Memoria para optar el título de Bioquímico / La migración celular es un proceso esencial en organismos pluricelulares, cobrando gran importancia durante la embriogénesis y en la respuesta inmune. Para migrar las células deben ser capaces de generar protrusiones fuera del margen celular. Los principales tipos de protrusiones generados por la polimerización de actina son lamelipodios y filopodios, siendo los primeros generados a través del complejo Arp2/3 (Actin related protein). Se ha reportado que la polimerización de actina es regulada por varias GTPasas pequeñas, entre ellas Rab35, la cual recluta a Rac1 y Cdc42 a sitios de formación de protrusiones modulando la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente. PRPK (p53 related protein kinase) es una quinasa atípica, altamente conservada perteneciente al complejo KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size), el cual modula la eficiencia del reconocimiento de codones de tipo ANN. En Drosophila se ha visto que PRPK es necesario para la integración de las señales de la vía PI3K/TOR, las cuales se traducen en crecimiento celular y proliferación. Sin embargo, hemos visto que la pérdida de función de PRPK altera la forma celular en hemocitos-células inmunes homólogas a los macrófagos-, generando un fenotipo estrellado, similar a la pérdida de función del complejo Arp2/3. Este fenotipo es suprimido al co-expresar Rab35. También se ha reportado la interacción física entre PRPK y Rab35 en células humanas. Con estos antecedentes me propuse determinar si PRPK posee un rol fuera del complejo KEOPS, participando en la dinámica de protrusiones de membrana y el patrón de migración de hemocitos en Drosophila melanogaster. Para ello manipulamos los niveles de PRPK en tiempos y tejidos específicos a través del sistema Gal4/UAS. Se analizó la dinámica del citoesqueleto de actina y los parámetros de migración celular mediante microscopía confocal, en contextos particulares de migración y cultivo celular. Finalmente se realizaron co-inmunoprecipitaciones para determinar la interacción física entre PRPK-Kae1 (otro miembro del complejo KEOPS) y PRPK-Rab35. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que la pérdida de función de PRPK altera la dinámica del citoesqueleto de actina in vitro, el patrón de migración de hemocitos en estadios embrionarios, disminuye el reclutamiento de hemocitos en larvas en respuesta a un daño tisular y disminuye la velocidad de migración de hemocitos en estadío pupal. También se corroboró la interacción física entre PRPK y Rab35 y, aún cuando PRPK interactúa con Kae1, se concluyó que el rol de PRPK en la determinación de la forma celular se debe a un rol no canónico fuera del complejo KEOPS. Estos resultados sugieren que PRPK posee dos roles: Integración de señales de crecimiento y migración celular / Cell migration is an essential process in multicellular organisms, gaining great importance during embryogenesis and in the immune response. To migrate the cells must be able to generate protrusions outside the cell margin. The main types of actin protrusions are lamellipodia and filopodia, both generated by actin polymerization through the Arp2/3 (Actin related protein) complex. It has been reported that the activation of numerous small GTPases complex including Rab35, which recruits Rac1 and Cdc42 to the site of protrusions formation, where the latter are involved in the formation of lamellipodia and filopodia respectively. p53-related protein kinase (PRPK) is a highly conserved atypical kinase. It is a member of the KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size) complex, which modulates the efficiency of recognition of ANN codons. In Drosophila PRPK is necessary for the translation of PI3K/TOR growth signals, which lastly support cell growth and proliferation. However, we observed that loss of function of PRPK alters cellular shape in haemocytes -macrophage-like cells-, generating a star-like phenotype which is also observed in loss of function of the Arp2/3 complex. The phenotype is suppressed by co-expressing Rab35. Also, it has been reported physical interaction between PRPK and Rab35 in human cells. With all this evidence I decided to determine if PRPK has a function independent of the KEOPS complex participating in the dynamics of membrane protrusions and migration pattern of haemocytes in Drosophila melanogaster. To do this, we manipulated PRPK levels in tissues and times specific through the Gal4 / UAS system. In particular contexts, migration and cell cultures, the actin cytoskeleton dynamics and cell migration's parameters were analyzed by confocal microscopy. Finally co-immunoprecipitations were performed to determine the physical interaction between PRPK-kae1 (another member of the complex KEOPS) and PRPK-Rab35. The results obtained in this study show that the loss of function of PRPK alters the dynamics of membrane protrusions in vitro and the migration pattern of embryonic haemocytes, reduces the recruitment of larval haemocytes in response to tissue damage and decreases haemocyte migration rate in pupal stage. We confirmed the physical interaction between PRPK and Rab35 and even when PRPK interacts with kae1, it was concluded that the role of PRPK in determining cell shape is due to a non-canonical role independent of the KEOPS complex. These results suggest that PRPK has two roles: Integration of growth signals and cell migration / Fondecyt

La holoenzima proteína quinasa A (PKA) es un tetrámero que consiste en dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, se encuentra en forma ubicua fosforilando un gran número de proteínas celulares y participa en la regulación de vías metabólicas y otros procesos (transporte de membrana, motilidad celular, expresión génica, apoptosis, aprendizaje y memoria). Las proteínas quinasas no solamente se encuentran en el interior de las células, sino además se observa la "exportación" hacia la superficie de la cara externa de la membrana plasmática de las células (Redegeld, F.A et al., 1999). Este fenómeno de exportación de las proteína quinasas hacia la superficie de la cara externa de las células en cultivo se denomina "ectoquinasas." El objetivo del presente trabajo es estudiar la exportación de la proteína quinasa dependiente del AMPc sobrexpresada en células humanas en cultivo a nivel intracelular o endógeno, a nivel ectópico o en la membrana plasmática, y libre en el líquido extracelular o proteína exógeno. En la presente Tesis se utilizó dos líneas celulares llamadas HEK293T y HELA, realizándose la técnica de transfección por lipofectamina para introducir en estas células la proteína PKA, específicamente el vector (pcDNA3-HA) con el inserto que contiene el gen de la subunidad catalítica con el epítope anti-HA.

La holoenzima proteína quinasa A (PKA) es un tetrámero que consiste en dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, se encuentra en forma ubicua fosforilando un gran número de proteínas celulares y participa en la regulación de vías metabólicas y otros procesos (transporte de membrana, motilidad celular, expresión génica, apoptosis, aprendizaje y memoria). Las proteínas quinasas no solamente se encuentran en el interior de las células, sino además se observa la "exportación" hacia la superficie de la cara externa de la membrana plasmática de las células (Redegeld, F.A et al., 1999). Este fenómeno de exportación de las proteína quinasas hacia la superficie de la cara externa de las células en cultivo se denomina "ectoquinasas." El objetivo del presente trabajo es estudiar la exportación de la proteína quinasa dependiente del AMPc sobrexpresada en células humanas en cultivo a nivel intracelular o endógeno, a nivel ectópico o en la membrana plasmática, y libre en el líquido extracelular o proteína exógeno. En la presente Tesis se utilizó dos líneas celulares llamadas HEK293T y HELA, realizándose la técnica de transfección por lipofectamina para introducir en estas células la proteína PKA, específicamente el vector (pcDNA3-HA) con el inserto que contiene el gen de la subunidad catalítica con el epítope anti-HA.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está compuesto por varios tipos celulares, de los cuales aproximadamente el 90% corresponde a cardiomiocitos y a fibroblastos. Los fibroblastos representan 2/3 de la población total de células del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Este tipo celular puede responder frente a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores, indicativo de una respuesta autocrina. Por acción del TGF-β1 se diferencian a un fenotipo celular altamente secretor de colágeno, el miofibroblasto, principal célula encargada del proceso de cicatrización. Por otra parte, existen antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardíacos la activación de las vías transduccionales que conducen a un aumento en los niveles de AMPc contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Para estos efectos, el AMPc es crítico debido al rol que juegan dos proteínas que se activan cuando aumentan los niveles de éste; estas son Epac (Exchange protein activated by cAMP/ proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc) y PKA (proteína quinasa A). Anteriormente se estudió el rol desempeñando por la Epac en los procesos de adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos, en donde se vio que Epac aumenta la adhesión en ambos fenotipos celulares, y con respecto a migración, se vio que los estímulos que aumentan los niveles de AMPc aumentan la migración en fibroblastos, pero no así en miofibroblastos. Con esto surge la interrogante de saber cómo modula la PKA estos procesos. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol que juega la PKA en adhesión, migración y expresión de colágeno. Se utilizaron estímulos que aumentan los niveles de AMPc (isoproterenol y forskolina), el agonista de la PKA 6-Bz-AMPc y su inhibidor H-89. Nuestros resultados mostraron que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos, hubo un aumento de la adhesión al estimular con isoproterenol y forskolina, pero con 6-Bz-AMPc no se observó un cambio significativo con respecto al control, aunque sí tendió a disminuir lo que indica que la PKA no regula la adhesión celular. En migración no se observa efecto alguno con el agonista de la PKA y en la expresión de colágeno se vio una disminución con isoproterenol, forskolina, 6-Bz-AMPc y Me-AMPc tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. Conclusión: PKA no interviene dentro de los procesos de adhesión y migración, pero sí lo hace en la expresión de colágeno. / The heart is composed by many types of cells, mainly cardiomyocytes and fibroblasts (almost 90% of total cells). Fibroblasts represent two thirds of the whole heart cell population and are responsible for the constant turnover of extracellular matrix proteins. This kind of cells can respond to many cytokines, growth factors and express their receptors indicating an autocrine answer. By the action of TGF-β1, they can be differentiated into a new phenotype called myofibroblasts, highly secreting of collagen and main cell involved into the healing process. Otherwise, there are numerous reports indicating that in cardiac fibroblasts, activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes like adhesion, migration and myofibroblast differentiation. For these effects cAMP is critical due to the role played by two proteins whose activation depends on the increase in the cAMP levels. These proteins are Epac (Exchange protein activated by cAMP) and PKA (protein kinase A). Formerly it was studied the role played by Epac in adhesion and migration of fibroblasts and myofibroblasts. Epac increased cell adhesion in both phenotypes, and about migration, in fibroblasts this phenomenon was increased with all the stimuli that increased the cAMP levels, whereas in myofibroblasts were no effect. So, we can ask about the role lead by PKA in these processes. The objective in this work was determined which role plays PKA in adhesion, migration and collagen expression. We used stimuli that increase cAMP levels (isoproterenol and forskolin), PKA’s agonist 6-ph-cAMP and its inhibitor H-89. Our results showed that both fibroblasts and in myofibroblasts there was an increase in cell adhesion in response to isoproterenol, forskolin and H-89, but with 6-ph-cAMP no significant change was observed respect control but tended to decrease, indicating that PKA is not involved in cell adhesion. In migration no effect was observed with 6-ph-cAMP, and finally in collagen expression these stimuli decreased the expression (we tried with Epac agonist Me-cAMP too) in both phenotypes. Conclusion: PKA does not intervene in adhesion and migration processes, but it does in collagen expression.

Se sabe desde hace tiempo que el NHE1 juega un papel fundamental en la fisiología y fisiopatología del miocardio, En estos procesos la activación por fosforilación del intercambiador pareciera ser clave. Por otro lado, en los últimos años han aparecido trabajos que muestran que la estimulación de la ruta GMPc/PKG determina un efecto antihipertrófico tanto en miocardio adulto como en neonato. Entonces, si GMPc/PKG es capaz de inhibir al NHE1 y además previene el desarrollo de la hipertrofia cardíaca pareciera razonable suponer que estos efectos estén ligados entre sí. En otras palabras, se podría especular que al menos una parte de los efectos antihipertrofiantes de la activación de la ruta GMPc/PKG podrían estar mediados por su acción sobre el NHE1 como hemos sugerido en nuestro trabajo previo (Perez, Piaggio et al. 2007), lo cual podría tener importantes implicancias terapéuticas. Una vez más, la caracterización precisa de las vías de fosforilación del NHE1 y de los efectos que sobre la misma ejerce la activación de la ruta GMPc/PKG será fundamental para conocer más sobre la fisiología del intercambiador y para poder explotar las potencialidades clínicas de los inhibidores de PDE5A. Dado que no existían estudios directos y completos en ningún modelo celular que caractericen esta ruta de señalización, propusimos el estudio de la misma como el objetivo principal del presente trabajo de Tesis Doctoral. <i>(Párrafo extraído del texto a modo de resumen)</i>

El diacilglicerol (DAG) es un importante intermediario en la síntesis de muchas clases de lípidos, y es, además, un segundo mensajero producido en respuesta a diversos estímulos extracelulares, capaz de modular la actividad de numerosas enzimas. Una de las vías de metabolización del DAG es la fosforilación llevada a cabo por las DAGK, para dar ácido fosfatídico (PA). El ácido fosfatídico es también un importante segundo mensajero lipídico involucrado en una gran variedad de respuestas celulares. Dada la importancia fisiológica del DAG y del PA como segundos mensajeros lipídicos, y, teniendo en cuenta los numerosos resultados que indican la presencia de las vías de señalización responsables de la síntesis y degradación de estos segundos mensajeros a nivel nuclear, iniciamos nuestros estudios analizando la actividad de las DAGK en los núcleos de la retina bovina, proyectando la investigación hacia la interpretación de su participación en las funciones esenciales de la retina, la recepción y transmisión de la luz. Además, analizamos a nivel nuclear, en las células fotorreceptoras de la retina, los efectos de la insulina, un reconocido protector del sistema nervioso central (SNC) y modulador de la actividad DAGK en otros tipos celulares del SNC. Mediante un protocolo diseñado en nuestro laboratorio, obtuvimos a partir de la retina entera una fracción nuclear enriquecida en los núcleos de las células fotorreceptoras (FNF). En esta fracción nuclear, se pudo detectar actividad DAGK, transformadora del DAG endógeno y exógeno. Se determinó linealidad en función del tiempo de ensayo, el contenido proteico de la fracción nuclear y se analizaron parámetros cinéticos aparentes (Km y Vmax para cada sustrato). Los resultados con detergentes y sustratos diferentes permitieron sugerir la coexistencia de varios tipos de DAGK. Esto fue confirmado por Western Blot (WB) y se detectaron, además, efectos significativos en el contenido nuclear de estas isoformas por efecto de la luz (aumento de la DAGKδ y disminución de las DAGKe, ß y B). Nuestros hallazgos se reforzaron con ensayos enzimáticos en los que se utilizaron condiciones selectivas (preferenciales) para medir la actividad de las isoformas δ y e.En ellos se observó, por efecto de la exposición de la retinas a la luz, una fuerte correlación entre los cambios en el contenido y la actividad de ambas isoformas en la FNF. Se demostró asimismo que el aumento de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la luz es dependiente de la actividad PIP2-PLC, y se observó que dicho incremento en la condición lumínica no es debido exclusivamente a un aumento del sustrato de la reacción enzimática, DAG, sino que también participa en la activación el PIP2. También demostramos la presencia de la PKCα en la FNF, PKC de tipo convencional que es activada en presencia de Ca2+ y DAG. La exposición de las retinas a la luz produjo un aumento del estado de fosforilación de la PKCα. Dado que la fosforilación de PKC puede ser mediada por la activación de PDK1, que es dependiente de la activación previa de PI3K, enzima participante de la vía de señalización de insulina, el siguiente objetivo fue determinar la presencia de los principales componentes de las vías de señalización de insulina en la FNF. Nuestros resultados demostraron la presencia de Akt total y en su estado fosforilado (proteína quinasa de la via de la PI3K), y de ERK1/2, pERK1/2 y p38 fosforilada (quinasas correspondientes a la vía de las MAPK). Nuestros estudios demostraron, además, que la exposición de las retinas bovinas a la luz produce un aumento en el estado de fosforilación de Akt, y que induce la translocación de ERK1/2 activada a la FNF. Por otro lado, al analizar los efectos directos e indirectos de la insulina sobre la actividad DAGK nuclear en la FNF de retinas expuestas a la luz o a la oscuridad, fue posible demostrar que la insulina es capaz de modular la actividad DAGK nuclear tanto de forma directa (incubación de los núcleos aislados con insulina) como de manera indirecta (incubación de las retinas bovinas con insulina y posterior análisis de la actividad DAGK en la FNF). Además, se observó que la insulina cumple un rol en los cambios de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la luz, y que los efectos de la insulina sobre la actividad DAGK son dependientes de su concentración (los efectos se incrementan con un aumento concomitante de la concentración de insulina empleada en el ensayo enzimático). Teniendo en cuenta los efectos directos de la insulina sobre la actividad DAGK nuclear, analizamos la presencia del receptor de insulina en la FNF por WB e inmunofluorescencia (IF) y demostramos la presencia del mismo en los núcleos de las células fotorreceptoras. Un hallazgo de particular interés fue el de haber demostrado que el contenido del RI aumenta en la FNF cuando las retinas bovinas son expuestas a la luz, lo cual sugiere que la luz puede ser un estímulo capaz de promover la translocación del RI al núcleo de las células fotorreceptoras. Por último, analizamos si la insulina es capaz de participar en la translocación del receptor de insulina al núcleo de las células fotorreceptoras y de mediar la activación de las vías de señalización activadas por la misma a nivel nuclear. Nuestros resultados indicaron que la insulina produce un aumento en el contenido del receptor de insulina nuclear con respecto a la condición luz en ausencia de hormona. Además, la insulina produjo un aumento de ERK1/2 activado en la FNF. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que la exposición de las retinas bovinas a su estímulo natural, la luz, paralelamente a la activación de la típica vía de la fototransducción que se inicia en los segmentos externos, induce a nivel nuclear, la activación de distintas vías de señalización responsables de funciones críticas para la célula, y que a nivel nuclear, pueden intervenir en la transcripción de genes. Nuestros resultados demostraron también que la luz y la insulina son capaces de intervenir en la translocación del receptor de insulina desde la membrana plasmática hacia el núcleo de las células fotorreceptoras, y que la insulina promueve la activación de vías de señalización tanto de forma indirecta, actuando sobre la retina entera, como directa a nivel nuclear, sugiriendo para este último caso que mediaría sus efectos a través de la población nuclear de dicho receptor. / Diacylglycerol (DAG) is an important intermediate in the synthesis of several types of lipids, and it is also a second messenger produced in response to various extracellular stimuli, with the ability to modulate the activity of numerous enzymes. One route of metabolism of DAG is phosphorylation by DAGK to yield phosphatidic acid (PA). PA is also an important lipid second messenger that has been involved in a variety of cellular responses. Given the physiological importance of DAG and PA as lipid second messengers and taking into account the many results that indicate the presence of the signaling pathways responsible for the synthesis and degradation of these second messengers at the nuclear level, we initiated our studies assessing the activity of DAGK in the nuclei of bovine retina, projecting them to the interpretation of their participation in the essential functions of the retina, the receipt and transmission of light. We also analyzed at the nuclear level in retina photoreceptor cells, the effects of insulin, a known protector of the central nervous system (CNS) and DAGK activity modulator in other cell types of the CNS. Using a protocol designed in our laboratory, we obtained from the entire retina a nuclear fraction enriched in photoreceptor cell nuclei (PNF). In the nuclear fraction, DAGK activity could be detected, which is responsible for the transformation of endogenous and exogenous DAG. A linear response was obtained as a function of protein content of the nuclear fraction and as a function of time. The apparent kinetic parameters (Vmax and Km for each substrate) were also determined. The results derived from the different substrates and detergents used suggest the coexistence of various types of DAGK. This was confirmed by Western Blot (WB), and significant effects were detected in the nuclear content of these isoforms by the effect of light (increased of DAGKδ and decreased of DAGK E, ß and B). Our findings were strengthened by further enzyme assays using selective conditions to measure the activity of E and δ isoforms in which, due to the exposure of retina to light, strong correlation was observed between changes in the content and the activity of both isoforms in the PNF. It was also demonstrated that the increase in nuclear DAGK activity in response to light is dependent on PIP2-PLC activity and that this increase in light condition is not due only to an increase of the substrate of the enzymatic reaction, DAG, but also to the fact that PIP2 participates in DAGK activation. We also showed the presence of PKCα in FNF, conventional PKC which is activated in the presence of Ca2+ and DAG. Retina light exposure produced an increase in the phosphorylation status of PKCα. In addition, because phosphorylation of PKC could be mediated by the activation of PDK1, which is dependent on the prior activation of PI3K, an enzyme participant of insulin signaling pathway, our second main objective in the present study was to determine the presence of the main components of the insulin signaling pathway in PNF. Our results showed the presence of total Akt and its phosphorylated state (protein kinase of PI3K pathway) and ERK1/2, pERK1/2 and phospho-p38 (components of the MAP kinases pathway). Our results also showed that light exposure to bovine retinas causes an increase in the phosphorylation status of Akt and induces the translocation of ERK1/2 activated to PNF. In assessing the direct and indirect effects of insulin on nuclear DAGK activity in the FNF from retinas exposed either to light or darkness, it was demonstrated that insulin can modulate DAGK activity nuclear both directly (the incubation of isolated nuclei with insulin), and indirectly (the incubation of bovine retinas with insulin and the subsequent analysis of the DAGK activity in the FNF). We also observed that insulin has a role in the changes of nuclear DAGK activity in response to light, and that these effects on DAGK activity are dependent on its concentration (the effects are increased with a concomitant increase in the insulin concentration used in the enzyme assay). Taking into account the direct effects of insulin on nuclear DAGK activity, we analyzed the presence of the insulin receptor in the FNF by WB and IF and we could interest was to have shown that the contents of RI increase in FNF when bovine retinas are exposed to light, thus suggesting that light can be a stimulus capable of promoting the translocation of RI to the nucleus of the photoreceptor cells. Finally, we examined whether or not insulin is able to participate in insulin receptor translocation to the nucleus of the photoreceptor cells and to mediate the activation of signaling pathways related with insulin at the nuclear level. Our results indicated that insulin causes an increase in the content of the nuclear insulin receptor with respect to light condition in the absence of the hormone. Furthermore, incubation of PNF with insulin resulted in an increase of nuclear, activated ERK1/2. Summing up, our results demonstrate for the first time that light exposure of bovine retinas, its natural stimulus, in parallel to the typical activation of phototransduction pathways which starts in the outer segments, induces, at the nuclear level, the activation of different signaling pathways known to be responsible for critical functions to the cell, as gene transcription. Our results also reveal that light and insulin are involved in the translocation of the insulin receptor from the plasma membrane to the nucleus of the photoreceptor cells. Insulin also promotes the activation of cell signaling pathways, thus indirectly acting on the retina, or directly in the nucleus, suggesting that it mediates their effects through a nuclear population of the insulin receptor.

Memoria de título para optar al título profesional de Bioquímico / La testosterona es la principal hormona sexual masculina, responsable de múltiples efectos en el organismo. Dentro de estos, se ha descrito que es capaz de producir hipertrofia cardiaca tanto in vitro como in vivo. Una de las etapas claves en el desarrollo de la hipertrofia del cardiomiocito consiste en el aumento del consumo de glucosa, como estrategia para aumentar la producción de energía asociada al crecimiento hipertrófico. Si bien la testosterona es capaz de producir hipertrofia cardiaca, no se ha descrito que además aumente la captación de glucosa en cardiomiocitos. Como hipótesis a este problema, se planteó que la testosterona aumenta la captación de glucosa en cardiomiocitos a través del transportador de glucosa GLUT4. Para evaluar esta hipótesis, se realizó cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas y se evaluó la captación de glucosa por medio de la glucosa fluorescente 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenzo-2- oxa-1,3-diazol-4-il) amino)-2-deoxiglucosa) y 2-deoxi-[3H] glucosa en cardiomiocitos estimulados con testosterona. Adicionalmente, se evaluó la participación del transportador de glucosa GLUT4, la proteína Akt, la proteína dependiente del complejo Ca2+/calmodulina (CaMKII) y la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en el proceso. Los resultados obtenidos a través de microscopía de epifluorescencia y centelleo líquido, indican que la testosterona aumentó la captación de la glucosa 2-NBDG y 2-deoxi- [3H] glucosa, respectivamente, alcanzando un valor máximo luego de 2 h de estímulo. La inhibición selectiva del transporte de glucosa a través de GLUT4 con indinavir, bloqueó el aumento en la captación de glucosa por testosterona, sugiriendo la participación de GLUT4 en el proceso. Adicionalmente, cardiomiocitos transfectados con el plasmidio GLUT4myceGFP revelaron que la testosterona aumentó la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática. Mediante ensayos de Western blot se determinó que la testosterona aumentó la fosforilación de las proteínas CaMKII y AMPK (alcanzando un máximo en su fosforilación luego de 15 y 60 min de estímulo, respectivamente), las que resultaron ser claves tanto en la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática, como en la captación de glucosa por testosterona. Finalmente, es posible concluir que la testosterona aumenta la captación de glucosa a través de GLUT4 por medio de la activación de la vía de señalización CaMKII/AMPK. Lo anterior revela el papel de la testosterona en la captación de glucosa en cardiomiocitos, lo cual puede constituir un mecanismo de captación de glucosa destinada a la producción de energía celular, síntesis de componentes necesarios para el crecimiento hipertrófico y otros procesos anabólicos importantes para estas células. / Testosterone is the principal male sexual hormone, and plays a key role in the development of male reproductive tissues. It has been reported that testosterone induces cardiac hypertrophy, both in vivo and in vitro. One critical step during cardiac hypertrophy development is the induction of glucose uptake to improve energy production during cardiac growth. Although it is known that testosterone induces cardiac hypertrophy, its effect on glucose uptake in cardiomyocytes remains unknown. The hypothesis of this work is that testosterone increases GLUT4-dependent glucose uptake by the activation of the CaMKII/AMPK signaling pathway. Experiments were performed in primary cell culture of neonatal cardiomyocytes. To evaluate testosterone-induced glucose uptake in cardiomyocytes, the fluorescent analog of glucose 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose) and 2-deoxy- [H3] glucose were used. Moreover, participation of the glucose transporter GLUT4, as well as the protein Akt, Ca2+/calmodulin complex dependent protein kinase (CaMKII) and AMP-activated protein kinase (AMPK) were assessed. Testosterone increased both 2-NBDG and 2-deoxy-[H3] glucose uptake (by epifluorescence microscopy and liquid scintillation counting, respectively), reaching a peak after 2 h of testosterone stimulation. Indinavir, a specific GLUT4 blocker, inhibited testosterone-induced glucose uptake in cardiomyocytes. In addition, western blot assays showed that testosterone increased phosphorylation levels of both CaMKII and AMPK, after 15 and 60 min of stimulation, respectively. Moreover, both proteins were crucial for GLUT4 translocation to the plasma membrane and glucose uptake induced by testosterone in cardiomyocytes. Taken together, data showed that testosterone increases GLUT4-dependent glucose uptake through CaMKII/AMPK signaling pathway activation. These findings suggest that testosterone increases glucose uptake in cardiomyocytes, which could be necessary for energy production required for cellular homeostasis, cardiomyocyte growth and other important anabolic process in cardiac cells.

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / El cáncer ovárico representa la segunda causa de muerte de origen ginecológico, y el 80-90% corresponde a carcinoma ovárico epitelial (COE), del cual el 40% es de tipo seroso. Esta patología se caracteriza por presentar un transcurso silente, una detección tardía, responder pobremente a terapias, ser altamente angiogénico y de sobrevida muy baja. La etiología del COE no está clara y se postulan varias hipótesis al respecto. En carcinoma de páncreas, colon, tiroide papilar y medular, próstata y neuroblastoma, se ha reportado una sobreexpresión del receptor tirosina kinasa (trkA). En cuanto a su ligando, el factor de crecimiento nervioso (NGF) se ha reportado su participación directa e indirecta a través de su receptor trkA, en la angiogénesis, evento crucial para el desarrollo y progresión del tumor. El factor angiogénico más estudiado es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y se ha encontrado una sobreexpresión de las isoformas 121, 165 y 189, las cuales aumentan por efecto de NGF en explantes de cáncer ovárico epitelial. Si bien, ya se sabe que el receptor trkA y su ligando NGF participan en la angiogénesis del ovario, no hay antecedentes claros que indiquen si el receptor trkA y su ligando NGF están involucrados en la génesis y progresión del COE. Por lo que nos planteamos la siguiente Hipótesis:trkA modifica su expresión durante la carcinogénesis ovárica constituyendo un nuevo marcador tumoral. Para desarrollar este estudio nos propusimos el siguiente Objetivo General: Evaluar los niveles del receptor trkA y de NGF, durante las distintas etapas de transición del epitelio ovárico (desde el tejido ovárico normal al cáncer ovárico epitelial) y si esta expresión se relaciona con la expresión de VEGF. Metodología: En 30 muestras de ovarios: ovarios inactivos (OV-I), tumores benignos (T.Ben), borderline (T.Bord) y COE grados I, II y III (n=5 para cada grupo), se evaluó la localización celular y niveles proteicos del receptor trkA total, trkA-p, NGF y VEGF mediante inmunohistoquímica (IHQ). Para la semicuantificación se sumaron los porcentajes de las intensidades 2 y 3 y se expresó como el porcentaje de células con tinción positiva en el epitelio. Además, en tejidos congelados se analizaron los niveles de mRNA del receptor trkA, NGF y VEGF por RT-PCR, los resultados por PCR fueron normalizados con el gen constituivo β – actina. Resultados: Se encontró un aumento discreto en los niveles de mRNA de NGF durante la progresión carcinogénica, y estos aumentos fueron significativos entre OV-I vs COE I, COE II COE III (p<0,05). En cuanto a la expresión proteica de NGF, también se encontró un aumento significativo entre OV-I vs COE II y COE III (p<0,01). Los productos de splicing alternativos que codifican para las isoformas de VEGF 121, 165 y 189 aumentaron significativamente durante la progresión carcinogénica. VEGF 121 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III vs (p<0,001). VEGF 165 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001), y para VEGF 189 entre OV-I vs COE I, COE II y III (p<0,01). En cuanto a la expresión proteica de VEGF, se encontró un aumento durante la progresión, el cual fue significativo entre OV-I vs COE I, II y III (p< 0,001). Se encontró un aumento gradual y significativo en los niveles de mRNA de trkA, a medida que se va perdiendo la diferenciación celular. Este aumento fue significativo entre T.Bord vs COE I, COE II y III (p<0,01), COE I vs COE III (p<0,001) y COE II vs COE III (p<0,01). En las muestras de ovario normal inactivo y tumores benignos no fue posible encontrar la expresión génica de trkA, en parte por la poca cantidad de epitelio que encontramos en estos grupos. En cuanto a la expresión proteica del receptor trkA total, se observó un aumento gradual y significativo durante la progresión; principalmente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001). De igual forma, los niveles proteicos del receptor activo p-trkA, aumentaron significativamente durante la progresión del COE, entre COE I vs COE III (p<0,01). En los grupos de OV-I, T.Ben y T.Bord, no se encontró tinción positiva para p-trkA. Discusión: Tanto la expresión proteica del receptor trkA total y p-trkA, como los niveles de mRNA de trkA, aumentan durante la progresión carcinogénica, principalmente entre los COE, y dichos aumentos se elevan significativamente con la indiferenciación del tejido, lo que confirmaría su posible uso como marcador de progresión del COE y también como marcador de mal pronóstico, ya que la proteína p-trkA se detectó desde COE I en adelante y a nivel de mRNA no fue detectado en los grupos de ovario inactivo y tumor benigno, sólo a partir de los tumores borderline comienza a detectarse pero muy débilmente, a diferencia de lo que ocurre en COE donde su expresión génica como proteica es muy alta. Este aumento en la expresión proteica de trkA durante la progresión se correlaciona positiva y significativamente con la expresión proteica de NGF y VEGF. Estos últimos corresponden a factores proangiogénicos, importantes para el desarrollo, progresión y metástasis tumoral

El presente trabajo de tesis realizado en un modelo celular de taquicardia crónica inducido por marcapaseo rápido (MR) tuvo como finalidad la comprobación de la hipótesis de que la taquicardia crónica a través del aumento sostenido del calcio (Ca2+) intracelular y la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) promuevan la activación de dos quinasas proapoptóticas, la proteína quinasa II dependiente de Ca2+-calmodulina (CaMKII) y la proteína perteneciente a la familia de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), p38MAPK, que conducen a la activación de la cascada apoptótica. Utilizando corazones enteros y cardiomiocitos de rata y ratón estimulados a baja (0,5Hz) y alta (5 y 8Hz) frecuencia en presencia y ausencia de diferentes compuestos farmacológicos, inhibidores específicos de las quinasas, demostramos que la muerte celular inducida por MR se asocia con el aumento de la activación de las quinasas, CaMKII y p38MAPK, sin embargo, solo la inhibición de CaMKII previno la muerte celular inducida por MR, concluyendo que p38MAPK no está involucrada en la muerte celular inducida por MR. Midiendo Ca2+ y ROS mostramos además que el Ca2+, y no así las ROS, es necesario para la activación de CaMKII durante el MR. Por otra parte, utilizando estabilizadores del receptor de rianodina (RyR2) e inhibidores de la retoma de Ca2+ mitocondrial y de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) demostramos que la activación de CaMKII inducida por MR conduce a un aumento en la probabilidad de apertura de los RyR2 que resulta en la pérdida de Ca2+ por el retículo sarcoplasmático (RS) y la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial con la consecuente apertura del mPTP y la liberación de factores que inician la cascada apoptótica. Otro hallazgo importante y hasta ahora sin precedentes de este trabajo de tesis es que la activación de CaMKII durante el MR activa a la NADPH oxidasa resultando en un aumento en la producción de ROS intracelular. Estos ROS oxidarían a los RyR2 aumentando así su probabilidad de apertura. Finalmente, demostramos que la activación de la vía PI3K/AKT juega un papel protector al reducir la muerte celular inducida por MR. Los resultados obtenidos no solo aportan evidencias del rol crítico de la CaMKII en la muerte celular inducida por MR sino que además indican que su blanco de acción sería el RyR2. Se propone que la estabilización de los RyR2 podría resultar en una novedosa estrategia terapéutica para el tratamiento del remodelado adverso asociado con la taquicardia crónica.

En esta tesis se presentan varias aproximaciones computacionales aplicadas al estudio de las interacciones proteína-ligando en el sistema enzimático CDK2/Ciclina A (Cyclin Dependent Kinase 2/Cyclin A). Los métodos computacionales utilizados están dirigidos a estudiar la afinidad, por el sitio activo del ATP (Adenosin Trifosfato) en la CDK2, de un grupo de moléculas derivadas de las O6-ciclo-hexil-metil-purinas N2-sustituidas. Primero, por medio de cálculos realizados con el método ONIOM (Our own N-layered Integrated molecular Orbital and Molecular mechanics), se han logrado caracterizar energéticamente dos de las tres interacciones de puente de hidrógeno, de un grupo de inhibidores, con la región bisagra de la CDK2. Se discute principalmente la influencia de la geometría de los puentes de hidrógeno en las energías obtenidas y se comparan los resultados obtenidos con el método ONIOM con resultados obtenidos con niveles de cálculo MP2 en los mismos modelos. Luego, la afinidad de un grupo de moléculas de la misma familia se trata de explicar utilizando un descriptor obtenido con los métodos de cálculo híbridos QM/MM (Quantum Mechanics/Molecular Mechanics). Por medio de éste método se logró obtener un descriptor de las interacciones de cada inhibidor dentro del sitio activo de la CDK2 y que puede ser utilizado como un índice de la actividad biológica, al menos dentro del grupo de moléculas estudiadas que pertenecen a una misma clase. A partir de las estructuras obtenidas de las dinámicas moleculares ha sido posible caracterizar interacciones de puente de hidrógeno entre algunos de los inhibidores y los aminoácidos de la “superficie especifica” de la CDK2, que antes no habían sido reportadas. Una partición de la energía de interacción en sus componentes de van der Waals y electrostática, permite discutir más detalladamente la importancia de cada componente en la interacción proteína-ligando. Finalmente, con la obtención de estructuras de mínima energía a partir de los cálculos QM/MM y con la construcción de modelos más completos a partir de estas, pudimos aplicar los índices de blandura local y regional en la interacción de cada inhibidor con la región bisagra, los cuales fueron obtenidos con dos aproximaciones diferentes (orbitales moleculares frontera y la densidad de estados), y estos ayudan a clasificar las interacciones de los inhibidores con la región bisagra dentro del principio de ácidos y bases duras y blandas (HSBA). Se espera que estás metodologías puedan ser mejoradas y aplicadas a la interacción proteína-ligando en otros sistemas biológicos de interés en la química medicinal actual.