O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

Tick proteins functioning in vital physiological processes such as blood meal uptake, digestion and reproduction are potential targets for anti-tick vaccines, since vaccination could disrupt these essential functions and ultimately affect tick survival. In this study we identified metzincin metalloproteases from R. microplus, the world’s most economically important external ectoparasite of cattle, as potential vaccine candidates since they are implicated to be essential to blood-cavity formation, bloodmeal digestion and reproduction in ixodid ticks. A vaccine derived from a single member of such a large family pose the obstacle of redundancy within the family, that may allow the function of the targeted family member to be taken up by other family members. Therefore the aim of this study was not only to focus on the physiological importance of each metzincin transcript, but also to investigate the differential gene expression network between the different metzincin family members. Eight transcripts encoding proteins containing the characteristic metzincin zinc-binding motif HEXXHXXG/NXXH/D and a unique methionine-turn were identified from native and in-house assembled R. microplus Expressed Sequence Tag databases. These were representative of five reprolysin-like and three astacin-like metzincin metalloproteases. Reverse transcription-PCR indicated that the reprolysins were most abundantly expressed in the salivary glands, whereas the astacins were most abundant in the midgut and ovaries. In vivo gene silencing utilizing RNA interference, was performed to assess a possible phenotype in silenced adult female R. microplus ticks during blood feeding and reproduction. RNAi against two reprolysins and one astacin significantly affected average egg weight as well as the oviposition rate. Moreover, integrated real time-PCR studies revealed an extensive cross organ network between the R. microplus metzincin transcripts, supporting the use of a combinatorial metzincinbased anti- R. microplus vaccine targeting multiple members of the large metzincin clan simultaneous. To conclusively evaluate the vaccination potential of the three identified metzincin candidates, the immunogenicity and protective properties of the recombinant proteins needs to be determined. Due to metalloproteases destructive activity and characteristics such as cysteine rich domains, only selected domains of the three candidates were expressed, using a cost effective Eshericia coli based expression system. Finally, the ability of each successfully expressed domain to elicit an immune response and serve as a protective antigen against R. microplus will be screened during vaccination trials in cattle. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2013. / gm2013 / Biochemistry / unrestricted

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.