En la presente tesis se han preparado nitronas derivadas de 3,4-O-isopropiliden-L-eritrulosa. Se ha estudiado la reactividad de las mismas frente a la reacción de adición de compuestos organometálicos. Se han obtenido en determinadas condiciones elevadas diastereoselectividades para la adición de especies nucleofílicas. La configuración absoluta de los diastereoisómeros obtenidos se ha realizado mediante técnicas de difracción de rayos-X de monocristal, mediante correlación química con compuestos de estructuras conocidas y mediante estudios espectroscópicos de derivados rígidos. Los productos de adición se han transformado en a-alquil-N-acetoxi-a-aminoesteres y (R)-a-metilserina. Asimismo se han estudiado reacciones de cicloadición 1,3-dipolares entre las nitronas (dipolos) y dipolarófilos de diferente

The indiscriminate and/or improper use of veterinary drugs is the cause of potential adverse health effects due to the risk of entering into the food chain and the appearance of residues in food products of animal origin. Moreover, in the case of antibiotics, this fact has been identified as one of the causes for the appearance of antimicrobial resistance mechanisms in bacteria causing human diseases, which is the cause of a big concern within the health authorities, distinct governmental agencies and the society in general. There is an increased need to ensure safety and quality of the foodstuff and customers have also started to become more exigent forcing the industry to introduce consumer worries in their daily procedures, in terms of getting more natural, ecological and healthy products with a clear traceable origin of the ingredients. Nowadays, food control is performed on centralized laboratories that in most cases use very reliable procedures, but involving expensive equipment, specialized personnel and time consuming sample treatment procedures. In order to drastically improve this situation, the European Commission (EC) and the member state agencies are strongly supporting research activities aimed to increase the efficiency of the actual analytical methods. An strategy is to take advantage of the latest bio-micro-nanotechnological advances and of the complementary skills of multidisciplinary research teams to develop more rapid, sensitive and specific methodologies capable of detecting a wide variety of chemical, biological or any other health risk associated to the agrofood industry and along to the whole food chain. This thesis describes the research performed in respect to the possibility to develop improved alternatives for food residue analysis based on the combination of selective receptors and novel micro/nanotechnologies. Particularly, the final objective of this thesis was addressed to the development of a multiplexed sensor device to detect inappropriate farm practices and or the contamination of food products by antibiotic residues, mainly milk. In this respect, production of selective receptors with a broad recognition of the most important antibiotic families used in the veterinary field has been one of the most important aims of this research work. Thus, we report here the investigation made regarding development of synthetic receptors for sulfonamide antibiotics (SAs), particularly molecular imprinted polymers (MIPs), and their evaluation of a rational approach. Moreover, production of generic (or class-selective) antibodies for SAs and tetracycline antibiotics (TCs) has also been approached through the rational design and synthesis of appropriate haptens. Evaluation of the features of the antibodies produced has been accomplished through the development of microplate-based ELISAs (enzymelinked immunosorbent assays). The results show that although it has been possible to obtain class-selective antibodies for SAs (up to 11 congeners can be detected), the approach followed for the case of the TCs afforded antibodies with a high selectivity versus TCs possessing an alkyl/alkene group at position 6 of the C-ring, but lacking the hydroxyl group at this position. The necessary protocols to apply these immunochemical procedures to the analysis of milk and hair samples have been established showing that determination of these antibiotics according to the EC regulations was possible for the case of milk. For the case of hair, no regulations do exist at the moment. However this matrix holds great value regarding their potential use to trace inappropriate treatments through the life of the farm animals. The immunoreagents and immunochemical procedures established have been implemented on an optical sensor device developed by the Centre Suisse for Electronics and Microelectronics Inc. (CSEM, Neuchâtel - Switzerland). This device is based on the evanescent wave principle using a particular technological design based on waveguide grating couplers and it is very sensitive to the changes in the refractive index produced at the surface of the transducer. Moreover, the chip developed by CSEM has 24 sensing pads which allow multiple measurements with the same transducer. As a consequence of this collaboration it has been possible to develop a biosensor device able to detect SA residues in milk samples in compliance with the EC regulations. Further investigation, has led to the development of a multiplexed biosensor device by combining immunoreagents (SAs and fluoroquinolone antibiotics (FQs)) produced at the Applied Molecular Receptors group (AMRg) of the CSIC, with bioreceptors (ß lactam antibiotics (BLs) and TCs) provided by UNISENSOR S.A. (Liege - Belgium). The results obtained were very good. About 34 antibiotics from four different antibiotic families can be detected in milk samples following all the EC regulations with the device developed. Before, a multianalyte microplate-based ELISA had been developed combining the same bioreagents to evaluate performance and to establish the most appropriate immunochemical procedures. The immunochemical methods developed within this thesis, including immunoassays and immunosensors, have been preliminarily evaluated in collaboration with the Nestlé Research Centre (NRC), at Lausanne in Switzerland, in order to demonstrate performance in real milk samples. / El uso indiscriminado y/o inadecuado de medicamentos veterinarios es la causa de posibles efectos adversos para la salud por el riesgo que entren en la cadena alimentaria y la aparición de sus residuos en los productos alimenticios de origen animal. Además, en el caso de los antibióticos, este hecho ha sido identificado como una de las causas de la aparición de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las bacterias que causan enfermedades humanas, lo cual es causa de una gran preocupación en las autoridades sanitarias, distintos organismos gubernamentales y de la sociedad en general. Actualmente, existe una creciente necesidad de garantizar la seguridad y calidad de los productos alimenticios y los consumidores también han comenzado a ser más exigentes obligando a la industria a introducir sus preocupaciones en sus procedimientos, en términos de conseguir los productos más naturales, ecológicos y saludables con un origen de los ingredientes rastreable. Hoy en día, el control de alimentos se realiza en laboratorios centralizados que en la mayoría de casos utilizan procedimientos muy fiables, pero necesitan equipos caros, personal especializado y elevados tiempos de tratamiento de muestra. Con el fin de mejorar drásticamente esta situación, la Comisión Europea (CE) y los organismos de los Estados Miembros apoyan firmemente actividades de investigación orientadas a aumentar la eficiencia de los métodos de análisis actuales. Una estrategia es tomar ventaja de los últimos avances en las biomicro-nanotecnologías y de las capacidades complementarias de los equipos de investigación multidisciplinarios para desarrollar metodologías más rápidas, sensibles y específicas capaces de detectar una amplia variedad de sustancias químicas, biológicas o cualquier otro riesgo para la salud asociado a la industria agroalimentaria, a lo largo de toda la cadena alimentaria. En esta tesis se describe la investigación llevada a cabo en relación a la posibilidad de desarrollar alternativas más adecuadas para el análisis de residuos de alimentos basados en la combinación de receptores selectivos y las nuevas micro/nanotecnologías. En particular, el objetivo final de esta tesis fue dirigido hacia el desarrollo de un dispositivo sensor multiplexado para detectar prácticas agrícolas inadecuadas y/o la contaminación de alimentos, principalmente la leche, por residuos de antibióticos. A este respecto, la producción de receptores selectivos con un amplio reconocimiento de las familias de antibióticos más importantes que se utilizan en el sector veterinario ha sido uno de los objetivos más importantes de este trabajo de investigación. Así, lo constata la investigación realizada en relación con el desarrollo de receptores sintéticos para antibióticos de sulfonamida (SA), polímeros de huella molecular (MIPs), y su evaluación como enfoque racional para otros contaminantes. Además, la producción de anticuerpos genéricos (o selectivos de clase) para SAs y antibióticos de tetraciclina (TC) también ha sido abordada mediante el diseño racional y síntesis de haptenos. La evaluación de las características de los anticuerpos producidos se ha logrado mediante el desarrollo de ELISAs (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) en microplacas. Los resultados muestran que a pesar de que ha sido posible obtener anticuerpos selectivos de clase para las SA (hasta 11 congéneres pueden ser detectados), el enfoque adoptado para el caso de los anticuerpos TCs ofrece una alta selectividad frente a TC que poseen un grupo alquilo/alqueno en la posición 6 del anillo C, pero que carecen del grupo hidroxilo en esta posición. Los protocolos necesarios para aplicar estos procedimientos inmunoquímicos para el análisis de muestras de leche y el cabello han sido establecidos mostrando que fue posible la determinación de estos antibióticos en leche de acuerdo con la normativa de la CE. Para el caso del cabello, no existen regulaciones por el momento. Sin embargo, esta matriz tiene un gran valor en cuanto a su uso potencial para seguir tratamientos inadecuados a lo largo de la vida de los animales de granja. Los inmunoreactivos y procedimientos inmunoquímicos establecidos se han implementado en un dispositivo sensor óptico desarrollado por el Centre Suisse de Electrónica y Microelectrónica Inc. (CSEM, Neuchâtel - Suiza). Este dispositivo se basa en el principio de onda evanescente usando un diseño tecnológico particular basado en acopladores de rejilla de guía de ondas que es muy sensible a los cambios en el índice de refracción producida en la superficie del transductor. Además, el chip desarrollado por CSEM tiene 24 zonas de detección que permiten múltiples mediciones con el mismo transductor. Como consecuencia de esta colaboración ha sido posible desarrollar un dispositivo biosensor capaz de detectar residuos de SA en muestras de leche en el cumplimiento de la normativa CE. Investigaciones posteriores, han llevado al desarrollo de un dispositivo biosensor multiplexado que combina inmunoreactivos (antibióticos SAS y fluoroquinolonas (FQs)) producidos en el grupo de Receptores Moleculares Aplicados (AMRg) del CSIC, con bioreceptores (ß-lactámicos (BLs) y TCs) proporcionados por Unisensor SA (Lieja - Bélgica). Los resultados obtenidos fueron muy buenos. Alrededor de 34 antibióticos de cuatro familias diferentes de antibióticos pueden ser detectados en muestras de leche siguiendo todas las normativas de la CE con el dispositivo desarrollado. Anteriormente, se desarrolló un ELISA multianalito (en microplacas) mediante la combinación de los mismos bioreactivos para evaluar el sus características y establecer los procedimientos inmunoquímicos más adecuados. Los métodos inmunoquímicos desarrollados en esta tesis, incluyendo los inmunoensayos e inmunosensores, han sido evaluados en colaboración con el Centro de Investigación de Nestlé (NRC), en Lausana, en Suiza, con el fin de demostrar su rendimiento en las muestras de leche real.

L'expressiódels gens obtinguts de l'anàliside microarrays s'utilitza en molts casos, per classificar les cèllules. En aquestatesi, unaversióprobabilística del mètodeDiscriminant Partial Least Squares (p-DPLS)s'utilitza per classificar les mostres de les expressions delsseus gens. p-DPLS esbasa en la regla de Bayes de la probabilitat a posteriori. Aquestsclassificadorssónforaçats a classficarsempre.Per superaraquestalimitaciós'haimplementatlopció de rebuig.Aquestaopciópermetrebutjarlesmostresamb alt riscd'errors de classificació (és a dir, mostresambigüesi outliers).Aquestaopció de rebuigcombinacriterisbasats en els residuals x, el leverage ielsvalorspredits. A més,esdesenvolupa un mètode de selecció de variables per triarels gens mésrellevants, jaque la majoriadels gens analitzatsamb un microarraysónirrellevants per al propòsit particular de classificacióI podenconfondre el classificador. Finalment, el DPLSs'estenen a la classificació multi-classemitjançant la combinació de PLS ambl'anàlisidiscriminant lineal.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / El control integrat de plagues (IPM) és una estratègia respectuosa amb el medi ambient utilitzada per combatre les destructives plagues que anualment causen importants pèrdues econòmiques al sector agrícola, minimitzant l’ús de pesticides químics. L’aplicació de feromones pel control de plagues s’utilitza actualment amb èxit tot i que presenta algunes limitacions com el seu cost final més elevat que el dels pesticides biocides, una eficàcia garantida sols a nivells baixos d’infestació o la possible atracció de poblacions veïnes. Al llarg del present treball s’ha dut a terme l’obtenció de diversos compostos de tipus metilcetona i trifluorometilcetona anàlegs estructurals de la feromona sexual de diverses espècies d’arnes plaga, tots ells obtinguts amb un elevat rendiment global i una estereoselectivitat excel·lent. L’objectiu ha estat avaluar-ne el seu efecte antagonista i estudiar la seva aplicabilitat pel control de plagues com una alternativa a les pròpies feromones. Concretament, s’ha dut a terme la síntesi a escala multigram de la (10E,12E)-tetradeca-10,12-dien-2-ona (1), anàleg estructural de la feromona sexual de Cydia pomonella, important plaga de pomers, perers, presseguers i pruners, mitjançant un procediment on s’ha minimitzat tant el volum de dissolvent com la quantitat de reactius tòxics. Els assajos de confusió sexual en camp amb la metilcetona anàloga 1 han mostrat que aquesta no produeix una reducció de captures en relació a una parcel·la control tractada només amb feromona. S’ha desenvolupat la síntesi de 4 anàlegs monoènics de la feromona sexual de Lobesia botrana, principal plaga de la vinya, (E)-9-tetradecen-2-ona (2), (E)-1,1,1-trifluoro-9-tetradecen-2-ona (3), (Z)-11-tetradecen-2-ona (4) i (Z)-1,1,1-trifluoro-11-tetradecen-2-ona (5). Als experiments per avaluar l’activitat en camp d’aquests anàlegs no s’hi ha demostrat efecte inhibidor de l’atracció feromonal amb la mescla feromona-inhibidor 1:10. S’han obtingut 4 compostos anàlegs estructurals de la feromona de Grapholita molesta, plaga de presseguers, albercoquers, pruners i cirerers, (Z)-10-tetradecen-2-ona (6), (Z)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-ona (7), (E)-10-tetradecen-2-ona (8) i (E)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-ona (9). En proves electrofisiològiques (EAG), l’exposició dels mascles a vapors de 100 µg de les metilcetones 6 i 8 i la trifluorometilcetona 7 anàlogues a la feromona de G. molesta ha induït una disminució significativa de la resposta antenal a l’estímul feromonal. Entre aquests compostos, la trifluorometilcetona 7 és l’anàleg que ha produït la màxima inhibició de la resposta d’EAG (60%). Per la seva banda, en assajos de comportament en túnel de vent solament la trifluorometilcetona 7 ha produït una reducció significativa dels contactes amb la font emprant una mescla de feromona-inhibidor 1:10. Als assajos de camp s’ha observat activitat antagonista amb les metilcetones 6 i 8 a una dosi de feromona-inhibidor 1:10, mentre que la trifluorometilcetona 9 ha exhibit un cert efecte sinèrgic de captures en comparació amb la feromona sola. S’ha desenvolupat una nova ruta sintètica de la feromona sexual de Tuta absoluta, devastadora plaga de tomaqueres amb un rendiment global més elevat que qualsevol dels procediments anteriorment descrits (23.5%) i una puresa estereomèrica final excel·lent (97% E,Z,Z). S’han obtingut 8 anàlegs feromonals; (5E,10Z,13Z)-5,10,13-hexadecatrien-2-ona (10), (5E,10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,10,13-hexadecatrien-2-ona (11), (5E,10Z)-5,10-hexadecadien-2-ona (12), (5E,10Z)-1,1,1-trifluoro-5,10-hexadecadien-2-ona (13), (5E,13Z)-5,13-hexadecadien-2-ona (14), (5E,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,13-hexadecadien-2-ona (15), (10Z,13Z)-10,13-hexadecadien-2-ona (16) i (10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-10,13-hexadecadien-2-ona (17). En assajos de camp, els anàlegs 10 i 13 han produït una disminució significativa i reproduïble de captures amb una mescla feromona-inhibidor 1:10, mentre que els anàlegs 11 i 12 han demostrat un efecte antagonista circumstancial. Per la seva banda, els anàlegs 14-17 no van mostrar cap efecte antagonista. S’ha assajat la identificació d’un possible component de la feromona sexual de Paysandisia archon, important plaga de palmeres, mitjançant la síntesi i elucidació estructural de l’acetat de (E)-2-octadecen-1-il (18), l’acetat de (Z)-2-octadecen-1-il (19) i l’acetat de (E)-3-octadecen-1-il (20). El producte 20 és el que presenta una similitud estructural més propera a la del possible component feromonal. / The integrated pest management (IPM) is a combination of environmentally friendly strategies for pest control in agriculture aimed to rationalize the use of chemical pesticides. For the last decades, synthetic sex pheromones of pest insects are being used in IPM with much success, although it has some limitations. In the present work it has been carried out the synthesis of several methyl ketones and trifluoromethyl ketones, which are structurally related to the sex pheromone of some species of pest moth. All these analogues have been obtained through optimized synthetic procedures resulting in a high overall yield and stereoselectivity. The antagonistic effect of the synthesized analogues has been determined in laboratory and field tests in order to evaluate their convenience as an alternative to pheromones for pest control. It has been developed in a multigram scale the synthesis of (10E,12E)-tetradeca-10,12-dien-2-one (1), analog of the apple pest, Cydia pomonella, sex pheromone. Mate disruption field experiments with methyl ketone 1 have not shown any reduction of captures compared with the use of pheromone. The monoenic analogues of grape wine pest, Lobesia botrana, (E)-9-tetradecen-2-one (2), (E)-1,1,1-trifluoro-9-tetradecen-2-one (3), (Z)-11-tetradecen-2-one (4) and (Z)-1,1,1-trifluoro-11-tetradecen-2-one (5), have been obtained. In field experiments these compounds have not shown antagonistic effect in a pheromone-inhibitor (1:10) proportion. It has been carried out the synthesis of the peach pest, Grapholita molesta, pheromone analogues: (Z)-10-tetradecen-2-one (6), (Z)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-one (7), (E)-10-tetradecen-2-one (8) and (E)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-one (9). In electrophysiology experiments, trifluoromethyl ketone 7 has induced a 60% of inhibition of the antennal response to a pheromone stimulus, and the same compound produced a significant inhibitory effect in wind tunnel tests. Further, methyl ketones 6 and 8 showed antagonistic activity in field experiments. A new synthetic route of the pheromone components of the devastating tomato pest, Tuta absoluta, has been achieved in a higher overall yield (23.5%) than previously reported and an excellent stereoselectivity. Additionally, eight pheromone analogues have been synthesized; (5E,10Z,13Z)-5,10,13-hexadecatrien-2-one (10), (5E,10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,10,13-hexadecatrien-2-one (11), (5E,10Z)-5,10-hexadecadien-2-one (12), (5E,10Z)-1,1,1-trifluoro-5,10-hexadecadien-2-one (13), (5E,13Z)-5,13-hexadecadien-2-one (14), (5E,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,13-hexadecadien-2-one (15), (10Z,13Z)-10,13-hexadecadien-2-one (16) and (10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-10,13-hexadecadien-2-one (17). Analogues 10 and 13 have produced a reproducible significant reduction of captures in field tests. In order to identify a possible sex pheromone component of palm tree pest, Paysandisia archon, the following compounds have been obtained: (E)-2-octadecen-1-yl acetate (18), (Z)-2-octadecen-1-yl acetate (19) and (E)-3-octadecen-1-il acetate (20), among which compound 20 showed the closest structural similarity to the unknown pheromone component.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / Els iminociclitols són compostos alcaloides cíclics polihidroxilats mimètics de sucres, en els quals l’àtom d’oxigen endocíclic es troba substituït per un àtom de nitrogen. Són atractius farmacològicament ja que molts d'ells mostren activitat inhibidora d'enzims relacionats amb el processament d'hidrats de carboni i han resultat vitals pel desenvolupament de nous fàrmacs, com antiinflamatoris, antitumorals, antivírics i antibiòtics. Així doncs, és un repte i objectiu important disposar d’aquestes molècules polifuncionalitzades mitjançant síntesis senzilles. La síntesis orgànica clàssica d’aquestes molècules és complexa a causa de principalment tres factors: la necessitat de múltiples i complexes seqüències de protecció/desprotecció, dificultats en el control de la estereoselectivitat a causa de l’elevat nombre de centres estereogènics i en el seu aïllament i purificació. Per tant, una bona alternativa és la utilització d’enzims com catalitzadors en síntesis asimètriques donat els avantatges sobre les metodologies químiques clàssiques com són l’elevat grau de control de la estereoquímica i les condicions suaus de reacció. Les reaccions es duen a terme en medi aquós, fet que ofereix una opció mediambiental més atractiva. En la present Tesi es presenten excel·lents estratègies quimioenzimàtiques per a l'obtenció d'iminociclitols mono i bicíclics on l'etapa clau i central del procés és l'addició d'un donador a un aldehid acceptor catalitzada per aldolases natives o modificades genèticament. Les aldolases són un grup específic de liases que catalitzen de manera reversible la formació estereoselectiva d’enllaços caboni-carboni mitjançant una reacció aldòlica. Generalment aquests enzims són molt selectives en quan a llur tolerància del substrat donador (nucleòfil), però accepten una gran diversitat estructural d’aldehids acceptors (electròfil). En aquest treball s'han emprat aldolases dependents de glicina, de dihidroxiacetona fosfat (DHAP) i la D-fructosa 6-fosfat aldolasa d’Escherichia coli (FSA). En la primera part de la Tesi, es presenta un innovadora estratègia quimioenzimàtica que permet la síntesi d'una col·lecció de noves estructures de derivats polihidroxilats de l'àcid pipecòlic, homoiminociclitols piperidínics i pirrolidínics a partir de substrats simples i aquirals en tres passos sintètics i creant fins a cinc centres estereogènics. L'estratègia es basa en dues etapes claus d'addició aldòlica consecutives biocatalítiques. En la primera etapa clau biocatalítica s'empraren aldolases dependents de glicina, obtenint derivats d'àcid .-hidroxiamínics amb estereoquímica controlada. Llurs adductes aldòlics obtinguts es convertiren en els substrats de la segona etapa clau per mitjà de transformacions químiques senzilles. Les aldolases dependents de glicina D-treonina aldolasa són poc conegudes. Per això, prèviament es dugué a terme un estudi de la producció de la D-treonina aldolasa d'Achromobacter xylosoxidans i la seva aplicabilitat com a biocatalitzador. En la subsegüent etapa aldòlica clau, s'empraren les aldolases dependents de DHAP rhamnulosa 1-fosfat aldolasa i fuculosa 1-fosfat aldolasa, ambdues de E.coli, i la FSA. Finalment, els productes finals s'obtingueren per mitjà de l'aminació reductiva dels adductes aldòlics obtinguts. En la segona part del treball es presenta la síntesi d'una col·lecció de 47 iminociclitols mono i bicíclics de tipus pirrolidines, piperidines, pirrolizidines, indolizidines i quinolizidines. L'etapa clau en aquesta síntesi fou l'addició aldòlica dels donadors a-hidroxicarbonílics DHA, HA i GO a N-Cbz-aminoaldehids catalitzades per noves variants de FSA. L’iminosucre final s’obté per mitjà de la desprotecció del grup amino i aminació reductora en un sol pas per hidrogenació catalítica de l'adducte aldòlic. Les noves variants de FSA s'obtingueren prèviament en aquest treball a partir del redisseny del centre catalític de l'enzim per enginyeria de proteïnes a fi d'incrementar l'afinitat d'aquest biocatalitzador en les addicions aldòliques d'interès de DHA, HA i GO a N-Cbz-aminoaldehids voluminosos o conformacionalment restringits. Les noves variants de FSA es produïren a partir de les plataformes FSA A129S/A165G per DHA i HA i FSA L107Y/A129G/A165G per GO per mitjà de mutagènesi de lloc dirigit o de saturació de lloc. Les variants FSA A129S/R134X/A165G/S166G i FSA L107Y/A129G/R134X/A165G/S166G on X: P, R, S i V generaren conversions més elevades en les addicions aldòliques d'interès. / Iminocyclitols are an attractive class of glycomimetics which possess inhibitory properties against glycosidases and glycosyltranferases and an enormous therapeutic potential for the treatment of several diseases such as cancer, viral infections, type II diabetes, and lysosomal storage disorders, among others. The synthesis of these compounds can be obtained by chemoenzymatic strategies in an excellent and fashion way. A chemoenzymatic approach in organic synthesis is based on the combination of chemical reactions and biocatalytic, using microorganism or enzymes, to prepare organic compounds with minimal steps and high atom economy. Furthermore, the mild conditions required for enzymatic transformations and the use of water as a solvent makes biocatalysis one of the greenest technologies able to fulfill the ongoing need for economically and environmentally more sustainable industrial processes. Among enzymes, aldolases are one of the most promising classes of biocatalysts being able to construct chiral molecular frameworks from simple precursors by means of direct asymmetric aldol additions. In the first part of this Thesis a multistep chemoenzymatic synthesis for stereodiverse polyhydroxypipecolic acid analogues, homoiminocyclitols and polyhydroxylated piperidine and pyrrolidine derivatives combining glycine-dependent aldolases and both D-fructose-6-phosphate aldolase (FSA) or dihydroxyacetone phosphate (DHAP)-dependent aldolases is presented. The methodology allowed the preparation of known and innovative imine-derived molecules with a great structural diversity from simple achiral substrates. In the second part, a structure-guided redesign of D-fructose-6-phosphate aldolase from E. coli (FSA) was devised for improving the acceptor tolerance towards alpha-substituted and conformationally constrained aldehydes. FSA A129S/R134X/A165G/S166G and L107Y/A129G/R134X/A165G/S166G variants, where X was R, V, P, or S were the most suited biocatalysts for dihydroxyacetone, hydroxyacetone and glycolaldehyde additions to 20 alpha-substituted N-Cbz-aminoaldehydes including pyrrolidine and piperidine derivatives. Full kinetic stereocontrol for si-si face addition of the FSA-bound nucleophile to the N-Cbz-aminoaldehyde carbonyl was observed furnishing the corresponding D-threo configured aldol adduct in >95:5 dr as assessed by NMR. After reductive amination, 47 different iminocyclitols were identified and characterized. In some examples partial racemization of the corresponding aldehyde was observed, which appears to be produced mostly during the aldol addition reactions.

Diferents estudis epidemiològics han indicat els derivats mono- i diesterificats del 3-(N-fenilamino)1,2-propandiol (PAP) com a biomarcadors de les partides d'oli de colza que van causar la síndrome de l'oli tòxic (SOT), una intoxicació que va tenir lloc a Espanya al 1981, i que va provocar més de 400 morts i va afectar a més de 20,000 persones. Aquests esters del PAP poden ser hidrolitzats per part de la lipasa pancreàtica humana donant lloc a PAP en un últim estadi. Per aquest motiu, els estudis de metabolisme, tant de primera com de segona fase, s'han centrat en aquesta molècula. Així, incubacions de PAP en presència de microsomes hepàtics han mostrat que el CYP450 és capaç de bioactivar aquest compost donant lloc al corresponent derivat 4'-hidroxilat com a principal metabòlit. Aquest fenol derivat del PAP, però, és força inestable i es pot tornar a oxidar donant lloc a una espècie iminoquinònica altament reactiva, i per tant, de potencial toxicitat. En presència de molècules amb un grup tiol lliure, com són el glutatió o l'N-acetilcisteïna, aquesta iminoquinona derivada del PAP pot formar els corresponents tio-conjugats mitjançant una addició de Michael. En aquest cas, els conjugats es poden tornar a oxidar donant lloc als corresponents derivats iminoquinònics, els quals, en presència de glutatió o N-acetilcisteïna formen bis- i tris-adductes, però en absència d'aquests tiols isomeritzen a la corresponent base de Schiff i posteriorment s'hidrolitzen per donar lloc als corresponents conjugats derivats del 4-aminofenol juntament amb gliceraldehid. Aquest comportament es podria extrapolar a d'altres derivats del 4-aminofenol que continguin un CH2 adjacent al residu anilínic. Aquest seria el cas d'un dels possibles metabòlits de la 3-(N-fenilamino)alanina (PAA), un dels contaminants presents en els lots d'L-triptòfan responsables de la síndrome de l'eosinofília-miàlgia (SEM), una altra intoxicació de característiques similars a la SOT que va tenir lloc l'any 1989 als Estats Units i que va afectar a més de 1500 persones. Així, s'ha demostrat que la PAA en presència de microsomes de fetge humà pot ser metabolitzada pel CYP450 donant lloc al corresponent derivat 4'hidroxilat, el qual es pot re-oxidar fàcilment per formar el corresponent intermedi iminoquinònic i donar lloc posteriorment al 4-aminofenol i a la formilglicina. Aquest fet estableix un nou vincle d'unió entre ambdues síndromes, no només a través de la generació d'un compost comú de coneguda toxicitat (4-aminofenol), sinó també mitjançant la generació d'espècies carboníliques que podrien representar un factor de risc addicional. / Toxic Oil Syndrome (TOS) was a massive food intoxication episode that occurred in 1981 in central and northern Spain, causing more than 400 deaths and affecting more than 20,000 people. TOS was attributed to the ingestion of a rapeseed oil that had been adulterated with aniline and illegally refined for human consumption. Epidemilogical investigations established the mono- and diester derivatives of 3-(N-penylamino)-propane-1,2-diol as biomarkers of the toxic oil. These PAP esters can be hydrolyzed by pancreatic lipase leading finally to PAP. For this reason, metabolism studies have been focused in this molecule. Thus, PAP incubations in presence of liver microsomes have shown the capacity of CYP450 to bioactivate this compound giving rise to the 4'-hydroxylated derivative as the main metabolite. However, this phenol derivative is unstable and can be re-oxidated leading a highly reactive, and potentially toxic, quinoneimine specie. In presence of molecules with a free thiol group, as glutathione or N-acetylcysteine, this quinoneimine derivative can forme the corresponding thio-conjugate. However, these conjugates can be re-oxidated giving rise to the corresponding quinenimine derivatives, which in presence of glutathione or N-acetylcysteine lead to bis- and tris-conjugates, but in absence of thiols can isomerize to the corresponding Schiff base and then be hydrolyzed to lead the corresponding 4-aminophenol conjugates and glyceraldehyde. This behaviour could be extrapolated to other species with a CH2 adjacent to the anilinic residue. This could be the case of one of the possible metabolites of 3-(N-phenylamino)-alanine (PAA), one of the contaminants present in the L-tryptophan batches responsible for Eosinophilia-Myalgia Syndrome (EMS), another similar intoxication that took place in 1989 in US and that affected more than 1500 people. Thus, it has been demonstrated that PAA in presence of human liver microsomes can be metabolized by CYP450 to give rise the corresponding 4'-hydroxy derivative, which can be re-oxidated leading the corresponding quinoneimine intermediate and then 4-aminophenol and formyl glycine. This fact provides support of a linkage between EMS and TOS, not only by the generation of a final common toxic compound (4-aminophenol), but also by the concomitant release of carbonyl especies that could represent an additional risk factor.

La present tesi s'ha desenvolupat dintre de la línia de recerca que el grup té sobre el desenvolupament de nous sorbents polimèrics per a aplicar-los com a sorbents en extraccions en fase sòlida. En aquest cas, els sorbents sintetitzats són altament selectius per a la molècula d'interès i es coneixen com a sorbents d'empremta molecular. Pel que fa al mètode de síntesi s'han explorat diferent tipus de polimeritzacions així com diferents tipus d'interacció entre els components que constitueixen el polímer a fi de millorar tant el procés de síntesi com el reconeixement de la molècula objectiu un cop obtingut el polímer per tal d'obtenir extraccions altament selectives. Aquest sorbents s'han aplicat per a l'extracció de compostos considerats com a contaminants orgànics emergents en mostres tant d'orina humana com aigües de riu o de depuradora amb resultats satisfactoris en tots els casos, demostrant que aquest sorbents són una bona opció a l'hora de realitzar extraccions altament selectives. / The present thesis has been developed within the research trend that the group has on the development of new polymeric materials for their used as sorbents in solid-phase extraction. In this case, the sorbents synthesised are highly selective for the molecule of interest and are known as molecularly imprinted polymers. Regarding the synthesis of these polymers, several polymerisation protocols as well as several kinds of interactions that can be established between all the components involved in the synthesis of the polymers have been exploited. The sorbents obtained were further applied in the selective extraction of several compounds framed within the group of emerging organic pollutants from human urine, river water or effluent water from sewage plants. In any case, a successful extraction of the target analyte was easily achieved by using any of the sorbents developed, thus proving that these sorbents are a good option when aiming to selectively extract the compound of interest from highly complex matrices.

En els últims anys s'ha demostrat que els lípids no són només components estructurals de la membrana plasmàtica sinó que a més a més aquests desenvolupen diferents funcions cel·lulars. Concretament s'ha observat que els productes de degradació de les fosfolipases són importants en els processos d'inflamació, entre d'altres; i sembla ser que la fosfolipasa A2 independent de calci podria estar relacionada amb la esquizofrènia. La síntesis de nous potencials inhibidors d'aquesta proteïna per estudiar el metabolisme d'aquests lípids ha estat l'objectiu principal en el transcurs d'aquesta tesi doctoral.Per a dur a terme aquest treball, s'han sintetitzat diferents anàlegs a l'únic inhibidor selectiu d'aquest enzim (BEL), introduint diferents modificacions per intentar obtenir un inhibidor reversible igual de selectiu. Una d'aquestes modificacions va ser la introducció de la funcionalitat trifluorocetona, comú en diferents inhibidors de lipases, en l'esquelet de BEL. Desafortunadament, cap dels compostos sintetitzats sota aquest disseny no va presentar les propietats inhibitòries desitjades. Es va dissenyar una segona família de compostos introduint grups ariloxi- en la estructura de BEL; en aquest cas tampoc es van obtenir bons inhibidors, en canvi, dos d'aquests compostos van augmentar la activitat d'aquest enzim selectivament respecte a la fosfolipasa A2 dependent de calci (cPLA2).Una altra aproximació per dissenyar nous inhibidors va consistir en la síntesi d'anàlegs de substrat. Aquests compostos presentaven un grup n-hexadecilmercaptà a la posició sn-1 i el grup fosforilcolina a la posició sn-3 de l'esquelet de glicerol, amb diferents funcionalitat (amida, carbamat, sulfonamida...) i cadenes laterals diverses a la posició sn-2. Entre els diferents productes sintetitzats, alguns d'ells van presentar nivells d'inhibició destacables, no obstant quan es va estudiar la selectivitat sobre cPLA2 es va observar que també inhibien aquest enzim.Per tal de poder conèixer millor la estructura del centre actiu de l'enzim en estudi i poder dissenyar millors inhibidors es van clonar i expressar en bacteri dos fragments del centre catalític del enzim. Desafortunadament, aquests fragments s'expressaven en petites quantitats i s'agregaven en cossos d'inclusió i els diferents experiments que es van realitzar per resoldre aquests problemes no van conduir a resultats satisfactoris.Durant el transcurs de la tesi, es van preparar, també, diferents anàlegs de ceramida. Els assaigs preliminars d'aquests compostos en diferents enzims del metabolisme d'esfingolípids van mostrar que s'havia dissenyat i sintetitzat una nova família de compostos que obre una línia de recerca prometedora en el camp dels esfingolípids. / In last decades, researchers have demonstrated that lipids are not only structural compounds of cellular membranes. These compounds have several functions in cell metabolism, specifically, phospholipids are cleaved by phospholipases, and their metabolites are secondary messengers in inflammation pathways. Moreover calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2) might be linked to schizophrenia. Synthesis of new inhibitors of this enzyme has been the main aim of this work.In our group we have designed different analogues of the only inhibitor of this enzyme (BEL). We introduced several modifications and functional groups, like trifluoroketones, in BEL's structure. Unfortunately, any of these compounds could not inhibit the activity of the enzyme. Some compounds that have an ariloxigroup in alpha position of ketone increase activity of iPLA2 and not produce the same effect in cPLA2.Then, we have synthesized analogues of the natural substrate of phospholipases with several modifications; thioether group in sn-1 position, phosphorilcholine group in sn-3 position and different functional groups (amide, carbamate, sulfonamide.) in sn-2 position.Some of these compounds show inhibition of iPLA2, moreover, they also inhibit cPLA2.To know more information about catalytic mechanism of this phospholipase and design new inhibitors we have cloned and expressed two fragments of catalytic site of the enzyme. However these proteins are not soluble and its levels of expression were very small, and we could not do structural studies like X-ray crystallization.Furthermore, we have designed and synthesized analogues of ceramide. Biological assays of these compounds in several enzymes of sphingolipid metabolism proved that this family opens a new research line in sphingolipid field.

S'ha desenvolupat una nova metodologia que permet unir covalentment l'oligonucleòtid antisentit i el seu mRNA diana mitjançant la formació d'entrecreuaments amb unitats de trans-Pt(NH3)2.En primer lloc, s'han sintetitzat dos derivats fosforamidit de nucleòsid amb grups imidazole i tioèter units a la nucleobase, respectivament, que permeten incorporar aquestes modificacions en oligonucleòtids seguint la metodologia estàndard del fosfit triester. La introducció d'aquests nous grups funcionals a l'extrem 5' no afecta substancialment l'estabilitat del dúplex amb la cadena complementària.S'han portat a terme assajos de platinació d'oligonucleòtids modificats de mida petita amb l'objectiu d'avaluar la capacitat dels nous grups funcionals de coordinar-se a l'ió metàl·lic, així com amb oligonucleòtids de seqüència mixta amb una o dues modificacions a l'extrem 5'. A partir dels resultats obtinguts s'han dissenyat dues estratègies d'entrecreuament: mitjançant hibridació de l'adducte intracadena oligonucleòtid modificat-transplatí a la cadena complementària, o bé partint del dúplex oligonucleòtid antisentit/cadena complementària i afegint transplatí. En ambdós casos s'ha obtingut el mateix adducte intercadena. La caracterització de tots els adductes platinats s'ha portat a terme per oxidació amb H2O2 i digestió enzimàtica, i posterior anàlisi per espectrometria de masses MALDI-TOF.Dels experiments realitzats s'ha conclòs que la millor combinació suposa la introducció del nucleòsid amb el grup imidazole a l'extrem 5' de l'oligonucleòtid antisentit, seguit del nucleòsid amb el grup tioèter. En la reacció amb transplatí es forma ràpidament i regioselectiva un adducte intracadena, en el qual el platí coordina un nitrogen imidazòlic i el sofre del tioèter. La reacció d'entrecreuament té lloc de manera que l'ió metàl·lic migra del sofre al nitrogen 7 d'una guanina situada enfront dels nucleòsids modificats, mantenint-se inalterada la unió al nitrogen imidazòlic de la cadena antisentit. La presència d'una unitat trans-Pt(NH3)2 entrecreuant ambdues cadenes comporta un gran augment de l'estabilitat tèrmica del dúplex. Finalment, s'ha demostrat que la reacció d'entrecreuament només té lloc quan existeix reconeixement entre l'oligonucleòtid modificat i la cadena complementària, resultat rellevant per a una possible aplicació d'aquesta metodologia en el camp de la teràpia antisentit on la diana tant pot ser el mRNA com els miRNAs. / IN ENGLISH:New methodology to allow a covalent union between an antisense oligonucleotide and the mRNA target has been developed. The crosslink is established through a trans-Pt(NH3)2 unit.First of all, two phosphoramidite nucleoside analogs with imidazole and thioether groups linked to the nucleobase, respectively, were synthesized. These derivatives allow the introduction of such modifications in oligonucleotides using standard phosphite triester methodology. The introduction of such modifications at the 5' end does not affect substantially the stability of the duplex with the complementary chain.Oligonucleotide platination assays have been carried out, first with small modified model chains to evaluate the ligand capability of the new functional groups, and then with mixed sequences containing either one or the two modifications at the 5' end. On the basis of the results obtained, two crosslinking strategies have been designed: hybridization of the modified oligonucleotide-transplatin intrachain adduct to the complementary chain, and mixing the antisense oligonucleotide, the complementary chain and transplatin. In the two cases, the same interchain adduct was obtained. All platinated adducts have been characterized by oxidation with H2O2 and enzymatic digestion, as well as MALDI-TOF mass spectrometric analysis. The conclusion from these experiments is that best results are obtained when imidazole-modified nucleoside is placed at the 5' end of the antisense oligonucleotide, next to the thioether-derivatized nucleoside. The reaction with transplatin gives quickly and regioselectively an intrachain adduct in which platinum coordinates one nitrogen of the imidazole ring and the sulfur of the thioether. The crosslinking reaction involves a rearrangement that takes the metal ion from sulfur to the nitrogen 7 of the guanine opposite the modified nucleosides, keeping unaltered the union to the imidazole nitrogen of the antisense chain. The presence of the trans-Pt(NH3)2 moiety crosslinking the two chains notably increases the thermal stability of the duplex. Finally, it has been demonstrated that crosslinking reactions only take place when there is molecular recognition between the antisense oligonucleotide and the complementary chain, which is highly relevant for the possible antisense application of this methodology for targeting either mRNA or miRNAs.

Els malalts de Gaucher manquen de l’activitat normal de l’enzim lisosomal Glucocerebrosidasa (GCase), una β–glucosidasa que hidrolitza l’enllaç glicosídic entre la glucosa i la ceramida, i són incapaços de metabolitzar la Glucosilceramida, que s’acumula a l’interior dels lisosomes dels macròfags impedint que aquests funcionin correctament. La presència de mutacions en el gen precursor de la GCase provoca un plegament incorrecte de la proteïna en el recicle endoplasmàtic i impedeixen el seu transport al lisosoma on hidrolitza el substrat i, per tant, aquest últim s’acumula en els lisosomes. Per altra banda, la proteïna es degradada en el mateix reticle endoplasmàtic o en l’aparell de Golgi pels proteasomes. Els tractaments actuals per a aquesta malaltia es basen en la inhibició de la producció de substrat utilitzant inhibidors de l’enzim implicat en la seva biosíntesi o en l’augment de l’enzim mitjançant reemplaçament enzimàtic. Durant els últims anys s’han desenvolupat diverses estratègies terapèutiques per a la malaltia de Gaucher. Entre elles, una que ha despertat un gran interès consisteix en el disseny de xaperones farmacològiques, que són inhibidors competitius de l’enzim que, a concentracions subinhibitòries, s’uneixen a l’enzim mutant per a formar un complex que l’estabilitza, facilita el seu correcte plegament i posterior transport al lisosoma, resultant en un augment de l’activitat enzimàtica i una reducció del substrat acumulat. A partir de treballs previs en el nostre grup d’investigació en els que s’han obtingut una sèrie d’aminociclitols que es comporten com a inhibidors selectius de la GCase recombinant (imiglucerasa), en aquesta tesi s’ha treballat en el disseny i síntesi de nous potencials inhibidors de la GCase que actuïn com a xaperones farmacològiques, especialment sobre variants neuronopàtiques. Per aquestes raons, els objectius i l’estructuració del treball van ser els següents: 1) Síntesi dels epòxids ciclofelitol i (1R,6S)-epi-ciclofelitol i avaluació com a inhibidors irreversibles de la imiglucerasa i la β–glucosidasa d’Streptomyces sp. wt. 2) Síntesi d’una família d’aminociclitols C7N, relacionats estructuralment amb la Glucosilceramida, el substrat natural de la GCase. 3) Síntesi de noves sèries d’amino- i diaminociclitols, realitzant modificacions en la configuració d’alguns centres de l’anell de ciclitol i en la naturalesa dels substituents. 3) Disseny i síntesi d’una nova família de ciclitols amb estructura bicíclica formats per un anell polihidroxilat de 6 baules fusionat amb una isourea o una guanidina cíclica de 5 baules. Es va estudiar la importància que té la configuració dels centres en l’activitat inhibidora de la GCase. S’han fet una sèrie d’estudis biològics amb tots els productes sintetitzats. Alguns dels productes van presentar una elevada potència inhibidora de la GCase, tant d’aquest enzim en fibroblasts wild-type com de la imiglucerasa, amb valors de la Ki de l’ordre nanomolar i no van presentar una inhibició destacable sobre altres glicosidases. Després de comprovar que els compostos, que havien resultat ser potents inhibidors de la imiglucerasa, estabilitzen l’activitat d’aquest enzim en condicions de desnaturalització tèrmica, es va estudiar el potencial d’aquests compostos com a xaperones farmacològiques de la GCase amb la col•laboració del Dr. Terry D. Butters. Quan es van tractar els limfoblasts de malalts de Gaucher de les variants N370S o L444P amb alguns dels compostos a concentracions subinhibitòries, es van obtenir augments de l’activitat de la GCase en les cèl•lules tractades respecte a les cèl•lules no tractades. Les concentracions efectives dels compostos en aquest augment són de l’ordre micromolar, nanomolar o fins i tot subnanomolar. Dels resultats obtinguts es pot deduir que, a més de l’alta afinitat per la GCase, alguns compostos presenten la permeabilitat cel•lular, distribució subcel•lular i metabolisme cel•lular adequats per actuar com a xaperones farmacològiques a concentracions molt baixes, de l’ordre nanomolar o inferior. / Gaucher disease (GD) is the most prevalent lysosomal storage disorder caused by a deficiency in the activity of β–glucocerebrosidase (GCase), the lysosomal enzyme responsible for glucosylceramide metabolism into glucose and ceramide. GCase deficiency results in the accumulation of undegraded substrate in the lysosomes of macrophages causing severe symptoms. Approved treatments for GD include enzyme replacement therapy and pharmacological GCase substrate reduction, which are of limited efficacy for disease variants affecting the central nervous system. Recently, a third promising therapeutic option, the pharmacological chaperone therapy, has emerged. This therapy is based on the use of reversible competitive GCase inhibitors that are capable of enhancing its residual hydrolytic activity at sub-inhibitory concentrations by stabilizing the functional form of the misfolded protein and preventing its premature degradation in the endoplasmic reticulum. This improves enzyme trafficking to the lysosome and enhances its hydrolytic activity. The objectives of this thesis were: 1) The synthesis of (i) epoxides cyclophellitol and (1R,6S)- epicyclophellitol, (ii) C7N aminocyclitols derivatives, (iii) new amino- and diaminocyclitol derivatives, and (iv) polyhydroxylated bicyclic isoureas and guanidines. 2) Evaluation of these compounds as inhibitors of recombinant GCase and other glycosidases. Study the effect of the active compounds on the stabilization of recombinant GCase activity against thermal denaturation, to assess the potential of these compounds as pharmacological chaperones (PC). 3) Evaluation of selected compounds as inhibitors of GCase in wild-type human fibroblasts and exploration of the therapeutical potential as PC in human lymphoblasts derived from Gaucher patients homozygous for N370S or L444P variants. When assayed for effects on GCase activity, some of the compounds displayed selective inhibition of GCase with low micromolar to nanomolar IC50’s in isolated enzyme experiments. Interestingly, the active compounds also behaved as GCase inhibitors in wild-type human fibroblasts at nanomolar concentrations. The potential of these compounds as PC was determined by analyzing their capacity for increasing GCase activity in GD lymphoblasts derived from N370S and L444P variants. Some of the compounds are able to increase the GCase activity at low micromolar to subnanomolar concentrations. These results describe a promising series of potent GCase ligands having the cellular properties required for PC.