Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) est un virus filamenteux flexible dont son unique protéine structurale est la protéine de capside (CP), composée de 215 acides aminés. La structure tertiaire de cette protéine, tout comme celle de ses homologues, n'est pas connue. Le but de ce projet est de caractériser la structure et la dynamique de la PapMV CP par RMN multidimensionnelle. Afin d'y arriver, une forme de protéine utilisable pour la RMN, d'un poids moléculaire évitant d'outrepasser les 30 kDa, a d'abord été identifiée : la PapMV CP27-215. Un protocole d'expression à haut rendement a été développé et nous avons marqué cette protéine avec le 15N et le 13C, ce qui impliquent une expression en milieu minimum. La RMN est aussi une méthode qui exige une très grande pureté de la protéine. Par conséquent, une approche de purification efficace a été développée. En plus d'une protéine pure et marquée, la RMN exige que celle-ci soit soluble, concentrée et stable. Ces exigences ont été répondues afin de répondre à l'objectif premier de ce projet.

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L’α-synucléine est une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson qui forme des agrégats fibrillaires pathologiques. Une séquence précise de 12 acides aminés est essentielle pour que le phénomène d’agrégation ait lieu. Le peptide correspondant à cette séquence (noté α-syn71-82) a été synthétisé et étudié par dichroïsme circulaire, spectroscopie infrarouge et RMN solide du 31P, afin de mieux comprendre sa structure, ses interactions membranaires ainsi que son mécanisme de fibrillation. Les résultats montrent que le peptide adopte une conformation majoritairement désordonnée en solution. À haute concentration ou basse température, les chaînes peptidiques s’assemblent de façon réversible en oligomères en formant des feuillets-β intermoléculaires. L’α-syn71-82 interagit fortement avec les membranes anioniques mais n’interagit pratiquement pas avec les membranes zwitterioniques. Grâce aux interactions électrostatiques entre le peptide chargé positivement et les membranes chargées négativement, le peptide semble adopter une structure en feuillets-β parallèles et agrégés.

La soie d’araignée, notamment la soie produite par la glande ampullacée majeure (Am), est reconnue comme ayant une ténacité élevée, une bonne résistance mécanique tout en demeurant extensible. Sa structure moléculaire et ses propriétés sont influencées par des facteurs externes comme l’humidité relative et la vitesse de filage. La fibre, par exemple, se contracte de près de la moitié de sa longueur lorsqu’elle est exposée à une humidité élevée, un phénomène nommé supercontraction. Cette étude vise à mieux connaître les propriétés de la soie naturelle et à développer éventuellement une fibre synthétique équivalente. Nous avons caractérisé les fibres de soie Am par spectromicroscopie Raman en lumière polarisée et par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide. La première technique permet de quantifier l’orientation des protéines de soie et de caractériser leur structure secondaire. La RMN permet de déterminer la structure secondaire et la dynamique de relaxation des acides aminés. Les fibres Am de deux espèces d’araignées, Nephila clavipes et Araneus diadematus, ont été obtenues par filage forcé à différentes vitesses (de 0,3 à 2,0 cm/s) et soumises à des taux d’humidité relative supérieurs à 90%. Deux groupes d’araignées ont été marqués isotopiquement avec des solutions de 1-13C-Gly et 1-13C-Ala afin d’analyser la structure et la dynamique d’acides aminés particulièrement importants. Les résultats montrent que l’amplitude de la supercontraction augmente avec la vitesse de filage. Les données indiquent qu’à 1,0 cm/s, l’orientation moléculaire est maximale et qu’elle diminue au-dessus et au-dessous de cette vitesse. Ceci suggère qu’il existe une vitesse de filage pour laquelle les propriétés sont optimales. Les temps de relaxation T1 et T1r des échantillons marqués concordent avec les résultats de spectromicroscopie Raman et suggèrent que les microcristaux de feuillets b de la soie subissent une contraction qui renforce les liaisons intermoléculaires en présence d’eau. / Spider silk, especially the silk produced by the major ampullate glands (Am), is known to have high tenacity, good resistance, and yet remains extensible. Its molecular structure and properties are influenced by external factors such as relative humidity and spinning speed. Fibers, for example, shrink by almost half their length when exposed to high humidity, a phenomenon called supercontraction. This study is intended to better understand the properties of natural spider silk and therefore aid the development of an equivalent synthetic fiber. We characterized Am silk fibers by polarized-light Raman spectromicroscopy and solid-state nuclear magnetic resonance (NMR). The first technique allows for quantification of the orientation of the protein chains and characterization of their secondary structure. Solid-state NMR is used to determine the secondary structure and dynamics of amino acids. The silk of two spider species, Nephila clavipes and Araneus diadematus, was obtained by forced spinning at different speeds (from 0.3 to 2.0 cm/s) and subjected to relative humidity levels greater than 90%. Two groups of spiders were isotopically labeled with 1-13C-Gly and 1-13C-Ala solutions in order to analyze the structure and dynamics of particularly important amino acids. The supercontraction results show that the amplitude of the supercontraction increases with the reeling speed. The data show that at a reeling speed of 1.0 cm/s, the molecular orientation is maximum and decreases above and below this value. This suggests that there is a spinning speed where the properties are optimal. The measurements of the relaxation times T1 and T1r of the labelled samples are consistent with Raman spectromicroscopy results and suggest that b-sheet microcrystals of silk undergo a contraction which strengthens the intermolecular bonds in the presence of water.

Dans l’industrie laitière, la présence de bactériophages dans du lait destiné à la fabrication de fromage peut retarder ou arrêter le processus de fermentation par les bactéries lactiques. La bactérie Lactococcus lactis, largement utilisée comme levain de départ, est la proie de plusieurs de ces virus, dont le phage p2, du groupe sk1-like de la famille des Siphoviridae. À ce jour, le mécanisme d’infection des bactériophages reste incompris. La prise de contrôle de la machinerie cellulaire par les phages est assurée par les gènes précoces et médians de ces derniers. La structure du phage p2 est connue, mais ses gènes précoces et médians codent pour des protéines qui ne possèdent pas d’homologues de structure ou de fonction connue. Ces gènes ont été clonés dans des systèmes d’expression bactériens afin de les exprimer, purifier, et en déterminer la structure par cristallographie aux rayons X. Parallèlement, la protéine codée par le gène orf47 a été synthétisée commercialement pour déterminer sa structure par résonance magnétique nucléaire. Nous espérons que l'obtention de la structure de ces protéines aidera à leur suggérer un rôle par recherche d’homologie structurale avec des protéines de rôle connu. Des cristaux ont été obtenus pour les protéines ORF-24, SaV (exprimée du gène orf26) et ORF-37, mais plus de travaux sont nécessaire afin de pouvoir obtenir leur structure. La structure d’ORF-47 a été déterminée par résonance magnétique nucléaire et démontre une homologie structurale avec les domaines B, C et E de la protéine staphylococcale SpA, domaines liant les immunoglobulines G de l’homme. La liaison de protéines similaires chez L. lactispar ORF-47 reste à être vérifié expérimentalement. / Cheese fermentation is a process in which milk is fermented by the Gram-positive bacteria Lactococcus lactis. However, the fermentation can be slowed or even stopped if specifi lactococcal bacteriophages are present in the medium. To this day, the infection mechanism of bacteriophages is still not fully known. The hijacking of the cell’s molecular machinery is carried out by proteins expressed by the phages’ early- and mid-expressed genes. The phage studied in this thesis is phage p2, of the Caudovirales order, Siphoviridae family and sk1-like group. The structure of phage p2 is known, but most early-and mid-expressed proteins do not have homologues of known structure or function in the public databases. These genes were cloned in a bacterial expression system in order to be expressed and the proteins purified and crystallized to determine their structure by X-ray crystallography. The protein encoded by the gene orf47 was commercially synthesized to be studied by nuclear magnetic resonance. Our overall goal is to suggest roles for these proteins by obtaining their structure and performing a structural homology query. Crystals were obtained for the proteins ORF-24, SaV (expressed from the gene orf26) and ORF-37 but more work is required in order to determine their structure. The structure of ORF-47 was obtained by nuclear magnetic resonance and has been found to have a fold highly similar to domains B, C and E of staphylococcal protein SpA. These domains bind human immunoglobulin G. The binding of similar proteins in L. lactis by ORF-47 has yet to be experimentally confirmed.

Développer de nouvelles méthodes pour l'étude des interactions entre les membranes cellulaires et diverses molécules bioactives telles que des peptides, des protéines ou des médicaments est d’une grande importance. Ces interactions sont primordiales dans l’activité de ces composés et leur meilleure compréhension pourrait permettre, entre autres, la mise au point de nouveaux médicaments, l’amélioration de leur efficacité et la diminution de leur toxicité. La spectroscopie RMN des solides est une technique de choix pour l’étude de telles interactions. Plus spécifiquement, l’utilisation de sondes membranaires est courante et permet d’accéder à de nouvelles expériences. Le projet de thèse principal porte sur la synthèse et l’étude de phospholipides monofluorés pour leur validation comme sonde membranaire modèle en RMN des solides. Le fluor possède de nombreuses caractéristiques chimiques et spectroscopiques d’intérêt pour son utilisation pour l’étude de complexes de biomolécules en spectroscopie RMN. La présente thèse rapporte d’abord les travaux de synthèse de trois nouveaux analogues monofluorés de la dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), ayant un atome de fluor sur la chaîne acyle en position 2 du glycérol, dans le but de mimer les membranes eucaryotes. L’étude des propriétés de ces trois nouveaux F-DMPC, ainsi que de trois dérivés synthétisés antérieurement, réalisée principalement en spectroscopie infrarouge et en RMN des solides, est aussi présentée. Dans l’ensemble, les résultats ont montré que l’incorporation d’un atome de fluor à la DMPC induit des perturbations significatives, mais que des mélanges F-DMPC/DMPC composés d’au maximum 25% de phospholipides monofluorés se comportent de façon similaire aux membranes de DMPC. Afin de valider ce nouveau modèle, l’orientation de deux peptides antimicrobiens au comportement connu a été estimée dans des membranes contenant 25% de F-DMPC. Pour tous les F-DMPC, la RMN de l’azote-15 a montré que l’orientation des peptides n’était pas affectée par la présence de DMPC monofluorée. De tels mélanges pourraient ainsi être utilisés comme sonde membranaire pour l’étude d’interactions entre ces membranes et différentes molécules bioactives par RMN des solides. La thèse présente aussi le développement d’une méthodologie de synthèse flexible de phosphatidylglycérols. Puisque des chaînes acyle identiques ou différentes et de longueur variée peuvent être incorporées, cette méthodologie permettra d’accéder aux F-DMPG en vue de mimer les cellules procaryotes. Le second projet de thèse porte sur l’étude de nouveaux peptides modèles afin de mettre au point un outil pour évaluer l’épaisseur des membranes biologiques. Une série de peptides analogues au peptide antimicrobien synthétique MSI-103 ayant différentes longueurs, appelés KIAn, a d’abord été synthétisée et étudiée afin d’étudier l’importance du concept de décalage hydrophobe dans la formation de pores transmembranaires et l’activité des peptides. Cette étude a démontré que la longueur est un facteur clé dans l’activité de ces peptides : ils doivent être suffisamment longs pour traverser l’épaisseur hydrophobe des bicouches lipidiques. Toutefois, dans le design de la série KIAn, les peptides plus longs sont davantage chargés et ce facteur peut aussi affecter la tendance observée. Cette thèse rapporte donc les travaux menés afin de vérifier l’influence de la charge cationique des peptides KIAn dans leur activité. Deux nouvelles séries de peptides de longueur variable (14 à 28 acides aminés) et de charge globale constante (+7), appelées KIA(7)n et KIXAn, ont été synthétisées et analysées par différentes techniques (dichroïsme circulaire, tests biologiques, spectroscopie de fluorescence, RMN de l’azote-15). Cette étude a permis de confirmer l’importance du principe de décalage hydrophobe et l’absence d’effet dû à la charge des peptides dans leur activité. Elle a ainsi permis de valider l’utilisation de ces peptides comme règle moléculaire afin d’estimer l’épaisseur des bicouches lipidiques. / The development of new methodologies to investigate interactions between cell membranes and various bioactive molecules such as peptides, proteins or drugs is of primary importance. These interactions are essential for the activity of those compounds and a better understanding would allow, among others, the development of new drugs, the improvement of their efficiency and the reduction of their toxicity. Solid-state NMR spectroscopy is a method of choice to study membranes – molecules interactions. Specifically, using membrane probes is common and allows to access new experiments. The main project within this thesis focuses on the synthesis and study of monofluorinated phospholipids for their validation as model membranes probe in solid-state NMR. Fluorine possesses numerous chemical and spectroscopic characteristics of interest for its use to study biomolecule complexes in NMR spectroscopy. This thesis reports the synthesis of three new monofluorinated analogs of dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), having one fluorine atom located on the acyl chain at position 2 of the glycerol, with the goal of mimicking eukaryotic membranes. Property studies of these three new F-DMPCs and of three previously synthesized derivatives are also presented. Overall, the results have shown that the incorporation of a fluorine atom into DMPC perturbs significantly the membrane properties, but that F-DMPC/DMPC mixtures containing 25% F-DMPC or less behave in a similar way to DMPC membranes. To validate this new model, the orientation of two antimicrobial peptides having a known behaviour in the presence of DMPC membranes has been estimated in F-DMPC/DMPC (1/3) membranes. For all F-DMPC, 15N NMR has shown that peptide orientation is not affected by the presence of monofluorinated DMPC. Such mixtures can therefore be used as membrane probes to study interactions between them and various bioactive molecules with solid-state NMR. This thesis also presents the development of a new and flexible synthetic methodology of phosphatidylglycerols. As identical or different acyl chains with various lengths can be incorporated, this methodology will allow access to F-DMPG in order to mimic prokaryotic cell membranes. The second thesis project focuses on the study of new model peptides in order to develop a new tool to evaluate biological membrane thickness. A series of peptides analogues to the antimicrobial synthetic peptide MSI-103, having various lengths and called KIAn, have first been synthesized and studied to investigate the importance of the hydrophobic mismatch in the formation of pores and in the activity of these peptides. This study showed that peptide length is a key factor in their activity: the length must be sufficient to span the hydrophobic thickness of the lipid bilayers. However, the design of KIAn peptides implies that longer peptides are more charged and this factor can also influence the observed tendency. Therefore, this thesis reports our study aimed at verifying the influence of global cationic charge of KIAn peptides on their activity. Two new peptide series of various lengths (14 to 28 amino acids) and of constant global charge (+7), called KIA(7)n and KIXAn, have been synthesized and analyzed with several techniques (circular dichroism, biological tests, fluorescence spectroscopy and 15N NMR). This study confirmed the importance of hydrophobic mismatch and the absence of charge effect in the activity of these peptides. It also validated the use of these peptides as molecular rulers to estimate the hydrophobic thickness of lipid bilayers.

Ce mémoire est divisé en quatre chapitres. D’abord, une introduction initie le lecteur au domaine des neurosciences. Ensuite, le chapitre 1 décrit les étapes de la dissection virtuelle par tractographie, à partir du phénomène physique de la diffusion jusqu’aux mesures statistiques des structures de la matière blanche. Le chapitre 2 présentera une nouvelle méthode d’assurance qualité, basée sur l’analyse volumique des faisceaux de la matière blanche, la contribution principale de ce mémoire. Finalement, la conclusion contient une discussion des problématiques non résolues ainsi que des perspectives d’avenir pour la tractographie.