Le Rice yellow mottle virus (RYMV) est un virus émergeant qui constitue actuellement une contrainte majeure à la riziculture sur le continent africain. Quelques rares variétés de riz, issues des espèces cultivées de riz africain et asiatique (respectivement Oryza glaberrima et O. sativa), ont récemment été identifiées comme hautement résistantes au RYMV. Ce phénotype de résistance est dû à un gène récessif RYMV1 codant le facteur d'initiation de la traduction eIF(iso)4G1 du riz.Les objectifs de cette thèse sont (i) d'étudier la durabilité de la résistance élevée du riz contre le RYMV avant son déploiement à large échelle, (ii) de caractériser les mécanismes d'émergence de génotypes contournants et (iii) d'identifier des signatures moléculaires influençant ces processus d'adaptation. Ainsi, le contournement de deux allèles de résistance, identifiés chez les deux espèces de riz cultivés, a été relié à l'émergence de mutations dans la protéine virale VPg qui permettent de rétablir l'interaction avec le facteur eIF(iso)4G1 de l'hôte résistant. Un site sous sélection diversificatrice de la VPg influence directement la capacité de contournement de la résistance élevée en fonction de l'espèce hôte. Ce site, proche des mutations de contournement, est impliqué dans l'adaptation du virus à l'espèce O. glaberrima au cours de son histoire évolutive. La démarche employée au cours de ce travail combine des études d'évolution expérimentale à des analyses fonctionnelles. Les résultats obtenus par cette approche intégrative participeront à la mise en place de stratégies de lutte intégrée à la fois efficaces et durables face à la maladie de la panachure jaune du riz en Afrique. / The Rice yellow mottle virus (RYMV) is an emerging virus currently considered as the major constraint to rice production in Africa. Some varieties of African and Asian cultivated rice (Oryza glaberrima and O. sativa, respectively), have recently been identified as highly resistant to RYMV. This resistance phenotype is caused by a recessive gene RYMV1 encoding the translation initiation factor eIF(iso)4G1 of rice.The objectives of this thesis are (i) to investigate the durability of the high resistance of rice against RYMV before broadly deployment in fields, (ii) to characterize the mechanisms of emergence of resistance-breaking (RB) genotypes and (iii) to identify molecular signatures that influence these processes of adaptation. The resistance-breaking of two resistance alleles, identified in both cultivated rice species, is mainly associated with the emergence of mutations in the viral protein VPg that restore in resistant hosts the interaction with the factor eIF(iso)4G1. A site of VPg under diversifying selection directly affects the ability to overcome the high resistance depending on the host species. This site, near the RB mutations, is involved in the adaptation of the RYMV to O. glaberrima species during its evolutionary history. The approach used during this work combines experimental evolution and functional analyses. The results of this integrative study will participate in the development of effective and sustainable control strategies toward the Rice yellow mottle virus in Africa.

Ces dernières années, les facteurs du complexe d'initiation de la traduction eucaryote ont été identifiés comme des déterminants essentiels dans la sensibilité des plantes aux virus à ARN, y compris les potyvirus, genre le plus important à la fois de par leur nombre et leur importance économique chez des espèces légumières, fruitières et de grandes cultures.En particulier, les allèles récessifs mo11 et mo12 du gène mo1 précédemment identifié comme codant pour le facteur d'initiation de la traduction eIF4E, sont actuellement utilisés pour protéger les cultures de laitue contre le potyvirus de la mosaïque de la laitue (LMV).Partant des résultats obtenus au laboratoire démontrant que les déterminants du LMV impliqués dans le contournement de la résistance mo1 comprennent non seulement le domaine codant pour la VPg mais aussi, en amont, l'extrémité carboxy-terminale de celui codant pour la CI, mon travail de thèse a consisté à (1) confirmer que le LMV code pour deux facteurs de virulence, la CI et la VPg (2) identifier par mutagenèse dirigée et aléatoire des acides aminés clés de la CI impliqués dans le contournement de la résistance contrôlée par eIF4E (3) entamer une caractérisation fonctionnelle des interactions impliquant les trois partenaires eIF4E, CI et VPg.Les résultats obtenus ont montré que l'échange de la VPg d'un isolat virulent (LMV-E) dans un non virulent (LMV-0) est suffisant pour restituer la compatibilité complète avec les variétés de laitue portant l'allèle mo11, mais pas mo12, alors que la région codant pour la portion C-terminale de la CI et la 6K2, suffit pour contourner les deux allèles de mo1. Le mutant ponctuel dans la CI (LMV-0-S621T) obtenu par mutagenèse dirigée est capable de contourner la résistance conférée par mo12 et partiellement celle conférée par mo11 tandis que le mutant réciproque (LMV-E-T621S) perd sa capacité à contourner les deux allèles de résistance. Il s'agit donc là du premier exemple d'un gène de CI de potyvirus, agissant comme un déterminant de contournement de la résistance récessive contrôlée par eIF4E. En effet, la VPg des potyvirus a été identifiée jusque là comme l'unique facteur de virulence vis-à-vis de eIF4E. Il semble donc que le LMV puisse utiliser deux facteurs viraux (CI et VPg) pour le contournement des allèles de résistance mo1.Cette propriété, associée au fait que des isolats de LMV d'origine sauvage ou ornementale soient capables d'évoluer vers le contournement pourraient donc présenter un risque pour la durabilité des résistances mo1. Des travaux préliminaires ont été menés lors de cette thèse afin de mieux comprendre le rôle exact des mutations des facteurs de virulence dans le processus évolutif d'adaptation du LMV aux pressions imposées par les allèles mo1.Enfin, l'implication de la CI dans le contournement de la résistance mo1 laisse supposer que cette protéine pourrait elle aussi interagir (comme la VPg), directement ou non, avec eIF4E. Nous avons montré pour la première fois in vitro et in vivo l'interaction entre la région C-terminale de la CI et la protéine eIF4E de laitue. De plus, la mutation en position 621 de la CI ayant un rôle clé dans le contournement de la résistance mo1 ne semble pas affecter ces interactions in vitro

Ces dernières années, les facteurs du complexe d'initiation de la traduction eucaryote ont été identifiés comme des déterminants essentiels dans la sensibilité des plantes aux virus à ARN, y compris les potyvirus, genre le plus important à la fois de par leur nombre et leur importance économique chez des espèces légumières, fruitières et de grandes cultures.En particulier, les allèles récessifs mo11 et mo12 du gène mo1 précédemment identifié comme codant pour le facteur d'initiation de la traduction eIF4E, sont actuellement utilisés pour protéger les cultures de laitue contre le potyvirus de la mosaïque de la laitue (LMV).Partant des résultats obtenus au laboratoire démontrant que les déterminants du LMV impliqués dans le contournement de la résistance mo1 comprennent non seulement le domaine codant pour la VPg mais aussi, en amont, l’extrémité carboxy-terminale de celui codant pour la CI, mon travail de thèse a consisté à (1) confirmer que le LMV code pour deux facteurs de virulence, la CI et la VPg (2) identifier par mutagenèse dirigée et aléatoire des acides aminés clés de la CI impliqués dans le contournement de la résistance contrôlée par eIF4E (3) entamer une caractérisation fonctionnelle des interactions impliquant les trois partenaires eIF4E, CI et VPg.Les résultats obtenus ont montré que l'échange de la VPg d'un isolat virulent (LMV-E) dans un non virulent (LMV-0) est suffisant pour restituer la compatibilité complète avec les variétés de laitue portant l'allèle mo11, mais pas mo12, alors que la région codant pour la portion C-terminale de la CI et la 6K2, suffit pour contourner les deux allèles de mo1. Le mutant ponctuel dans la CI (LMV-0-S621T) obtenu par mutagenèse dirigée est capable de contourner la résistance conférée par mo12 et partiellement celle conférée par mo11 tandis que le mutant réciproque (LMV-E-T621S) perd sa capacité à contourner les deux allèles de résistance. Il s’agit donc là du premier exemple d'un gène de CI de potyvirus, agissant comme un déterminant de contournement de la résistance récessive contrôlée par eIF4E. En effet, la VPg des potyvirus a été identifiée jusque là comme l’unique facteur de virulence vis-à-vis de eIF4E. Il semble donc que le LMV puisse utiliser deux facteurs viraux (CI et VPg) pour le contournement des allèles de résistance mo1.Cette propriété, associée au fait que des isolats de LMV d’origine sauvage ou ornementale soient capables d’évoluer vers le contournement pourraient donc présenter un risque pour la durabilité des résistances mo1. Des travaux préliminaires ont été menés lors de cette thèse afin de mieux comprendre le rôle exact des mutations des facteurs de virulence dans le processus évolutif d’adaptation du LMV aux pressions imposées par les allèles mo1.Enfin, l’implication de la CI dans le contournement de la résistance mo1 laisse supposer que cette protéine pourrait elle aussi interagir (comme la VPg), directement ou non, avec eIF4E. Nous avons montré pour la première fois in vitro et in vivo l’interaction entre la région C-terminale de la CI et la protéine eIF4E de laitue. De plus, la mutation en position 621 de la CI ayant un rôle clé dans le contournement de la résistance mo1 ne semble pas affecter ces interactions in vitro / In recent years, the factors of the eukaryotic translation initiation complex were identified as essential determinants of plant susceptibility to RNA viruses, including potyviruses, the largest and economically the most important of the plant virus groups. Members of this group are responsible for important virus diseases affecting all types of vegetable, fruit, and field crops.In particular, the recessive alleles mo11 and mo12 of mo1 gene, which previously identified as encoding for the translation initiation factor eIF4E, are currently used to protect lettuce crops against lettuce mosaic potyvirus (LMV).Based on the results obtained in the laboratory showing that the LMV determinants involved in the mo1 resistance overcoming include not only the area encoding for the VPg but also upstream, the C-terminal region of that encoding for the CI, my work of thesis consisted in (1) confirm that LMV encodes for two virulence factors, CI and VPg (2) identified by site-directed and random mutagenesis a key amino acids of the CI protein involved in eIF4E-mediated resistance overcoming (3) initiate a functional characterization of interactions involving the three partners eIF4E, VPg and CI.The results obtained showed that the exchange of VPg of a virulent isolate (LMV-E) in a non-virulent (LMV-0) is sufficient to restore full compatibility with lettuce cultivars carrying mo11 allele, but not mo12, whereas the region encoding for the C-terminal portion of the CI and 6K2, is sufficient to overcoming both mo1 alleles. The point mutation in the CI (LMV-0-S621T) obtained by site-directed mutagenesis is able to overcome the resistance conferred by mo12 and partly that conferred by mo11 while the reciprocal mutation (LMV-E-T621S) loses its ability to overcome both resistance alleles.So this is the first example of a potyvirus CI gene acting as a virulence determinant in overcoming eIF4E-mediated resistance. Indeed, the potyvirus VPg was previously identified as the sole virulence determinant vis-a-vis eIF4E. It seems that LMV can use two viral factors (CI and VPg) to overcome the mo1 resistance alleles.This property, combined with the fact that LMV isolates from the wild or ornamental origin are able to evolve towards the overcoming could therefore pose a risk to the durability of the mo1 resistance. Preliminary works were carried on during this thesis to better understand the exact role of mutations affecting virulence factors in the evolutionary process of adaptation of LMV to the pressures imposed by mo1 alleles.Finally, the involvement of the LMV CI in mo1 resistance breaking suggests that this protein could also interact (such as VPg), directly or indirectly with eIF4E. We have shown for the first time in vitro and in vivo interactions between the C-terminal region of the CI protein and the lettuce eIF4E protein. In addition, the mutation at position 621 of the CI which has a key role in mo1 resistance overcoming does not seem to affect these interactions in vitro.

La maladie de la Sharka est due à un virus de quarantaine, le Plum Pox Virus (PPV), infectant les arbres fruitiers du genre Prunus. Il est nécessaire de trouver des moyens de lutte, telle que la sélection de plantes résistantes. Or chez ces espèces, les sources de résistance sont à l’heure actuelle en nombre limité, voire inexistantes. Il a été montré, au laboratoire, que ce virus est capable d’infecter Arabidopsis thaliana et qu’il existe chez cette espèce une grande diversité de réponse à l’infection. En effet nous avons pu observer que les accessions St-0 et JEA avais un comportement résistant, alors que l'accession Cvi-1 été partiellement résistante. Deux méthodes d’inoculation ont été comparées: une inoculation mécanique à partir de feuilles de Nicotiana benthamiana inoculées avec pICPPVnkGFP et une inoculation par agro-infection à partir d’une souche Agrobacterium tumesfasciens contenant l’isolat viral pBINPPVnkGFP. L'emploi de ces deux méthodes d'inoculation nous a permis de mettre en évidence une variabilité de la réponse au PPV en fonction de la méthode utilisée. En conséquence, cette étude visait donc à identifier le ou les facteur(s) de la plante hôte impliqué(s) dans l'infection virale. L'agro-infection de populations recombinantes (F2 et RIL), de lignées multi-parentales ainsi que l'emploi de la génétique d'association a mis en évidence chez St-0 ainsi que dans plusieurs accession distinct (sept) un locus majeur sur le groupe de liaison 3, appelé sha3. Il apparait indispensable dans le mouvement longue distance du PPV. De plus l'utilisation de la génétique d'association a permis d'initier la cartographie fine de sha3 et de réduire considérablement le nombre de gènes candidats. Un criblage de mutants a été initié afin de déterminer le ou les gènes candidats contrôlant le phénotype Sha3. Après inoculation mécanique, l’analyse d'une population recombinante a mis en évidence la présence d’un locus majeur, distinct de sha3 et positionné au milieu du bras long du groupe de liaison 1. Ce locus co-localise avec rpv1, locus identifié précédemment dans la descendance Cvi x Ler (Sicard, Loudet et al. 2008). Ce même locus a été également confirmé à la fois dans une population multi-parentale et par une approche de génétique d'association. Un gène candidat est actuellement en cours de validation au laboratoire. Une étude visant à décomposer le mécanisme de résistance porté par l’accession JEA a été mise en place. Dans ce cas, il apparait que la propagation du virus est inhibée dans les feuilles de la rosette mais pas dans les tissus floraux. Ainsi, la résistance/sensibilité au PPV chez JEA est fortement conditionnée par les stades physiologiques de la plante hôte. Des travaux complémentaires seront indispensables afin de décrire plus finement ce mécanisme de résistance très particulier. Au terme de cette thèse, nous nous attendons à ce que l’identification de ces nouveaux gènes de résistance chez Arabidopsis permette, après transfert, d’accroître la diversité des sources de résistance à la Sharka chez les arbres fruitiers. / The Plum Pox Virus (PPV) infects Prunus species (stone fruit) and is the causal agent of the Sharka disease. This disease is vastly devastating for fruit and plant productivity and quality. Its cost reaches 10 billions of euros over the last 30 years. Breeding programs have been carried out with the aim to implement resistant cultivars but the number of sources of resistance in Prunus species is rather limited. It has been shown in the laboratory that this virus is able to infect Arabidopsis thaliana with a wide range of response to infection. Indeed, we observed that accessions St-0 and JEA had a resistant behavior, while accession Cvi-1 was partially resistant. Two inoculation methods were compared: mechanical inoculation from Nicotiana benthamiana leaves inoculated with pICPPVnkGFP and agro-inoculation infection from an Agrobacterium strain containing the viral isolate tumesfasciens pBINPPVnkGFP. The use of these two methods of inoculation allows us to highlight variability in the response to PPV depending on the method used. This study aims to identify the factor (s) of the host (s) involved in viral infection. Agro-infection of recombinant populations (F2 and RIL), multi-parental lines and the use of genetic association demonstrate in St-0 and several distinct accessions (seven) a major locus on linkage group 3, called sha3. It appears essential in the long-distance movement of PPV. Use of association genetics helped initiate the fine mapping of sha3 and significantly reduce the number of candidate genes. Screening of mutants was initiated to determine the gene controlling the phenotype Sha3. After mechanical inoculation, the analysis of a recombinant population revealed the presence of a major locus positioned in the middle of the long arm of linkage group 1. This locus co-localizes with rpv1, previously identified in Cvi x Ler offspring (Sicard, Loudet et al. 2008). The same locus was also confirmed with a multi-parental population and by a genetic association approach. A candidate gene is currently being validated in the laboratory. The study of the resistance mechanism carried by the accession JEA was initiated. In this case, it appears that the spread of the virus is inhibited in basal leaves but not in floral stem. The resistance / susceptibility to PPV in JEA appear to be strongly influenced by the physiological stages of the host plant. Further work will be necessary to describe more precisely this resistance mechanism very special. At the end of this thesis, we expect that the identification of these new resistance genes in Arabidopsis allows, after transfer, to increase the diversity of sources of resistance to plum pox virus in fruit trees.

Les facteurs d’initiation de la traduction sont des protéines de plante cruciales pour l’établissement du cycle viral des Potyvirus. Des mutations dans ces facteurs sont la source de résistances récessives chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique. Ces résistances peuvent être déjouées par les Potyvirus, principalement par l’acquisition de mutations dans la VPg (Viral Protein Genome-linked) permettant de rétablir une interaction compatible avec les formes mutées des facteurs eIF4E. Ce modèle simple de co-évolution n’est pas applicable au pathosystème Laitue/LMV (Lettuce mosaic virus). En effet, chez la laitue, deux allèles mo11 et mo1² du gène mo1 codant pour eIF4E confèrent la résistance au LMV. Dans ce pathosystème, la VPg n’a été associée qu’au contournement de l’allèle de résistance mo11. Un deuxième facteur de virulence entre en jeu : la protéine CI (Cylindrical Inclusion, helicase caractéristique des potyvirus), responsable du contournement des résistances mo11 et mo1². L’étude approfondie de la diversité naturelle du LMV a permis d’identifier 4 positions en acides aminés dans la CI, potentiellement impliquées dans le mécanisme de contournement. Celles-ci ont été étudiées par une approche de génétique inverse. Les résultats mettent pour la première fois en évidence l’existence d’un contournement de résistance partiel (toutes les plantes ne sont pas infectées) et graduel (la proportion de plantes infectées augmente avec le nombre de mutations). Par ailleurs, ce contournement est associé au rétablissement du mouvement en systémie du virus en contexte de résistance et est dépendant du fond génétique du virus. / Eukaryotic translation initiation factors are essential host factors required for Potyvirus infection and represent a major component of recessive resistance against potyviruses in several crops. Potyvirus adaptation to eIF4E-mediated resistance usually occurs through mutations in the VPg (Viral Protein Genome-linked), restorating its interaction with the mutated eIF4E factor. Such co-evolution model doesn’t match the Lettuce/LMV (Lettuce mosaic virus) pathosystem. Indeed, two resistance alleles mo11 and mo1² of the mo1 gene encoding eIF4E, confer resistance against LMV in lettuce. The VPg triggers virulence only towards the mo11 allele. Another virulence determinant was identified: the CI (Cylindrical inclusion, potyviral helicase), which was associated with both mo11 and mo1² overcoming. By investigating the LMV natural diversity, we identified 4 amino acid positions in the CI-Cterminus potentially involved in mo1 overcoming. Reverse genetics experiments were carried out, demonstrating that mutations at these positions are associated with a partial (not all the plants are infected) and gradual (increase with the accumulation of mutations) resistance breaking mechanism. Resistance-breaking mutations were shown to restore the systemic movement of the virus and to be influenced by the viral genetic background.

Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est l’un des virus les plus dommageables sur tabac. Pour contrôler les épidémies de PVY, différents allèles du gène de résistance récessive va ont été introgressés dans des variétés de tabac. Ce gène récemment cloné code pour une copie du facteur d’initiation de la traduction (eIF4E-1). Toutefois, l’émergence de variants de PVY contournant va, dont des isolats nécrotiques particulièrement sévères, montre que cette résistance n’est pas toujours durable. L’objectif du travail de thèse était i) de comprendre les mécanismes génétiques modulant la durabilité de la résistance va ii) d’identifier des facteurs génétiques différents de va, contrôlant une tolérance aux symptômes de nécrose nervaire induits par certains isolats de PVY. Le phénotypage, le génotypage et l’analyse du transcriptome de 13 variétés résistantes portant va montrent que le type de mutation affectant le locus eIF4E-1 ainsi que la fonctionnalité et le niveau d’expression d’autres copies d’eIF4E impactent la durabilité de va. Nos données permettent de proposer un modèle de leurre où la surexpression de la copie eIF4E-2, sous l’effet de la délétion complète du gène eIF4E-1 et partielle du gène eIF4E-3, limiterait l’apparition de variants contournants, augmentant ainsi la durabilité de la résistance contrôlée par va. En parallèle, un gène R de type NB-LRR nommé NtTPN1 (pour Nicotiana tabacum Tolerance to PVY-induced Necrosis1) a été identifié comme étant directement impliqué dans l’absence de développement de la nécrose nervaire induite par les isolats nécrotiques de PVY. Le phénotype de tolérance au PVY conféré par NtTPN1 ouvre de nouvelles perspectives de contrôle du PVY et en particulier des isolats nécrotiques capables de contourner la résistance liée à va. / Potato virus Y (PVY) is one of the most damaging viruses on tobacco crops. To control PVY, allelic forms of the recessive resistance gene va were introgressed into many tobacco cultivars. This gene was recently identified and encodes a copy of eukaryotic initiation translation factor (eIF4E-1). However, the va-mediated resistance is sometimes overcome by resistance-breaking variants including particularly severe necrotic isolates. The present PhD project had two objectives i) to further our understanding of the mechanism(s) modulating va-mediated resistance durability ii) to identify new, vaindependent genetic factors confering tolerance to veinal necrosis symptoms induced by necrotic PVY isolates. Phenotypic, genetic and transcriptomic analyses of 13 resistant tobacco accessions showed that the type of mutation at the locus eIF4E-1, together with the functionality and expression levels of other eIF4E copies, impact va-mediated resistance durability. The results obtained support a decoy model where the overexpression of the eIF4E-2 gene, as a consequence of the complete deletion of eIF4E-1 and of the partial deletion of eIF4E-3, would limit the ability of PVY to evolve towards resistancebreaking, increasing va-mediated resistance durability. In parallel, a NB-LRR R gene, called NtTPN1 (for Nicotiana tabacum Tolerance to PVY-induced Necrosis1) directly involved in the tolerance to PVY-induced systemic veinal necrosis symptoms in tobacco was identified. The phenotype of tolerance to PVY conferred by NtTPN1 opens novel breeding options to minimize the impact of the emerging and so far uncontrolled va-mediated resistance breaking necrotic PVY isolates.