Une cellule reçoit en permanence des signaux de son environnement. Cette stimulation induit une cascade de signalisation activant un programme génique et protéomique dynamique aboutissant à une réponse cellulaire adaptée. Dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la stimulation du récepteur à l’antigène induit un programme et une réponse anormale à l’origine de la prolifération leucémique. Notre objectif est de caractériser ce programme cellulaire pathologique. Pour cela, nous avons mis en place un modèle de stimulation afin de reproduire ex vivo cette stimulation du récepteur à l’antigène de cellules primaires issues de patients porteurs de LLC et d’activer ce programme cellulaire. Nous avons alors analysé la dynamique transcriptionnelle et protéomique activée dans ces cellules afin de caractériser les anomalies de ce programme. Cette étude nous a permis de mettre en évidence la spécificité de ce programme prolifératif et de caractériser les gènes clés de ce programme tumoral. Ces gènes constituent de potentielles cibles thérapeutiques innovantes. / A cell constantly receives signals from its environment. This stimulation induces a signalling cascade activating a dynamic genic and proteomic program, leading to an adapted cellular response. In chronic lymphocytic leukemia (CLL), an antigen receptor stimulation induces a program and an abnormal response behind leukemic proliferation. Our aim was to characterize the pathological cell program. To achieve this, we have implemented a stimulation model to reproduce ex vivo antigen receptor stimulation of primary cells from CLL patients and activate this cellular program. We then analyzed the transcriptional and proteomic dynamics activated in these cells in order to characterize the abnormalities of this program. This study allows us to highlight the specificity of this proliferative program and to identify key genes of tumor program. These genes constitute potential new therapeutic targets.

La plupart des êtres vivants possèdent une horloge circadienne (période de 24heures). Elle leur permet notamment d’anticiper les changements quotidiens (lumière,température) imposés par la rotation de la terre et d’y adapter leur comportement et leurphysiologie. L’horloge est présente dans la plupart des cellules et repose sur deux boucles derégulation transcriptionnelle négative qui génèrent des oscillations d’ARNm des gènesd’horloge. Un délai entre l’accumulation des ARNm et celle des protéines assure lefonctionnement de la boucle de rétroaction. Ce délai est dû à des modifications posttraductionnellesdes protéines PERIOD et TIMELESS. Les oscillations protéiques sontnotamment contrôlées par leur phosphorylation, l’ubiquitination et la dégradation via leprotéasome. L’ubiquitine ligase SCFSlmb induit la dégradation circadienne de PER et de TIM.SCFJetlag contrôle la dégradation de TIM par la lumière, cette dernière intervenant dans lasynchronisation de l’oscillateur.Au cours de notre étude, nous avons identifié une nouvelle ubiquitine ligase, uncomplexe Cul-3, qui contrôle principalement la stabilité de TIM. Nos résultats indiquent queCul-3 contrôle surtout la stabilité de TIM peu phosphorylé, de façon indépendante de PER,tandis que Slmb contrôle principalement la stabilité de TIM phosphorylé. Nous proposons unmodèle dans l'oscillation de TIM régie par deux systèmes d'ubiquitination: Cul-3 pourretarder l'accumulation nocturne de la protéine, et Slmb pour précipiter sa disparition en finde nuit. / Most living organisms possess a circadian clock (24 hours period). This internal clockallows them to anticipate the daily changes (light, temperature) due to the rotation of theearth and consequently adapt their behavior and physiology. The molecular clock relies ontwo negative feedback loops that generate oscillations of the clock gene mRNA. A delaybetween the accumulation of the mRNAs and the proteins is required for the feedback loop,and is generated by post-translational modifications of PERIOD and TIMELESS. The proteinoscillations are controlled by their phosphorylation, ubiquitination and proteasomedependentdegradation. The ubiquitin ligase SCFSlmb induces the circadian degradation ofPER and TIM. SCFJetlag controls the light-dependent degradation of TIM, which is involved inthe resetting of the clock.In our study, we have identified Cul-3, as a new clock ubiquitin ligase that controlsTIM stability. Our results indicate that Cul-3 mostly controls the stability ofhypophosphorylated TIM, independently of PER, whereas SLMB controls the stability ofphosphorylated TIM. We propose a model where TIM oscillations are regulated by twoubiquitination process. Cul-3 delays the night accumulation of TIM, whereas Slmbprecipitates its degradation at the end of the night.

Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. / Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.

L'entrée des cellules en mitose se caractérise par l'augmentation d'expression de la kinase Aurora A. Nous avons caractérisé l'effet du sn38, métabolite actif de l'irinotecan utilisé dans le traitement du cancer colorectal sur l'expression de cette kinase. En absence de traitement, le facteur de transcription c-myc se lie au promoteur d'Aurora A et l'active. Cependant, le traitement des cellules avec du sn38 induit l'inhibition de c-myc et son absence du promoteur d'Aurora A s'accompagnant de l'induction du processus de sénescence. Nous avons également étudié l'effet de l'oncogène Ras sur la kinase Aurora A. Cet oncogène induit une diminution d'expression d'Aurora A par une modulation de l'activité des cofacteurs transcriptionnels de c-myc. En résumé, nos résultats indiquent qu' Aurora A est une cible des traitements de chimiothérapie et des mécanismes de contrôles oncogéniques. Le blocage de son expression constitue certainement une protection contre le développement tumoral.

La biologie est un domaine scientifique qui reste encore très incomplet au sens où la somme de connaissances qu'il nous reste à découvrir est non négligeable. Il est fréquent que les techniques de laboratoire traditionnelles soient inadaptées à la complexité du problème traité. Une raison possible à cela est que leur mise en œuvre requiert souvent beaucoup de temps et/ou de moyens financiers. Par ailleurs, certaines d'entre elles produisent des résultats peu fiables ou à trop faible débit. C'est pourquoi ces techniques peinent parfois à apporter des réponses aux nombreuses questions biologiques non résolues. En parallèle, l'évolution des biotechnologies a permis de produire massivement des données biologiques. Les expériences biologiques à haut débit permettent à présent de caractériser des cellules à l'échelle du génome et sont porteuses d'espoir pour la compréhension de phénomènes biologiques complexes. Ces deux faits combinés ont induit un besoin croissant de mathématiciens et de statisticiens en biologie. La tâche des bioinformaticiens est non seulement d'analyzer efficacement les masses de données produites par les expériences à haut débit et d'en extraire une information fiable mais aussi d'élaborer des modèles de systèmes biologiques menant à des prédictions utiles. L'inférence de réseaux de régulation et la recherche de gènes de maladie sont deux exemples parmi d'autres, de problèmes où une expertise bioinformatique peut s'avérer nécessaire. L'inférence de réseaux de régulation consiste à identifier les relations de régulation transcriptionnelle entre des gènes régulateurs appelés facteurs de transcription et des gènes cibles. Par ailleurs, la recherche de gènes de maladie consiste à déterminer les gènes dont les mutations mènent au développement d'une maladie génétiquement transmise. Dans les deux cas, les biologistes sont confrontés à des listes de milliers de gènes à tester. Le défi du bioinformaticien est donc de produire une liste de priorité où les interactions ou gènes candidats sont rangés par ordre de pertinence au problème traité, en vue d'une validation expérimentale. Les deux problèmes mentionnés plus haut partagent une caractéristique commune : ce sont tous les deux des problèmes de priorisation pour lesquels un petit nombre d'exemples positifs est disponible (des interactions connues ou gènes de maladie déjà identifiés) mais pour lesquels on ne dispose pas de données négatives. En effet, les bases de données biologiques ne reportent que rarement les paires de gènes non interactives. De même, il est difficile voire impossible de déterminer à coup sûr qu'un gène n'est pas impliqué dans le développement d'une maladie. Par ailleurs, des nombreux exemples indéterminés existent qui sont par exemple des gènes dont on ne sait pas si ils interagissent avec un facteur de transcription ou encore des gènes dont on ne sait pas s'ils sont causaux pour une maladie. Le problème de l'apprentissage à partir d'exemples positifs et indéterminés (PU learning en anglais) a été étudié en soi dans le domaine de l'apprentissage automatique (machine learning). L'objet de cette thèse est l'étude de méthodes de PU learning et leur application à des problèmes biologiques. Le premier chapitre présente le bagging SVM, un nouvel algorithme de PU learning et évalue ses performances et propriétés sur un jeu de données standard. L'idée principale de cet algorithme est d'exploiter au moyen d'une procédure voisine du bagging, une caractéristique intrinsèque d'un problème de PU learning qui est que l'ensemble des exemples indéterminés contient des positifs cachés. Le bagging SVM atteint des performances comparables à l'état de l'art tout en faisant preuve de bonnes propriétés en termes de rapidité et d'échelle par rapport au nombre d'exemples. Le deuxième chapitre est consacré à SIRENE, une nouvelle méthode supervisée pour l'inférence de réseaux de régulation. SIRENE est un algorithme conceptuellement simple qui donne de bons résultats en comparaison à des méthodes existantes pour l'inférence de réseaux. Enfin, le troisième chapitre décrit ProDiGe, un algorithme pour la priorisation de gènes de maladie à partir d'exemples positifs et indéterminés. Cet algorithme, issu du bagging SVM, peut gérer la recherche de gènes de maladies à l'échelle du génome et permet d'intégrer plusieurs sources de données. Sa capacité à retrouver correctement des gènes de maladie a été démontrée sur un jeu de données réel.

L'expression des gènes codant pour le Système de Sécrétion de Type III (SST3), facteur de virulence majeur de Pseudomonas aeruginosa, est activée par ExsA. Ce facteur de transcription appartient à la famille des régulateurs de type AraC/XylS caractérisés par un domaine de fixation à l'ADN comportant deux motifs hélice-tour-hélice. L'activité de ces protéines est généralement régulée par la fixation d'un ligand sur un domaine supplémentaire non conservé. Ce ligand peut être de nature protéique dans le cas de certains régulateurs contrôlant la synthèse de SST3. Ainsi, l'activité transcriptionnelle de ExsA est inhibée par l'anti-activateur ExsD. L'étude de la fonctionnalité de ExsA et de ses domaines par des approches in vitro et in vivo a révélé que le domaine C-terminal de ExsA est bien le domaine de fixation à l'ADN et que deux monomères se fixent sur le promoteur de l'opéron des gènes de régulation du SST3 (pC). Ce domaine isolé possède une affinité pour pC et une activité transcriptionelle inférieure à celle de ExsA. En effet, la fixation efficace de ExsA sur le promoteur pC requiert sa dimérisation à travers son domaine N-terminal. La dernière hélice  de ce domaine N-ter semble jouer un rôle majeur dans la dimérisation de ExsA. Le deuxième objectif de ma thèse était de comprendre l'interaction entre ExsA et ExsD et d'identifier le mécanisme grâce auquel l'inhibiteur empêche ExsA d'activer la transcription des gènes du SST3. Après co-production des deux protéines, le complexe ExsA/ExsD a été purifié puis caractérisé. ExsA et ExsD forment un complexe hétérodimérique au sein duquel l'inhibiteur empêche le facteur de transcription de se fixer à l'ADN.

La caractérisation des modules cis-régulateurs (CRM) ainsi que de leur activité sont essentiels pour comprendre la régulation des gènes au cours du développement des métazoaires. La technique de l'immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquenage à haut débit de l'ADN (ChIP-seq) constitue une approche puissante pour localiser les CRM. Afin de localiser des facteurs génériques au sein de tissus spécifiques, nous avons développé une approche ChIP-seq sur des noyaux triés par cytométrie de flux et localisons des modifications post-traductionelles de l'histone H3, ainsi que l'ARN polymérase II (PolII) dans le mésoderme de la Drosophile. Nous montrons que les CRM actifs sont caractérisés par la présence d'H3 modifiés (K27Ac et K79me3) et de PolII. De plus, la présence et la forme des signaux correspondants à ces marques corrèlent dynamiquement avec l'activité des CRM. Enfin, nous prédisons la présence de CRM actifs et confirmons leur activité in vivo à 89%. Paralllement, nous étudions comment cinq facteurs essentiels au développement cardiaque se coordonnent en cis au sein du mésoderme dorsal, précurseur des mésodermes cardiaque (MC) et viscéral (MV). Nous démontrons que ces facteurs sont recrutés en tant que collectif au niveau des CRM cardiaques via un nombre limité de sites de fixation et en l'absence de contraintes architecturales. En outre, nous découvrons que ces facteurs cardiaques sont recrutés au niveau de CRM actifs dans le MV voisin et activement réprimés dans le MC, reflétant ainsi l'origine tissulaire commune de ces deux populations cellulaires. Nous concluons que les CRM impliqués dans le développement peuvent présenter une empreinte développementale.

La plupart des êtres vivants possèdent une horloge circadienne (période de 24heures). Elle leur permet notamment d'anticiper les changements quotidiens (lumière,température) imposés par la rotation de la terre et d'y adapter leur comportement et leurphysiologie. L'horloge est présente dans la plupart des cellules et repose sur deux boucles derégulation transcriptionnelle négative qui génèrent des oscillations d'ARNm des gènesd'horloge. Un délai entre l'accumulation des ARNm et celle des protéines assure lefonctionnement de la boucle de rétroaction. Ce délai est dû à des modifications posttraductionnellesdes protéines PERIOD et TIMELESS. Les oscillations protéiques sontnotamment contrôlées par leur phosphorylation, l'ubiquitination et la dégradation via leprotéasome. L'ubiquitine ligase SCFSlmb induit la dégradation circadienne de PER et de TIM.SCFJetlag contrôle la dégradation de TIM par la lumière, cette dernière intervenant dans lasynchronisation de l'oscillateur.Au cours de notre étude, nous avons identifié une nouvelle ubiquitine ligase, uncomplexe Cul-3, qui contrôle principalement la stabilité de TIM. Nos résultats indiquent queCul-3 contrôle surtout la stabilité de TIM peu phosphorylé, de façon indépendante de PER,tandis que Slmb contrôle principalement la stabilité de TIM phosphorylé. Nous proposons unmodèle dans l'oscillation de TIM régie par deux systèmes d'ubiquitination: Cul-3 pourretarder l'accumulation nocturne de la protéine, et Slmb pour précipiter sa disparition en finde nuit.

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes. / Dinoflagellates are an important part of the ocean’s ecology due to their large contribution to global carbon fixation, the symbiotic association they can make with corals and by their ability to form algal blooms potentially toxic for humans and animals in coastal communities. However, the molecular biology of dinoflagellates has been poorly studied in the past. Basic knowledge, such as regulation of gene expression, is severely limited. An attempt at deciphering basic gene regulation has been undertaken in the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum and Amphidinium carterae using a reduction in available light intensity to induce the expression of the peridinin chlorophyll-a binding gene encoding the major light harvesting complex protein. A small increase in transcript abundance (less than 2 fold) was found in both short and long term experiments, yet neither yeast one-hybrid assays nor electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed any potential protein interactions with sequence derived from the intergenic spacer of the PCP tandem gene array. Interestingly, an analysis of the recently sequenced L. polyedrum transcriptome revealed an important under-representation of classic DNA-binding domains (such has Heat-shock factor, bZIP and Myb) and an over-representation of the bacterial cold-shock DNA-binding domain. This suggested that components of the transcription regulation machinery may be at least partially different in dinoflagellates.

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un virus oncogène responsable des lymphomes T chez les poulets. L´infection par ce virus est divisée en une phase lytique dépendante de l´expression du gène très précoce ICP4 et une phase latente, caractérisée par l´expression de l’ARN long non codant LAT localisé en antisens. Nous avons montré que l’expression différentielle des miARN du cluster mdv1-miR-M8-M10 était directement corrélée à l’épissage alternatif de l’intron 1 du LAT et plus particulièrement à la biogenèse par le splicéosome du premier mirtron viral. La présence du mirtron mdv1-miR-M6 au milieu du cluster est associée à une cinétique d’expression des miARN. En parallèle, nous avons identifié deux promoteurs alternatifs de type Sp1, quatre signaux poly-A et trois exons associés à la régulation de la transcription du transcrit ICP4. Nous avons prédits cinq isoformes potentielles pour la protéine ICP4 et avons pu observer par immunodétection que la protéine était exprimée principalement dans le cytoplasme des cellules infectées en phase lytique ou de réactivation. / The Marek disease virus (MDV) is an oncogenic herpesvirus responsible of T-cell lymphoma in chicken. MDV infections are divided into a lytic phase, depending on the expression of immediate early gene like ICP4, and a latent phase characterized by the expression of the long non-coding RNA LAT localized in antisense. In this study, we have shown the differential expression of the cluster of miRNA mdv1-miR-M8-M10 was directly correlated with the alternative splicing of LAT’s intron 1 and more specifically with the first viral mirtron biogenesis by the spliceosome. The location of the mirtron mdv1-miR-M6 inside of the cluster is associated with a two-step biogenesis of the miARN of the cluster. On the other hand, we have identified a dual promoter that responded to Sp1, four poly-A signals and three exons that are responsible of transcriptional regulation of ICP4 transcript. We also have predicted five potential isoproteines for ICP4 and were able to observe by immunodetection that ICP4 was mainly expressed in the cytoplasm of infected cells during the lytic phase or the reactivation one.