A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 henrique_oliveira_ioc_mest_2014.pdf: 7127354 bytes, checksum: 38222c40296b518181621dea489e65c1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / T. gondii é parasito intracelular obrigatório, agente etiológico da toxoplasmose, doença com ampla distribuição mundial. Os transtornos mais severos (fase aguda) acometem pacientes imunocomprometidos. Hospedeiros imunologicamente sadios, uma vez infectados, apresentam cistos teciduais (fase crônica) de modo perene. Estudos sugerem que por possuírem um eficiente metabolismo energético, os principais tecidos eleitos para a cistogênese do T. gondii, são o nervoso e o muscular esquelético. O presente trabalho dedicou-se ao estudo das associações de mitocôndrias e do retículo endoplasmático (RE) à membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) e à parede cística. Para tanto, foram utilizados bradizoítos e taquizoítos da cepa ME49 (tipo II) e culturas primárias de célula muscular esquelética (CME) e da linhagem C2C12. Nossas estratégias metodológicas contemplaram microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, respirometria de alta resolução e ensaios de efeito de um inibidor da fosforilação oxidativa (ISA-34) sobre a cistogênese Os dados obtidos apontam a ocorrência de: (i) associações entre mitocôndrias com a parede cística; (ii) aspectos peculiares ultraestruturais decorrentes de associações entre mitocôndrias e RE (rugoso e liso) da CME com a MVP de vacúolos contendo bradizoítos; (iii) manutenção do metabolismo mitocondrial da CME pelo T. gondii, durante a fase crônica; (iv) efeito inibitório do composto ISA-34 sobre o desenvolvimento de cistos teciduais. Estes resultados, além de iniciarem uma linha de pesquisa inédita a respeito das respostas do metabolismo energético da CME frente à cistogênese de T. gondii, também abrem novas perspectivas para uma terapia alternativa voltada para a fase crônica da toxoplasmose / Toxoplasma gondii is an obligatory intracellular parasite, agent of toxoplasmosis, disease with a worldwide distribution. The most severe disorders (acute phase) affect immunocompromised patients. Immun ologically healthy individuals, once infected, develop tissue cysts (chronic phase) that can persist for the host life span. Studies suggest that an efficient energetic metabolism, as in nervous and skeletal muscle tissues, leads to the development of T. g ondii cystogenesis. The present work aims the study of the association of skeletal muscle cell (SkMC) mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) to the parasitophorous vacuole membrane (PVM) and to the cyst wall (CW). Bradyzoites and tachyzoites from ME49 strain (type II) of T. gondii and SkMC cultures and C2C12 cell line were used. The methodological strategies employed were fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, high - resolution respirometry and assay using ISA - 34, an inhibitor of oxid ative phosphorylation. Our data point out: (i) associations between mitochondria and CW; (ii) ultrastructural aspects of the association of SkMC mitochondria and ER (rough and smooth) with PVM of bradyzoite - containing vacuoles; (iii) m aintenance of SkMC mi tochondrial metabolism by T. gondii and, (iv) inhibitory effect of ISA - 34 on the tissue cysts development. These results stimulate further investigation concerning the response of SkMC energy metabolism during cystogenesis of T. gondii and also open novel perspectives for an alternative therapy against toxoplasmosis chronic phase

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

A fecundação resulta no aumento intracelular de cálcio que é necessário para a transição do oócito até o estádio de zigoto. Os eventos que ocorrem durante esta transição são caracterizados como ativação, sendo estes dependentes de cálcio. Entretanto, os eventos bioquímicos que ocorrem durante a ativação ainda não estão completamente elucidados. A proteína quinase C (PKC) e a proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII), por apresentarem atividade durante a fecundação e por serem ativadas por cálcio são implicadas na regulação dos eventos da ativação. Entretanto, existem muitas dúvidas sobre o real papel destas proteínas na ativação do oócito. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel da PKC e da CaMKII na ativação de oócitos bovinos. Para tal, oócitos bovinos maturados in vitro foram ativados partenogeneticamente (AP) com cálcio ionóforo A23187 (5μM) por 5 minutos, sendo a retomada da meiose, a organização do citoesqueleto e do retículo endoplasmático (RE) avaliada 1 hora após a ativação. No experimento 1 foi avaliado o papel da CaMKII nestes eventos. Os oócitos foram AP na presença ou ausência de 100M do inibidor de CaMKII (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). A inibição da CaMKII não afetou a retomada da meiose e nem a distribuição dos RE, após a AP. Entretanto, não ocorreu a rotação do fuso meiótico no estádio de telófase II quando a CaMKII foi inibidada. Estes resultados demonstram que embora a CaMKII não tenha efeito na retomada da meiose, esta proteína participa na progressão do ciclo celular de oócitos bovinos, após a AP. No experimento 2 foi avaliado o papel da PKC em oócitos bovinos AP. Os oócitos foram ativados partenogeneticamente na presença ou ausência de 10μM do inibidor de PKC (Bisindolymaleimide I). A inibição da PKC não afetou a retomada da meiose e nem a progressão pelo ciclo celular até o estádio de telófase II. Entretanto, a organização do RE foi afetada pela inibição da PKC. Resultado semelhante foi obtido quando os oócitos foram ativados na presença de citocalasina C, um despolimerizador de filamentos de actina. O presente experimento demonstra a participação da via PKC-actina na organização do RE na ativação de oócitos bovinos. / The intracellular calcium increase resulting from fertilization is necessary for oocyte transition to zygote. The events that occur during this transition are characterized as activation, which are dependent on calcium. However the biochemical events that occur during this activation are still not fully elucidated. The protein kinase C (PKC) and the calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), are involved in regulating the events of activation, since these proteins have activity during fertilization and are activated by calcium. However there are many doubts about the real role of these proteins in the oocyte activation. Thus, the objective of this study was to evaluate the role of PKC and CaMKII in bovine oocyte activation. For this purpose, in vitro matured bovines oocytes were parthenogenetically activated (PA) by using calcium ionophore A23187 (5μM) for five minutes, and the resumption of meiosis, the cytoskeleton organization and the endoplasmic reticulum (ER) organization were evaluated 1 hour post-activation. In experiment 1, were evaluated the role of CaMKII in these events. The oocytes were PA in the presence or absence of 100M of CaMKII inhibitor (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). The inhibition of CaMKII did not affect the meiosis resumption and the ER after the PA. However, there was no spindle rotation at telophase II stage when the CaMKII was inhibited. These results showed that although the CamKII has no effect on resumption of meiosis, it participates in the regulation of cell cycle progression after PA of bovine oocytes. In experiment 2, was evaluated the role of PKC on PA bovine oocytes. The oocytes were parthenogenetically activated in the presence or absence of 10μM of PKC inhibitor (Bisindolymaleimide I). The PKC inhibition did not affected the resumption of meiosis and the progression through the cell cycle until the stage of telophase II. However, the ER organization was affected by PKC inhibition. A similar result was obtained when the oocytes were activated in the presence of cytochalasin C, which promotes the depolymerization of the actin filaments. The current experiment showed the participation of the PKC-actin pathway at the ER organization in the bovine oocytes activation.

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) continua a ser um problema clínico e o estresse do retículo endoplasmático (ERS) parece ser um importante mediador desse processo. A presença da heme oxigenase-1 (HO-1) ou do monóxido de carbono (CO), parece proteger da IRI. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a papel da HO-1 e CO na IRI renal. A indução da HO-1 em camundongos promoveu uma proteção na IRI renal, com melhora da função renal, menos inflamação e atenuação do ERS. Ao avaliarmos o papel do CO, verificamos que há também uma proteção, mediada por p38, vias purinérgicas, estabilização de HIF-1a e eritropoietina. Há ainda uma melhora do metabolismo energético celular após o tratamento com CO. Enfim, podemos concluir que, na presença da HO-1 ou do CO, há uma melhora da lesão isquêmica, através de uma maior ativação de vias citoprotetoras, com atenuação do ERS, redução da inflamação e consequente melhora da função renal. / Ischemia-reperfusion injury (IRI) remains a clinical problem and endoplasmic reticulum stress (ERS) seems to be an important mediator of this process. The presence of heme oxygenase-1 (HO-1) or carbon monoxide (CO) appears to protect from IRI. The aim of our study was to evaluate the role of HO-1 and CO in renal IRI. The induction of HO-1 in mice promoted protection in renal IRI with improved renal function, less inflammation and attenuation of ERS. When evaluating the role of CO, we found that there is also a protection mediated by p38, purinergic signaling, HIF-1a stabilization and erythropoietin. There is still an improvement of cellular energy metabolism after treatment with CO. Finally, we conclude that, in the presence of HO-1 or CO, there is an improvement of the ischemic lesion, through greater activation of cytoprotective pathways, with reduced ERS, reducing inflammation and consequent improvement in renal function.

A neurodegeneração é o resultado da destruição progressiva e irreversível dos neurônios no sistema nervoso central, apresentando causas desconhecidas e mecanismos patológicos não totalmente elucidados. Fatores como a idade, o aumento da formação de radicais livres e/ou estresse oxidativo, defeito no metabolismo energético, a inflamação e acúmulo de elementos neurotóxicos e de proteínas malformadas no lúmen do retículo endoplasmático (RE) contribuem para o desenvolvimento dos processos neurodegenerativos. O sistema canabinoide tem sido proposto como neuroprotetor em diversos modelos de neurodegeneração como hipóxia aguda e epilepsia, isquemia cerebral, lesão cerebral e modelos de estresse oxidativo. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar o papel do sistema canabinoide em uma linhagem de neuroblastoma (Neuro 2a) submetida a condições de estresse oxidativo (H2O2), inflamação (LPS) e estresse do RE (tunicamicina), avaliando parâmetros de viabilidade celular e vias de sinalização envolvidas. Nossos resultados mostram que o agonista canabinoide ACEA foi capaz de proteger as células da morte celular causada pela inflamação e pelo estresse de retículo endoplasmático, mas não pelo estresse oxidativo. Esse efeito neuroprotetor exercido pelo ACEA parece pelo menos em parte ocorrer via receptor CB1 no modelo de inflamação e ser independente deste receptor no modelo de estresse de RE. Os efeitos neuroprotetores observados envolveram a modulação dos níveis de proteínas pré-apoptóticas, CHOP e Caspase 12, e da proteína relacionada à sobrevivência celular ERK 1/2. Nossos dados sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinoide em mecanismos relacionados aos processos neurodegenerativos e propõem a manipulação desse sistema como possível alvo terapêutico. / Neurodegeneration is the result of progressive and irreversible destruction of neurons in the central nervous system, with unknown causes and pathological mechanisms not fully elucidated. Factors such as age, increased formation of free radicals and/or oxidative stress, defects in energetic metabolism, inflammation and accumulation of neurotoxic factors and misfolded proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) contribute to the development of neurodegenerative processes. The cannabinoid system has been proposed as neuroprotector in several models of neurodegeneration such as acute hypoxia and epilepsy, cerebral ischaemia, brain injury and oxidative stress models. This work aimed to investigate the role of the cannabinoid system in a neuroblastoma line (Neuro 2a) submitted to oxidative stress (H2O2), inflammation (LPS) and ER stress (tunicamycin) conditions, assessing cell viability parameters and signaling pathways involved. Our results show that the ACEA cannabinoid agonist was able to protect cells from cell death caused by inflammation and ER stress, but not from oxidative stress. This neuroprotective effect exerted by ACEA appears to occur at least in part via the CB1 receptor in inflammation model and it seems to be independent of this receptor in the ER stress model. The neuroprotective effects observed involved the modulation of the levels of pre-apoptotic proteins CHOP and Caspase 12 and the cell survival related protein ERK 1/2. Our data suggest a neuroprotective role of the cannabinoid system in mechanisms related to neurodegenerative processes and propose it as possible therapeutic target.

A doença renal crônica (DRC) é um problema de saúde pública caracterizado por alta morbidade e mortalidade e com enorme impacto social e econômico no sistema de saúde. Uma das consequências mais graves da progressão da DRC é a albuminúria, que se deve principalmente a lesões no epitélio tubular proximal e na membrana basal glomerular. O aumento da permeabilidade da barreira de ultrafiltração glomerular à albumina está diretamente relacionado à lesão podocitária, principalmente devido à perda de processos podais, estresse oxidativo, estresse de reticulo endoplasmático e eventos apoptóticos. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos em tais processos ainda não foram elucidados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os mecanismos pelos quais a albumina participa na lesão de podócitos, considerando a contribuição da caveolina-1, IRE-1 fosforilado, PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada. Para isso, utilizamos podócitos de camundongos diferenciados, os quais foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle e tratados com albumina nas concentrações de 1, 5 e 10 mg/mL, em RPMI 1640 sem soro, durante 24 horas. Após o tratamento, a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Para os experimentos de imunofluorescência, as células foram tratadas com albumina fluorescente conjugada à isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1 mg/mL durante 30 min, 1h, 3h e 24h. As imagens foram obtidas por microscopia confocal, objetivo de 63x. A expressão de proteínas foi analisada por western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK e caspase-12 clivada foram avaliados 30 min, 1h, 3h e 24h após o tratamento das células com albumina 1 mg/mL. GAPDH foi usado como controle endógeno. A análise estatística foi avaliada pela ANOVA one-way seguida do pós teste de Bonferroni. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. Nossos resultados mostram que o tratamento das culturas celulares de podócitos com albumina, na concentração de 1 mg/mL, durante 24h resultou em um aumento significativo na taxa de apoptose total em comparação com o controle. Com relação à imunofluorescência, colocalizações entre albumina FITC e caveolina-1 foram observadas no período de 30 min, 1h, 3h e 24h. Em relação à expressão proteica, observou-se um aumento significativo na expressão da proteína GRP78 no período de 1 hora após o tratamento com albumina, o que indica um possível estresse de retículo endoplasmático. No caso da proteína IRE-1 fosforilada houve aumento da expressão em 30 min, 1h, 3h e 24h em relação ao grupo controle. Além disso, um aumento significativo na expressão das proteínas PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada foi observado nos períodos de 1h, 3h e 24h após o tratamento com albumina. Estes dois últimos parâmetros foram reduzidos pelo co-tratamento das células com SB203580 (10-6 M), um inibidor específico da p38 MAPK. Estes resultados sugerem que a proteína caveolina-1 tem um papel importante na internalização da albumina nos podócitos. Além disso, a albumina induz a apoptose por ativação do estresse de retículo nessas células, principalmente através da via PKC /p38MAPK/caspase-12 clivada. / Chronic kidney disease (CKD) is a public health problem characterized by high morbidity and mortality and with enormous social and economic impact on the health system. One of the most serious consequences of CKD progression is albuminuria, which is mainly due to lesions in the proximal tubular epithelium and the glomerular basement membrane. Increased permeability of the glomerular ultrafiltration barrier to albumin is directly related to podocyte lesion, mainly due to loss of foot processes, oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptotic events. However, the cellular mechanisms involved in such processes have not yet been elucidated. Thus, the objective of this study was to investigate the mechanisms by which albumin participates in podocyte injury, considering the contribution of caveolin-1, phosphorylated IRE-1, phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK, and cleaved caspase-12. For this, we used mice differentiated podocytes, which were distributed in four experimental groups: control and treated with serum concentrations of 1, 5 and 10 mg/mL in serum-free RPMI 1640 for 24 hours. After treatment, apoptosis was assessed by flow cytometry. For the immunofluorescence experiments, the cells were treated with 1 mg/mL fluorescein isothiocyanate-conjugated (FITC) albumin for 30 min, 1h, 3h, and 24h. The images were obtained by confocal microscopy, 63x objective. Protein expression was analyzed by western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK and cleaved caspase-12 were evaluated 30 min, 1h, 3h and 24h after treatment of the cells with 1 mg/mL albumin. GAPDH was used as an endogenous control. Statistical analysis was assessed by one-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. Values of p<0.05 were considered significant. Our results show that the treatment of cell cultures of podocytes with albumin at a concentration of 1 mg/mL for 24h resulted in a significant increase in the total apoptosis rate compared to the control. Regarding immunofluorescence, colocalizations between FITC albumin and caveolin-1 were observed in the period of 30 min, 1h, 3h and 24h. Regarding protein expression, a significant increase in GRP78 protein expression was observed within 1 hour of albumin treatment, indicating potential endoplasmic reticulum stress. In the case of the phosphorylated IRE-1 protein, expression increased in 30 min, 1h, 3h and 24h in relation to the control group. In addition, a significant increase in the expression of phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK and cleaved caspase-12 proteins was observed at 1h, 3h and 24h after albumin treatment. These latter two parameters were reduced by co-treatment of the cells with SB203580 (10-6 M), a specific inhibitor of p38 MAPK. These results suggest that caveolin-1 protein plays an important role in the internalization of albumin in podocytes. In addition, albumin induces apoptosis by activating the reticulum stress in these cells, mainly through the PKC / p38MAPK / caspase-12 pathway.