Dans les cellules eucaryotes, des altérations du microenvironnement cellulaire ou desmutations des protéines de la voie de sécrétion induisent un stress du RE et activent uneréponse adaptative nommée UPR. Les signaux intracellulaires associés à l’UPR sont transmisde la lumière du RE vers le noyau par trois protéines transmembranaires dont IRE1α aussiappelée ERN1. Lors d'un stress du RE, IRE1α s'oligomérise, activant ses domaines kinase etendoribonucléase desquelles découle une signalisation intracellulaire complexe. Denombreuses études reliant l'UPR au cancer désignent IRE1α comme un acteur majeur de latumorigenèse, en particulier dans la croissance et la vascularisation des glioblastomes (GBM),bien que les mécanismes précis mis en jeu restent à déterminer. Des études menées dans notrelaboratoire ont identifié deux cibles de l'activité endoribonucléase d'IRE1α (RIDD) : SPARCet PER1, comme effecteurs respectifs des effets pro-migratoire, pro-angiogénique et proprolifératifd'IRE1α dans les GBM. De plus, ces dernières années, le séquençage d'IRE1α apermis d'identifier environ cinquante mutations, dont quatre non silencieuses ont étéidentifiées dans des biopsies de GBM. L'expression de ces quatre mutations, dont A414Tidentifiée dans le laboratoire, dans les cellules U-87 MG, et l'implantation de ces cellules dansle cerveau de souris a permis de mettre en évidence le rôle pro tumoral de la mutation A414Tet le rôle anti-tumoral de la mutation P336L. A414T stabilise les oligomères d'IRE1α, suractivantles voies de signalisation en aval et conduisant à une croissance plus rapide et unevascularisation plus importante des tumeurs. Ainsi, nos travaux confirment qu'IRE1α est unrégulateur central du développement des GBM et pourrait constituer un marqueur pronostic etune cible thérapeutique des GBM. / In eukaryotic cells, alterations in the cellular microenvironment or mutations in the protein secretory pathway induce ER stress and activate an adaptive response termed UPR. The intracellular signals associated with UPR are transmitted from the ER lumen to the nucleus by three transmembrane proteins among which IRE1α also called ERN1. During ER stress, IRE1α oligomerizes, activating its kinase and endoribonuclease domains and a downstream complex intracellular signaling. Many studies linking the UPR to cancer point to IRE1α as a major player in tumorigenesis, particularly in the growth and vascularization of glioblastomas (GBM), although the precise mechanisms involved remain to be determined. Studies led in our laboratory have identified two targets of IRE1α endoribonuclease activity (RIDD): SPARC and PER1 as respective effectors of pro–angiogenic, pro-migratory and proproliferative effects of IRE1α in GBM. In addition, in recent years, IRE1α sequencing identified around fifty mutations, four of which have been identified in GBM biopsies. The expression of these four mutations, including A414T identified in the laboratory, in the U-87 MG cells, and implantation of these cells into mouse brain has highlighted the pro-tumoral role of the A414T mutation and the anti-tumor role of the P336L mutation. A414T oligomers stabilize IRE1α, over-activating downstream signaling pathways and leading to a faster growth and greater tumor vascularization. Thus, our work confirms that IRE1α is a central regulator of GBM development and may be a prognostic marker and therapeutic target in GBM.

Il est bien accepté dans des modèles en culture que les dynamiques mitochondriales et le remodelage des crêtes régulent le fonctionnement mitochondrial sous diverses conditions de stress, particulièrement l’apoptose et la famine. Malgré la quantité impressionnante de recherche effectuée dans ce domaine, on en connait encore très peu au sujet de l’importance des dynamiques mitochondriales et du remodelage de la structure mitochondriale sous des conditions physiologiques. Dans les années 1960, Hackenbrock a démontré que des mitochondries isolées adoptent des conformations internes distinctes selon l’état métabolique. D’après ses observations, il a prédit que les changements ultrastructurels de la mitochondrie régulent la production fonctionnelle de l’organite. Cependant, il n’est pas évident que ces changements ultrastructuraux suivent bien les changements métaboliques in vivo dans des conditions physiologiques. De plus, le métabolisme hépatique nécessite une adaptation constante de la production bioénergétique et biosynthétique de la mitochondrie suite aux changements de l’état anabolique/catabolique de la cellule hépatique. Toutefois, le fonctionnement de ce processus est encore largement inconnu. Dans cette étude, nous apportons les premières descriptions quantitatives in vivo de la réponse adaptative du réticulum mitochondrial aux transitions métaboliques du foie. Grâce à un modèle hépatique de souris postprandiale et une analyse cryo- microscopie électronique (cryo-EM) quantitative, nous montrons que, 5 heures après un repas, la voie mTORC1 est bloquée, le réseau mitochondrial se fragmente, la densité des crêtes diminue et la capacité respiratoire des mitochondries chute. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation parallèle de la longueur des contacts mitochondrie-réticulum endoplasmique (MERCs), qui contrôle les échanges de calcium et de phospholipides entre les deux organites. De plus, ces évènements sont associés à l’expression transitoire de deux fragments C-terminaux (CTFs) inconnus jusqu’à présent provenant de la protéine Optic atrophy-1 (OPA1), une GTPase qui régule les dynamiques des crêtes mitochondriales et des mitochondries. Grâce à un protocole in vitro, nous montrons que ces CTFs proviennent d’un nouveau clivage d’OPA1, appellé clivage-C, qui élimine l’activité d’OPA1 en la coupant. Plus important encore, nous montrons que le clivage-C nécessite la présence de Mitofusin-2 (MFN2), une protéine clé dans la régulation de la fusion mitochondriale et dans la génèse des MERCs, mais pas la présence de l’homologue Mitofusin-1 (MFN1), ce qui confirme le lien entre le remodelage des crêtes et l’assemblage des MERCs. / It is well established in cultured models that mitochondrial dynamics and cristae remodeling regulate mitochondrial function under different stress conditions, such as starvation and apoptosis. Despite the tremendous amount of research in this field, relatively little is known about the significance of mitochondrial dynamics and ultrastructure remodeling under normal physiological conditions in vivo. In the 1960’s, Hackenbrock demonstrated that isolated mitochondria adopt distinct internal conformations under different metabolic states. Based on these observations, he predicted that mitochondrial ultrastructural changes regulate the organelles functional output. However, whether these ultrastructural changes also accompany metabolic transitions in vivo, under physiological conditions, is not known. Further, hepatic metabolism requires mitochondria to adapt their bioenergetic and biosynthetic output to the ever-changing anabolic/catabolic state of the liver cell, but the wiring of this process is still largely elusive. In this study, we provide the first in vivo quantitative description of the adaptive response of the mitochondrial reticulum to hepatic metabolic transitions. Using a postprandial mouse liver model and quantitative cryo-EM analysis we show that at 5 hours after feeding the mTORC1 signaling is blocked, the mitochondria network fragments, the cristae density decreases and the mitochondrial respiratory capacity drops. These changes are accompanied with a parallel increase in the mitochondria-ER contact (MERCs) lengths, which control calcium and phospholipids fluxes between the two organelles. Further, these events are associated with the transient expression of two previously unidentified C-terminal fragments (CTFs) of Optic atrophy-1 (OPA1), a mitochondrial GTPase that regulates cristae and mitochondrial dynamics. Using an in vitro assay, we show that these CTFs originate from a novel OPA1 processing, termed C-cleavage that eliminates OPA1 activity by breaking off the GTPase. Importantly, we show that C-cleavage requires the presence of Mitofusin-2 (MFN2), a key regulator of mitochondria fusion and MERCs biogenesis, but not that of its homolog Mitofusin-1 (MFN1), thereby linking cristae remodeling to MERCs assembly.

La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC), maladie au cours de laquelle les cellules T endommagent la myéline. Les cellules T CD4⁺ jouent un rôle fondamental dans cette pathologie. Le modèle animal d'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE) permet de reproduire les symptômes cliniques de la SEP chez la souris. Bien qu'une grande variété de cellules issues des systèmes immunitaires inné et adaptatif peuvent être impliquées dans la réponse inflammatoire du SNC, les cellules T CD4⁺ sont reconnues comme étant des intervenants importants dans l'initiation et la progression des cellules T vers l'autoréactivité. Dans notre laboratoire, nous travaillons avec la souris 1C6 qui est une souris transgénique pour le récepteur des cellules T (TCR). Cette souris génère des cellules T CD4⁺ et CD8⁺ avec la capacité de reconnaître le peptide MOG[₃₅₋₅₅]. Le développement de cette souris transgénique est un outil inestimable pour l'étude des rôles pathogéniques des différents sous-types de cellules T dans l'EAE. Toutefois, il est possible d'observer que l'exclusion allélique de la chaine α du TCR est incomplète par l'expression de TCR endogène toujours présent dans les souris 1C6. Afin d'obtenir des populations de cellules transgéniques pures, les souris 1C6 ont été croisées avec les souris déficientes en RAG-1. Les gènes RAG-1 et RAG-2 codent ensemble pour former un complexe responsable de la recombinaison V(D)J. Une altération fonctionnelle d'un seul des deux gènes permettraient d'éliminer l'expression endogène du TCR. Le rôle de l'inclusion allélique dans l'élaboration du répertoire de TCR chez la souris 1C6 n'est pas clair. Dans la première partie de ma thèse, j'ai démontré que l'inclusion allélique est cruciale dans la suppression de l'auto-immunité sévère du SNC chez les souris 1C6. J'ai utilisé des souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] dérivées de croisements entre souris 1C6 et NOD Rag1[exposant -/-]. Cette lignée de souris ne permet pas la réorganisation des chaînes TCR α et β endogènes en raison de l'absence de RAG-1. Les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] possèdent moins de cellules T CD4⁺ , CD8⁺ et nous avons démontré que les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] développent une EAE spontanée contrairement aux souris 1C6 x Rag1[exposant +/+]. De plus, les souris 1C6 x Rag1[exposant -/-] présentent une EAE fatale suivant leur immunisation avec le peptide dérivé de la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline MOG[₃₅₋₅₅] et ce, malgré l'absence de lymphocytes T CD8⁺ en provenance de la rate . Nos résultats démontrent un rôle essentiel du réarrangement des chaines de TCR dans le contrôle de la survie des cellules T ainsi que dans la sensibilité des souris 1C6 face à la maladie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle du complexe Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) dans les cellules Th1 et Th17, deux sous-types de cellules T CD4⁺. ERAD est un système de contrôle qualité des protéines situé dans le réticulum endoplasmique (ER). Il permet de sélectivement éliminer les protéines mal repliées ou mal assemblées en les dirigeant vers le cytosol où elles sont dégradées par le système ubiquitine-protéasome (UPS). Sec61 joue un rôle important dans l'importation des protéines nouvellement synthétisées au niveau du ER tandis que le translocon p97 est crucial pour le transport rétrograde des protéines endommagées vers le cytosol. Bien que les rôles de Sec61 et de p97 aient largement été étudiés dans les maladies neurodégénératives et le cancer, leurs fonctions dans les maladies auto-immunes et dans la fonction des cellules T ne sont pas bien comprises. Des études ont démontré que le blocage de Sec61 avec la mycolactone a des effets inhibiteurs immédiats sur la production de cytokines par les cellules immunitaires. Par contre, l'utilisation de l'inhibiteur de Sec61 et la suppression des cytokines dans la SEP sont peu étudiés. Notre objectif est de vérifier les effets d'inhibiteurs de Sec61 et de p97 sur différents sous-types de cellules T. Dans cette étude, nous avons utilisé trois différents inhibiteurs : (1) Eeyarestatin I (ErsI) : inhibiteur de Sec6 et de p97 (2) NMS-873 : inhibiteur spécifique de p97 (3) Apratoxin A : inhibiteur spécifique de Sec61. En vérifiant les effets de ces molécules sur les cellules Th1 et Th17, nous avons observé une suppression substantielle des cytokines pro-inflammatoires dans les deux types de cellules. Elles diminuent également les niveaux de protéines de Stat-1 et de Stat-3, des facteurs des transcription impliqués dans la différenciation des cellules Th1 et Th17, respectivement. Nous avons aussi observé que l'administration du NMS-873 chez les souris C57BL6/J réduit la sévérité de l'EAE. Dans nos travaux futurs, nous explorerons le mécanisme par lequel ces inhibiteurs régulent la signalisation des lymphocytes T. Nous travaux présentent de nouvelles molécules et voies de signalisation d'intérêt pour la découverte de nouveaux traitements de la SEP en ciblant les cellules T CD4⁺. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of CNS in which T cells direct an attack against myelin. CD4⁺ T cells plays a central role in pathogenesis of MS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of MS that recapitulates many of the immune aspects of its pathogenesis. Although various cell types of the innate and adaptive immune system may be responsible for the inflammatory response within the CNS, CD4⁺ T cells are considered as a critical contributor in the initiation and progression of autoreactive T cells. In our lab we used a 1C6 T cell receptor (TCR) transgenic mouse which generates both CD4⁺ and CD8⁺ T cells that recognize MOG[₃₅₋₅₅]. Indeed, the development of these TCR transgenic mice offered a promising tool to study the pathogenic role of individual subsets of T cells in EAE. However, we still observed endogenous TCR expression in these mice, indicating mainly the incomplete allelic exclusion of the TCRα chain. To obtain pure transgenic T cell populations, 1C6 mice were crossed with RAG-1 deficient mice. The RAG proteins (RAG-1 and RAG-2) together form a complex responsible for V(D)J rearrangement. Functional impairment of only one of the two genes was believed to eliminate any endogenous TCR expression. The role played by allelic inclusion in shaping the TCR repertoire of 1C6 mice is unclear. In the first part of the thesis, I have investigated that allelic inclusion is crucial in 1C6 mice for the suppression of severe CNS autoimmunity. I have used 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice which are derived by crossing 1C6 with NOD Rag1[exposant -/-] mice. These mice cannot rearrange endogenous TCRα and β chains due to absence of Rag1. In 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice numbers of both CD4⁺ and CD8⁺ T cells have diminished. We showed that 1C6 x Rag1[exposant -/-] mice develop spontaneous EAE but not 1C6 x Rag1[exposant +/+]. They also rapidly develop fatal EAE upon immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein MOG[₃₅₋₅₅] despite the lack of splenic CD8⁺ T cells. Our data show a critical role for endogenously rearranged TCR chains in mediating T cell survival and disease susceptibility in 1C6 mice. In the second part of the thesis, I have investigated the role of ER-associated degradation (ERAD) in Th1 and Th17 subsets of CD4⁺ T cells. ERAD is a protein quality system that removes misfolded, misassembled proteins in the ER by selectively dislocating them into the cytosol where they are subsequently degraded by the cytosolic ubiquitin proteasome system (UPS). Sec61 plays an important role in the import of newly synthesized proteins into the endoplasmic reticulum (ER), while the p97 translocon is crucial for the retrotranslocation i.e., reverse transport of misfolded proteins to the cytosol. However, while the role of sec61 and p97 has been investigated extensively in neurodegenerative diseases and cancer, their function in autoimmune disease, and in T cell function, are incompletely understood. Previous studies have shown that mycolactone-mediated Sec61 blockade has immediate inhibitory effects on the production of cytokines in immune cells. However, the suppression of cytokines by sec61 inhibitors is not completely explored in MS. Our aim is to investigate the effect of Sec61 and p97 inhibitors in different T cell subsets. In this study, we use three different inhibitors: (1) Eeyarestatin I (ErsI): inhibition of sec61 as well as p97 (2) NMS873: specific inhibitor of p97 (3) Apratoxin A (Apra A): specific inhibitor of Sec61. In this study we have observed that above inhibitors of ERAD substantially suppress the production of pro-inflammatory cytokines in Th1 and Th17 cells. Also decreases protein levels of major transcription factors Stat-1 and Stat-3 involved in differentiation of Th1 and Th17 cells, respectively. We also observed that administration of NMS873 reduces EAE severity in C57BL/6J mice. In future work, we will explore the mechanism by which these inhibitors regulate T cell signaling. Our work thus potentially uncovers novel molecules and pathways in CD4⁺ T cells that could be target for future therapy in MS.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Essentielle à l'équilibre énergétique de la cellule, la mitochondrie, véritable sentinelle, joue, un rôle majeur dans le destin de la cellule, en modulant les voies de signalisation de mort cellulaire mis en jeu dans l'atrophie musculaire. L'objectif de cette thèse est de proposer des cibles thérapeutiques centrées sur la mitochondrie dans deux modèles murins dont la physiopathologie est caractérisée par une dysfonction mitochondriale associée à une atrophie musculaire : le vieillissement et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Pour lutter contre la perte de masse musculaire liée à l'âge, la déficience en myostatine (mstn), associée à un phénotype hypermusculé, est une stratégie thérapeutique prometteuse. Mais, l'altération du métabolisme mitochondrial et oxydatif induite par cette déficience réduit les effets bénéfiques d'une telle stratégie. Nous avons donc testé l'intérêt de l'utilisation de la molécule pharmacologique AICAR, activateur connu de l'AMPK, afin de « booster » la fonction mitochondriale chez la souris âgée KO mstn. Les résultats montrent chez la souris KO mstn, une amélioration du temps d'endurance de course. Au niveau signalétique, le traitement induit des effets bénéfiques mais limités sur la fonction mitochondriale. Les mécanismes restent à préciser mais tendent vers l'hypothèse d'un effet bénéfique de l'AICAR sur le stress du réticulum endoplasmique (RE). Le dysfonctionnement mitochondrial a été également largement impliqué dans la physiopathologie de la DMD. Dans notre seconde étude, ce même traitement à l'AICAR chez le modèle murin de la DMD, la souris mdx atténue le phénotype dystrophique et améliore la fonction contractile du diaphragme. Nous montrons que ces effets bénéfiques sont associés à une induction de mécanisme de survie, l'autophagie, et une limitation des phénomènes d'apoptose induit par la mitochondrie, mettant en évidence une amélioration de l'intégrité mitochondriale par stimulation de leur renouvellement dans des fibres musculaires dystrophiques. Enfin, ce travail a mis en avant pour la première fois la présence à l'état basal de stress du RE chez la mdx, propsant une nouvelle cible thérapeutique. L'impact de ce stress dans la fibre musculaire normal et pathologique est très mal connu. Nos résultats montrent que le stress du RE modifie les liens entre le réticulum sarcoplasmique et la mitochondrie, perturbe l'homéostasie calcique et active les voies de mort cellulaire associées à une dysfonction contractile. Ces résultats ouvrent une perspective de stratégie thérapeutique dans les pathologies musculaire impliquant un stress du RE, comme la DMD. Ce travail de thèse a mis en avant l'importance de développer des thérapies pharmacologiques dans les pathologies musculaires, permettant d'améliorer la fonction à la fois métabolique et de sentinelle de la mitochondrie. / Fundamental for the energetic balance of the cell, mitochondria play a key role for modulation of cell death pathway related to muscular atrophy. Thus, the purpose of this PhD is to find therapeutic strategy focus on mitochondria in two different murine models where the physiopathology is characterized by a mitochondria dysfunction associated with muscle atrophy: Aging process and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).To prevent loss of muscle mass associated with aging, the lack of myostatin, inducing a hypermuscular phenotype, is a promising therapeutic strategy. However, loss of myostatin is associated with a strong reduction of mitochondrial and oxidative metabolism in skeletal muscle, and this strategy need to be potentiated. In this context, we explore if mitochondrial alteration in aged wild-type mice or in aged mstn KO mice are rescued by chronic AMPK-activating treatment, using the synthetic agonist AICAR, considered as “an mimetic of exercise”. Our results show an improvement of aerobic running performance in mstn KO mice. Concerning to signaling pathways, AICAR treatment induces beneficial but limited effects on mitochondrial metabolism. Mechanisms are still under investigation but our results suggest a reduction in ER stress. Moreover, mitochondria dysfunction has been widely implicated in DMD physiopathology. This same treatment of AICAR, in the murine model of DMD, improves the diaphragm histopathology as well as maximal force generating capacity. These beneficial effects were linked with autophagy activation and apoptosis limitation, without inducing muscle fiber atrophy, and promoting the elimination of defective mitochondria.Finally, the last part of this study highlight for the first time, an increase of ER stress at basal level, suggesting a new therapeutic target. Nevertheless, ER stress impact in skeletal muscle fibers is sparsely known. The preliminary results show that ER stress decrease the link between RE and mitochondria, which have an impact on calcium homeostasis and stimulate cell death pathway with a decrease of contractile function.This study highlights the importance to develop pharmacological therapies in muscular pathology, focus on metabolic and sentinel mitochondria function.

De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique. Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR.Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéines. / Numerous genetic diseases are directly associated to the recognition of misfolded proteins by the endoplasmic reticulum (ER) quality control, leading to their retention and subsequently their retrotranslocation to the cytosol for degradation. In the case of mutated glycoproteins such as F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), causing CF pathology, mannose trimming is a key step of this process. Our objective was to identify and characterize molecules targeting ER-mannosidases activity, with the goal to restore F508del-CFTR to the plasma membrane.First, we tested multivalent derivatives, based mainly on Deoxymannojirimycin (DMJ), a specific inhibitor of α-mannosidasesI and revealed their better corrective effect on F508del-CFTR and their mechanism of action. Then we explored the mechanism explaining the higher efficiency of the multivalents compared to the monovalent. Finally, we focused on the role of key players of mannose trimming, ER-α1,2-mannosidase I (ERManI) and EDEMs (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein) proteins on F508del-CFTR trafficking defect. We showed the implication of ERManI, EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR retention, using a siRNA strategy. In conclusion, our study highlights these proteins as potential pharmacological targets to develop correctors for the F508del-CFTR trafficking defect.

L'un des enjeux majeurs de la recherche anti-cancéreuse est de développer de nouvelles thérapies en direction des tumeurs réfractaires aux traitements conventionnels. Dans ce contexte, l'identification récente de l'activité anti-tumorale PPARgamma-indépendante des thiazolidinediones ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques. Au sein du laboratoire, il a été montré qu'un analogue inactif de la TGZ, la delta2-TGZ, induit une dégradation protéasome-dépendante du récepteur alpha aux oestrogènes de manière PPARgamma-indépendante. A partir de ces données, les objectifs de ma thèse ont été 1) de participer à la caractérisation de nouveaux composés à activité anti-cancéreuse 2) de mieux comprendre les mécanismes PPARgamma-indépendants mis en jeu dans l'effet anti-cancéreux des TZD. Lors de ce travail de thèse, nous avons caractérisé de nouveaux composés plus efficaces que la delta2-TGZ pour l'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 et MDA-MB-231 et faiblement toxiques sur des cultures primaires d'hépatocytes humains. De plus, nous avons montré que la delta2-TGZ est capable d'induire un stress du réticulum endoplasmique à des temps précoces dès 3 heures et une apoptose à des temps plus tardifs 48 heures. Cependant, nous n'avons pas pu conclure à l'existence d'un lien entre les deux mécanismes. Enfin, nous avons montré que la biotinylation d'un ligand naturel de PPARgamma, la 15d-PGJ2, accroît son effet anti-prolifératif sur les cellules cancéreuses mammaires MCF-7 et MDA-MB-231 et conduit à un stress du réticulum endoplasmique et à une mort par apoptose. Ces effets sont partiellement dépendants de PPARgamma pour le stress du réticulum endoplasmique mais strictement PPARgamma-indépendants pour l'apoptose. Ce travail pourrait permettre de constituer de nouveaux outils thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein / One of the main goals of the anti-cancer research is to develop new therapeutic option for resistant tumor. In this context, the recent discovery of thiazolidinedione devoid of PPARgamma activity with a strong anti-cancer effect opens new perspectives. In a previous study, the laboratory showed that an inactive derivative of PPARgamma, the delta2-TGZ, induce a proteasome-dependent degradation of estrogen receptor alpha in PPARgamma-independent way. Thus, during my thesis we aimed 1) to participate in the study of new compounds less toxic and more effective to inhibit the proliferation of mammary cancer cells, 2) to better understand PPARgamma-independent mechanisms involved in the anti-cancer effect of the TZD. In the present work, we characterise new compounds more effective than delta2-TGZ to inhibit the proliferation of the breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231 and are less toxic on primary culture of human hepatocytes. We pursued the study on mechanisms involved in PPARgamma-independent anti-proliferative activity of delta2-TGZ. We showed that delta2-TGZ is able to induce endoplasmic reticulum stress as soon as 3 hours and apoptosis in later times 48 hours of treatment. Nevertheless we could not conclude of the existence of a link between these two pathways. Finally, we studied the effect of the biotinylation of a natural ligand of PPAR?: the 15d-PGJ2. This modification drive to an increased effect of the 15d-PGJ2 on the anti-proliferative effect of breast cancer cells, reticulum endoplasmic stress and death by apoptosis. These effects are partially PPARgamma-dependent for reticulum endoplasmic stress and only PPARgamma-independent for apoptosis. This work highlighted new promising tools of breast cancers treatment

Des études épidémiologiques récentes suggèrent que certains polluants atmosphériques jouent un rôle dans le développement et la progression de l'insulino-résistance, associée au diabète de type 2. L'ozone, un polluant photochimique majeur des zones urbaines, est associé t à des concentrations augmentées de glucose et d'insuline plasmatiques à jeun, cependant de nombreux aspects de cette association restent à élucider. En utilisant une concentration réaliste, représentative des pics de pollution (0,8 ppm), nous avons démontré que l'exposition de rats à de l'ozone induit une insulino-résistance systémique et un stress oxydant, associé à un stress du réticulum endoplasmique (RE), une activation de JNK et donc, une perturbation du signal insulinique dans le muscle. Les lavages broncho-alvéolaires réalisés chez des rats exposés à l'ozone, reproduisent ces effets sur des myotubes C2C12, suggérant que des médiateurs pulmonaires toxiques sont responsables de ce phénotype. Des prétraitements avec le chaperon chimique acide 4-phénylbutyrique, l'inhibiteur de JNK SP600125, ou l'antioxydant N-acétylcystéine préviennent l'insulino-résistance, démontrant que l'ozone induit séquentiellement un stress oxydant, un stress du RE et une activation de JNK, entraînant une perte de la sensibilité à l'insuline dans le muscle. Notre étude est la première à montrer que la pollution à l'ozone provoque le développement de l'insulino-résistance, suggérant qu'elle pourrait accélérer la progression du diabète. Nous proposons ainsi un mécanisme liant exposition à des polluants et augmentation de l'incidence des maladies métaboliques / A growing body of evidence suggests that exposure to traffic-related air pollution is a risk factor for type 2 diabetes. Ozone, a major photochemical pollutant in urban areas, is negatively associated with fasting glucose and insulin concentrations but most aspects of this association remain to be elucidated. Using an environmentally realistic concentration (0.8 ppm), we demonstrated that exposition of rats to ozone induced whole body insulin resistance and oxidative stress, with associated endoplasmic reticulum (ER) stress, JNK activation and disruption of insulin signaling in skeletal muscle. Bronchoalveolar lavage fluids from ozone-treated rats reproduced this effect in C2C12 myotubes, suggesting that toxic lung mediators were responsible for the phenotype. Pre-treatments with the chemical chaperone 4-phenyl butyric acid, the JNK inhibitor SP600125 or the antioxidant N-acetylcysteine alleviated insulin resistance, demonstrating that ozone sequentially triggered oxidative stress, ER stress and JNK activation to impair insulin signaling in muscle. This study is the first to report that ozone plays a causative role in the development of insulin resistance, suggesting that it could boost the development of diabetes. We therefore provide a potential mechanism linking pollutant exposure and the increased incidence of metabolic diseases

L’apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l’homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl’apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d’identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l’exécution de l’apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L’ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d’inhiber la fonction transporteur et d’activer la fonction pore d’ANT pourinduire l’apoptose. Il existe quatre isoformes d’ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d’ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d’ANT4 dans des cellules cancéreuses et l’intérêt d’ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l’expression de protéines anti-apoptotiques, l’adaptation auxstress cellulaires et l’activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l’aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l’apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l’apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d’espèces activées del’oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l’augmentation des EAO suite au déclenchement d’un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d’induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d’une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d’induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance. / Apoptosis is a programmed cell death process necessary for tissue homeostasis duringdevelopment. Cancer cells acquire the capacity to evade apoptosis. Restoring tumor cellsability to die is a therapeutic strategy against cancer. It is therefore important to identify newtherapeutic targets within the apoptotic signaling and to test new molecules.Mitochondrion being a central integrator of cell death signals and a key player inapoptosis execution, it is a target of choice to develop new anticancer therapies. ANT(Adenine Nucleotide Translocase) is the main protein of the inner mitochondrial membrane. Itpresents a ADP/ATP transporter function in physiological conditions and acquire a lethal poreactivity upon apoptotic stimulus. It is thus interesting to inhibit the transporter function and- 6 -activate ANT pore function in order to induce apoptosis. There are four isoforms: ANT1, 2, 3and 4. We studied the role of the recently discovered ANT4 in apoptotic signaling. Our studyemphasize ANT4 anti-apoptotic role in cancer cells and ANT potential as an anticancertherapeutic target.Increase in anti-apoptotic proteins, adaptation to cellular stress and activation ofsurvival pathways are the main mechanisms responsible for chemoresistance. Using cellularmodels we studied the ability of two molecules: Withaferin A (WFA) and Plumbagin (PBG)to stimulate apoptosis and determined the molecular mechanisms involved. We showed WFAcapacity to specifically induce the mitochondrial pathway of apoptosis in melanoma cellsthrough reactive oxygen species (ROS) generation leading to mitochondrial pathwayactivation and the decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression level. However, PBG isresponsible for apoptosis and necrosis induction in melanoma cells. In both cases PBG actsthrough an increase in ROS following endoplasmic reticulum stress. WFA and PBG are thustwo pro-oxidant molecules able to induce the death of melanoma cells by taking advantage oftheir vulnerability to oxidative stress.Our work took part in the demonstration of a potential anticancer target and two agentsable to induce cell death in a context of chemoresistance.

P53 est un facteur de transcription qui se décline, chez l’homme, la souris ou la drosophile, en plusieurs isoformes. Chez la drosophile deux isoformes ont été caractérisées : la forme canonique Dp53 ; et une forme tronquée, D∆Np53, dont le domaine de transactivation est incomplet. Une des questions encore peu étudiée, concerne les mécanismes par lesquels p53 régule une grande variété de réponses cellulaires lors d’un stress. Pour répondre à cette question, nous avons étudié le rôle des isoformes de p53 dans la régulation de deux mécanismes antagoniste en lien avec la maladie de Parkinson (MP) : l’autophagie et l’apoptose en réponse à un stress délétère et un stress hormétique du système nerveux. Nous avons montré que les drosophiles portant une mutation nulle de p53 sont plus sensibles aux effets du paraquat (fort stress oxydant, modèle chimique de la maladie de Parkinson). En absence de p53, ce stress cause une forte inhibition de l’initiation et du flux de l’autophagie accompagné d’une augmentation des niveaux de caspases et de la mortalité. L’augmentation de la mortalité et des niveaux de caspases est similaire chez des mutants de l’autophagie pour lesquels le flux d’autophagie est constitutivement altéré. D’autre part, nous avons montré que les deux isoformes de p53 (Dp53 et D∆Np53) régulent différemment l’apoptose et l’autophagie dans les neurones photorécepteurs de drosophile : l’isoforme Dp53 présente un flux autophagique fonctionnel retardant la neurodégénérescence, tandis que, l’isoforme D∆Np53 inhibe le flux d’autophagie via l’activation des caspases Dcp1, Drice et Dronc. Enfin, nous avons établi un lien entre p53 et le stress du réticulum endoplasmique (RE). Dans un premier temps nous avons montré qu’un stress modéré du RE (pré-conditionnement) a un effet protecteur dépendant de l’activation de l’autophagie dans différents modèles de la MD. Ensuite, nous avons montré que les trois banches de la réponse au stress du RE (IRE1, Atf6 et PERK) sont impliquées dans cet effet protecteur. Enfin, nous avons montré que les drosophiles mutantes pour p53 perdent l’effet protecteur du pré-conditionnement. L’ensemble de nos résultats apporte de nouveaux éléments sur l’aspect multifonctionnel de p53 en réponse à un stress dans le système nerveux. Via ses multiples isoformes, p53 peut activer deux réponses antagonistes : l’autophagie et l’apoptose, permettant aux cellules une réponse flexible face à une situation de stress. La régulation de l’autophagie par p53 est protectrice et apparait comme étant une fonction ancestrale de p53. / P53 is a tumor suppressor gene, which has been showed to regulate several cellular pathways. Upon stress, p53 triggers multiple cellular pathways including DNA repair system, cell cycle arrest, apoptosis and autophagy. Thus, p53 is involved in both cellular protection and death pathways. One of the major questions is to understand how a single protein can promote so many different pathways. Here I address the putative role of p53 isoforms in the regulation of autophagy and apoptosis and their role in neuron survival in the context of Parkinson’s disease (PD). We show that p53 mutants are more susceptible to paraquat toxicity (chemical model of PD), indicating a protective role for p53. We also found that Atg8 mutant, which display an impaired autophagy, behave similarly to p53 upon paraquat treatment. In addition, we show that p53 is required for the activation of autophagy with a functional autophagy flux upon paraquat treatment and that lack of p53 or Atg8 results in an accumulation of activated caspases after paraquat treatment. Moreover, we found that autophagy and apoptosis were differentially regulated by different p53 isoforms. The Dp53 (p53B) isoform induced protective autophagy, whereas the D∆Np53 (p53A) isoform inhibited autophagy by activating the caspases Dronc, Drice and Dcp-1 in differentiated neurons. Our results demonstrate that a combination of the differential use of p53 isoforms and the antagonism between apoptosis and autophagy favors the generation of an appropriate p53 biological response to stress. In addition, we have defined in vitro and in vivo experimental conditions in which the activation of the Unfolded Protein Response (UPR) does not induce cell or organism lethality but rather promotes an adaptive response that protects from apoptotic stimuli. We show that this mild activation, known as ER-preconditioning is protective in several models of PD in an autophagy-dependent fashion. We showed that the three branches of the UPR are involved in the protective effect induced by ER-preconditioning. We then demonstrated that p53 is necessary to mediate the protection by ER-preconditioning suggesting that p53 may be a key factor in the integration of stress responses. Together our results reveal new aspects of the multi-functionality of p53. Activation of the antagonist pathways: autophagy and apoptosis by p53 isoforms, leads to flexible and adaptive response to stress. In addition, our results suggest that the regulation of autophagy by p53 is a ancestral protective function of p53.