch die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ist es erfolgreich gelungen die beiden gram-positiven Mikroorganismen Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 unter geregelten und idealen Kultivierungsbedingungen im Bioreaktor in hinreichenden Biomasseausbeuten zu kultivieren. Aus der Biomasse beider Stämme ist es anschließend gelungen, die primären Zellwandkomponenten bestehend aus Membranlipiden, Peptidoglykan mit sekundären Zellwandpolymeren und S-Layer-Proteinen in reiner Form und in guten Ausbeuten zu extrahieren. Diese Zellwandkomponenten wurden dann unter Verwendung von biochemischer und strukturanalytischer Methoden charakterisiert. Dabei ist es erstmals gelungen, die Membranlipide beider genutzter Mikroorganismen in Bezug auf deren Zusammensetzungen der enthalten hydrophoben Fettsäuren und der hydrophilen phosphathaltigen Kopfgruppen zu charakterisieren. Durch die vergleichend durchgeführten Metallbindungsversuche im Batch-Verfahren konnten Bindungspräferenzen intakter Zellen von Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 und deren isolierten Zellwandkomponenten mit den Metallen As, Au, Cd, Eu, Pb, Pd, Pt bzw. U untersucht werden. Dabei konnten sowohl in den Untersuchungen intakter Zellen und der primären Zellwandbestandteile deutlich höhere Metallsorptionsraten und Metallentfernungseffizienzen für Lysinibacillus sphaericus JG-B53 festgestellt werden als dies bei Lysinibacillus sphaericus JG-A12 nachzuweisen war. Dies macht diesen Stamm für potentielle technische Anwendungen als metallselektives biosorptives Material weitaus interessanter. Die Untersuchungen der Einzelkomponenten in Suspension lieferten jedoch nur begrenzt Informationen zur Interaktion der Metalle mit den Schichten wie sie unter natürlichen Bedingungen in der Zelle vorkommen. Daher wurden unter Verwendung der QCM-D erstmals die primären Zellwandkomponenten beider Mikroorganismen (S-Layer und Peptidoglykan) sowie von Referenzlipiden an Grenzflächen erfolgreich im nanoskaligen Bereich abgeschieden und online verfolgt. Dadurch war es möglich vereinfachte Einzelschichtsysteme der gram-positiven bakteriellen Zellwand nachzubilden. In den Untersuchungen konnten stabile Schichten generiert werden, welche vergleichbar zu dem Schichtsystem vitaler Zellen sind. Zusätzlich konnte bei den Abscheidungen der S-Layer-Proteine SlfB und Slp1 der positive Effekt von Polyelektrolytmodifizierungen auf das Rekristallisationsverhalten, die Schichtstabilität und den Bedeckungsgrad auf der technischen Oberfläche aufgezeigt werden. Zur Untersuchung der Metallinteraktion zellulärer Einzelschichtsysteme wurden in dieser Arbeit exemplarisch nach den erfolgreichen Untersuchungen zur Rekristallisation, die S-Layer-Proteine als erste Interaktionsschicht des Gesamtzellsystems mit der QCM-D untersucht. Diese stabilen und intakten Schichten konnten analog zu den Schichtuntersuchungen der reinen biologischen Komponenten und nach den QCM-D Metallinteraktionsstudien mit den S-Layer Strukturen mittels der Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht und bildgebend dargestellt werden. In weiteren spektroskopischen Untersuchungen (TRLFS) der Zellwandkomponenten konnten die lumineszierenden Eigenschaften von Europium ausgenutzt werden, um das Metallbindungsverhalten der einzelnen Komponenten als auch des Gesamtsystems der Zellen beider Mikroorganismen zu bestimmen. Somit konnte Europium als spektroskopische Sonde eingesetzt werden um Rückschlüsse die Biomolekül-Metallwechselwirkungen zu ermöglichen. Dabei konnten vor allem mit den beiden oberflächennahen Zellschichten Lösung teilweise sehr starke Metall-Biomolekül-Wechselwirkungen beobachtet werden.

Poly(3,4-ethylendioxythiophen) (PEDOT) ist ein Kunststoff der zur Gruppe der intrinsisch leitfähigen Polymere (ILP) zählt. Aufgrund seiner chemischen und thermischen Stabilität findet er Verwendung in antistatischen Verkleidungen und als Elektrodenmaterial. PEDOT (und andere ILP) zeigen aufgrund ihrer Schaltbarkeit zwischen (reduzierten, ) neutralen und oxidierten Zuständen unterschiedliche Eigenschaften wie Leitfähigkeit, Farbe oder Viskoelastizität. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die elektrochemischen und viskoelastischen Eigenschaften von PEDOT-Filmen untersucht. Dabei wurde die Quarzmikrowaage (QCM) in Verbindung mit potentiostatischen (Potentialsprung, PS) und potentiodynamischen (Cyclovoltammetrie, CV) elektrochemischen Methoden verwendet, so dass in situ elektrochemische und mechanische Eigenschaften der Filme zugänglich waren. Zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften wurde ein Auswertealgorithmus entwickelt, welcher auf ein mathematisches Modell zur Bestimmung des Schermoduls nach Efimov zurückgreift. Während der Herstellung wurden Parameter wie Lösungsmittel, Leitsalz, Vorpolarisations- und Abscheidungspotential variiert und die erhaltenen Filme bezüglich Schermodul und Morphologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Elektrolytzusammensetzung einen entscheidenden Einfluss auf die viskoelastischen Eigenschaften der Filme besitzt, welche mit der Morphologie der Filme korrelieren. Des Weiteren wurden die Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften dieser Filme untersucht, welche während dem elektronischen Schalten zwischen neutralem und oxidiertem Zustand aufgrund des Ionenaustausches erfolgen. CV- und PS-Experimente zeigten, dass die viskoelastischen Eigenschaften durch Konzentration und pH-Wert des Elektrolyten beeinflusst werden und in unterschiedlicher Weise auf die Potentialänderungen reagieren. Durch den Einbau von Magnetit-Partikeln in die Schichten konnten Hybridfilme erhalten werden, deren Eigenschaften durch das Anlegen eines äußeren Magnetfeldes beeinflusst werden können. Solche Filme zeigten in einem äußeren Magnetfeld (0,7T) höhere Schermodule und einen stark unterdrückten Ionenaustausch.

This work reports on the successful formation of supported multicomponent lipid bilayer membranes (sLBMs) from natural occurring lipids as well as synthetic lipids on a set of polymer cushions consisting of alternating maleic acid copolymers. Maleic acid copolymers provide a versatile platform to adjust the physico-chemical behaviour by the choice of the comonomer unit. The formation of sLBMs was triggered by a transient reduction of the electrostatic repulsion between the polymer cushions and the lipid vesicles by lowering the solutions pH to 4. Upon formation the stability of sLBMs was not affected by subsequent variations of the environmental pH to 7.2. Even drastic changes in the environmental pH (between pH 2 and pH 9) did not lead to delamination and proved the stability of the polymer sLBM. The degree of hydrophilicity and swelling of the anionic polymer cushions was found to determine both the kinetics of the membrane formation and the mobility of the lipid bilayer with lipid diffusion coefficients in the range from 0.26 to 2.6 µm2 s-1. An increase in cushion hydrophilicity correlated with a strong increase in the diffusion coefficient of the lipids. This trend was found to correlate with the kinetics of bilayer formation in the process of vesicle spreading. The observations strongly support the important role of the support’s polarity for the fluidity of the sLBM, which is probably related to the presence of a water layer between support and bilayer. The investigated polymer cushions are considered to open new options for the in situ modulation of lipid bilayer membranes characteristics to match the requirements for the successful integration of functional transmembrane proteins (TMPs). As each cushion exhibits different physico-chemical properties, the resulting behaviour of the sLBMs and TMPs could be exactly adjusted to the specific requirements of biological samples. This is exemplarily shown by the integration of the TMP beta amyloid precursor protein cleaving enzyme (BACE). Integrated BACE was observed to be mobile on all polymer cushions. On the contrary, no lateral mobility of BACE was found in solid sLBM. Furthermore, the activity of integrated BACE was analysed by the cleavage of an amyloid precursor protein analogue. Remarkably, the polymer cushions did not only enhance the mobility but were also found to increase the activity of BACE by a factor of 1.5 to 2.5 in comparison to solid sLBM. From the obtained results it is obvious that even small cytoplasmic domains of transmembrane proteins might not be preserved upon the integration in silica sLBM. The observed beneficial effects of the utilised polymer cushions on the mobility and activity of transmembrane proteins motivate further studies to clarify the general applicability of the polymer platform. Altogether, this polymer platform provides valuable options to form sLBM with varying characteristics to reconstitute transmembrane proteins for a wide range of possible future applications in biology. / Die vorliegende Arbeit beschreibt die Bildung von polymer unterstützten Lipiddoppelschichten zur Integration von transmembranen Proteinen. Das Polymerkissensystem besteht aus alternierenden Maleinsäurecopolymeren. Lipiddoppelschichten wurden durch die Steuerung der elektrostatischen Repulsion erzeugt: die Verringerung des pH-Wertes auf 4 wurde eine Erhöhung der adsorbierten Vesikelmenge auf den Polymeroberflächen induziert. Nach der erfolgten Bildung der Lipiddoppelschichten kann der pH-Wert beliebig variiert werden, ohne dass die Stabilität der Lipiddoppelschichten beeinflusst wird. Auch drastische Veränderungen des pH-Milieus (pH 2 - pH 9) führten zu keinen Veränderungen in der Membranintegrität. Der Grad der Hydrophilie und der Quellung der anionischen Polymerschichten beeinflusst sowohl die Bildung der Modellmembranen als auch die Mobilität der integrierten Lipidmoleküle. Dabei reichen die erzielten Lipiddiffusionskoeffizienten von 0.26 bis 2.6 µm2 s-1. Dabei ist die Mobilität direkt von der Hydrophilie des Substrates abhängig. Die beobachteten Ergebnisse zeigen deutlich die entscheidende Rolle der Polarität der verwendeten Substratoberflächen auf die Lipidmobilität, die sehr wahrscheinlich mit der Präsenz einer variablen Wasserschicht zusammenhängt. Die untersuchten Polymerkissen eröffnen neue Möglichkeiten für die insitu Modulierung der Charakteristika von Lipidschichten, um funktionale transmembrane Proteine zu integrieren. Aufgrund der unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften kann das Verhalten der Lipidschichten und der transmembranen Proteine nach den spezifischen Anforderungen des Modellsystems angepasst werden. Die funktionale Integration wurde am Beispiel des transmembranen Proteins BACE nachempfunden. Die Mobilität des integrierten BACE wurde auf allen Polymerkissen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde auf harten Substraten keine BACE Mobilität gefunden. Die Aktivität des integrierten BACE wurde durch die enzymatische Spaltung eines APP-Analogons nachgewiesen. Bemerkenswerteweise wurde ein Anstieg der BACE Aktivität auf den Polymerkissen um den Faktor 1,5 bis 2,5 im Vergleich zu den auf harten Substraten integrierten BACE beobachtet. Zusammenfassend, die verwendeten Polymerkissen bieten vielfältige Möglichkeiten Lipidschichten mit variierenden Eigenschaften für die Integration von transmembranen Proteinen zu erzeugen.

Stainless steel (SS) is the material of choice in a number of process industries ranging from food and dairy to pharmaceuticals. Adsorption phenomena on SS surfaces are of paramount importance in these industries. For example, protein adsorption constitutes a major issue in process equipment, as the associated surface fouling decreases the efficiency of the overall process and leads to an increase in operational costs because of the need for regular cleaning. In addition, the adsorption of proteins at solid–liquid interfaces is an important research field with relevance in biosensor and biomaterial applications. The primary aim of this thesis was to understand the underlying adsorption properties of selected protein onto SS surfaces and to identify the influence of specific amino acids on bio-fouling. Protein adsorption experiments were carried out on 316 grade SS sensors using a quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D). The proteins consisted of milk proteins (α-lactalbumin, β-lactoglobulin, α-casein, β-casein, κ-casein and bovine serum albumin), blood proteins (cytochrome-c, haemoglobin and myoglobin) and proteins of industrial and medical relevance (α-chymotrypsinogen, human recombinant insulin, lysozyme and papain). The adsorption characteristics of the test proteins were studied and an empirical correlation relating the amount of protein adsorbed to their physical properties was proposed. Adsorption onto a SS surface was followed on the QCM-D in real time and the amounts adsorbed calculated using the Sauerbrey model. In addition, the binding kinetics was modelled using different theoretical models to describe the adsorption mechanism. In all the proteins tested, the conformational change model was found to fit considerably well the adsorption data. Finally, the data collected were used to identify the physical properties of proteins that induce surface binding, with hydrophobic and aromatic amino acids having the most effect on binding. A second aspect investigated in the present work was the determination of hydration water present in the adsorbed layer. In fact, water molecules, solvated ions and other small molecules in the vicinity of the surface all play an important role in protein adsorption and often constitute a large fraction of the total measured adsorbed mass. The fraction of water present on SS surfaces along with adsorbed proteins was determined using fluorescently labelled proteins through a comparative study that included QCM-D experiments as well as fluorescent light intensity measurements. The results were similar for all proteins tested, indicating that 32-45.8% of the total mass adsorbed composed of water. One last aspect considered in this thesis was the influence of the putative adhesive amino acid 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA). DOPA residues are present in high levels in the adhesive proteins from marine mussels, hence are thought to facilitate surface attachment. The role of DOPA residues in mediating protein adhesion on SS surfaces was studied using QCM-D. Two repetitive peptide motifs extracted from the sequence of the mussel foot protein mefp-5, KGYKYYGGSS and KGYKYY, were selected for this study. The two peptides contained unmodified tyrosine (Y) residues, which were chemo-enzymatically modified to DOPA using mushroom tyrosinase. Adsorption of the two sequences on SS surfaces was tested before and after modification of tyrosine residues to DOPA. Conversion was linearly related to the incubation time of the peptide fragments with mushroom tyrosinase, Amount of DOPA formed was 70-99% of the tyrosine content in the peptides. QCM-D adsorption experiments on the DOPA-modified sequences revealed four-fold greater adhesion than for unmodified mefp-5 motifs, indicating the paramount role that DOPA has on the adsorption of peptides on 316 grade stainless steel.