L’ARN polymérase (ARNP) est l'enzyme centrale d'expression des gènes. Toutes les formes de vie possèdent de l’ARNP. C’est un complexe protéique formé de plusieurs sous-unités responsables du processus de transcription qui aboutit à la synthèse de l’ARN à partir d’une matrice ADN. Les procaryotes possèdent un seul type d’ARNP responsable de la synthèse de tous les ARNs de la cellule, alors que les eucaryotes possèdent trois types d’ARNPs pour la synthèse des différents types d’ARNs.L’ARNP est la cible d’un grand nombre de protéines et de petites molécules de régulation dont certains antibiotiques utilisés en première ligne pour le traitement de diverses maladies infectieuses. La sous-unité sigma de l’ARN polymérase bactérienne est impliquée dans toutes les étapes de l'initiation de la transcription qui est le point crucial de l'expression des gènes. Les sous-unités sigma activent par exemple les gènes de virulence des bactéries pathogènes et sont impliquées dans la persistance qui est une forme de survie aux traitements antibiotiques.Ce projet a permis de déterminer le rôle de la sous-unité sigma de l'ARN polymérase bactérienne dans la résistance à la lipiarmycine (Fidaxomicin). Nous avons utilisé des approches biochimiques, biophysiques et génétiques pour l’étude de la dynamique des interactions ADN-protéine dans les complexes formés par l’ARN polymérase, l’antibiotique et de l’ADN des promoteurs.Les résultats de cette étude montrent que la sensibilité de l’ARNP dépend fortement de la structure de la région 3.2 de sigma et que les régions 1.2 et 3.2 de la sous-unité sigma sont impliquées dans la formation du complexe d’initiation de la transcription. Les mutations au niveau de ces régions affectent allostériquement l'action de la lipiarmycine en compromettant la formation du complexe ouvert. Ces résultats suggèrent que la conformation et la mobilité de la région 3.2 dépendent fortement de sa séquence. Ces travaux contribueront de manière significative à la compréhension des bases moléculaires de la résistance aux antibiotiques; Les approches méthodologiques développées pendant ce projet pourront être étendues à l'analyse d’autres antibiotiques ciblant l’ARNP bactérienne et à l’analyse des autres facteurs de transcription. / The RNA polymerase (RNAP) is the central enzyme for genes expression. All forms of life own RNAP. It is a multi-protein complex composed of several subunits responsible of the process of the transcription. The prokaryotes have only one type of RNAP responsible of synthesis of all RNAs in the cells, whereas eukaryotes have three types of RNAPs for the synthesis of the various types of RNAs.RNAP is the target of a large number of proteins and small regulatory molecules including antibiotics used the treatment of various infectious diseases. The sigma subunit of the bacterial RNAP is implicated in all steps of transcription initiation which is the crucial point of genes expression.For example some of the sigma subunits activate genes of virulence in pathogenic bacteria and are implied in the persistence which is a form of survival to the antibiotic treatments.This project aimed to explore the role of the sigma subunits of RNAP bacterial polymerase in resistance to the lipiarmycine (Fidaxomicin). We used biochemical approaches, biophysics and genetics for the study of the dynamic of the interactions DNA-protein in the complexes formed by RNA polymerase, the antibiotic and the promoter DNA. The results of our study show that sensitivity of RNAP to the drug strongly depends on the structure of the sigma region 3.2 and that the regions 1.2 and 3.2 of the sigma subunit are implied in the formation of the RNAP-promoter open complex. Mutations in these regions allosterically affected action of lipiarmycin by impairing the formation of the open complex.These results suggest that conformation and mobility of the region 3.2 depend on its sequence. The outcomes of our work could be used for development of new more effective drugs and could help to progress the studies of the fundamental mechanisms of the transcription.

Dans l'environnement, la levure doit faire face à des conditions variées qui nécessitent une adaptation rapide du métabolisme cellulaire. Une des premières réponses est l'inhibition de la transcription par l'ARN polymérase III (Pol III). La protéine Maf1, le seul régulateur de la machinerie de la Pol III chez Saccharomyces cerevisiae (Sc), est conservée au cours de l'évolution. Les protéines Maf1 des Eucaryotes contiennent deux domaines A et BC phylogénétiquement conservés. Ce travail de thèse a cherché à identifier le rôle de ces domaines dans la fonction de la protéine ScMaf1. J'ai construit une banque de mutants de Maf1, identifié les changements dans leurs séquences ainsi que leurs phénotypes. En utilisant la technique du double-hybride, j'ai montré que les domaines A et BC interagissent physiquement et que l'extrémité N-terminale de 34 acides aminés du domaine A est le fragment minimal nécessaire à cette interaction. Grâce à un crible génétique, j'ai mis en évidence que les mutations du domaine BC (D250E et V260D-N344I) permettent de restaurer l'activité de Maf1 mutée dans le domaine A (K35E). Cette restauration est observable pour le phénotype, la répression efficace de la transcription par la Pol III, le niveau de phosphorylation et la localisation cellulaire de Maf1. La technique du double-hybride m'a permis aussi de montrer que la mutation K35E inactive partiellement l'interaction entre les domaines de Maf1 qui est restaurée par les mutations suppresseurs D250E et V260D-N344I. Les résultats permettent de conclure que : « la répression de la transcription par la Pol III requiert l'interaction physique des domaines de Maf1 ».

Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome. Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée. Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines. Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.

Le complexe condensine est le moteur de la condensation mitotique des chromosomes, un processus essentiel à la stabilité du génome au cours de la division cellulaire. De nombreuses données publiées indiquent qu’il existe des liens fonctionnels étroits entre le processus de transcription des gènes et le processus d’organisation des chromosomes par condensine. Ces données sont toutefois souvent contradictoires et aucun modèle ne fait actuellement consensus pour expliquer les liens entre transcription et condensine. Au cours de cette thèse, nous avons montré chez la levure Schizosaccharomyces pombe qu’en l’absence de l’hélicase à ADN/ARN Sen1, condensine s’accumule spécifiquement à proximité des gènes transcrits par l’ARN Polymérase III. Nous avons utilisé ces observations pour mieux comprendre les liens entre transcription par l’ARN polymérase III et le positionnement de condensine. Nos données montrent que Sen1 est un cofacteur de l’ARN Polymérase III impliqué dans la terminaison de la transcription. Ce résultat est important car il démontre que les modèles existants qui affirment que l’ARN polymérase III termine de transcrire de façon autonome sont erronés. Nous avons ensuite démontré que les défauts de terminaison de l’ARN polymérase III observés en l’absence de Sen1 suffisent entièrement à expliquer l’accumulation de condensine en ces sites. Cette observation importante démontre que le contrôle de qualité de la transcription est directement impliqué dans le positionnement de condensine sur les chromosomes en mitose. Nos résultats nous permettent de proposer qu’au-delà d’un certain seuil, la densité en ARN polymérases est un obstacle à la translocation de condensine sur les chromosomes. / The condensin complex is a key driver of chromosome condensation in mitosis. The condensin-dependent assembly of highly compacted chromosomes is essential for the faithful transmission of the genome during cell division. Many independent studies have established that gene transcription impacts the association of condensin with chromosomes, but the molecular mechanisms involved are still unclear. This is especially true as a number of sometimes contradictory mechanisms have been proposed so far. Here, we show in Schizosaccharomyces pombe that condensin accumulates specifically in the vicinity of a subset of RNA polymerase III-transcribed genes in the absence of the conserved DNA/RNA helicase Sen1. We demonstrate that Sen1 is a cofactor of RNA polymerase III (RNAPIII) required for efficient transcription termination. These results are important because they fundamentally challenge the pre-existing view that RNAPIII terminates transcription autonomously. Strikingly, we show that the RNAPIII transcription termination defects are directly responsible for the accumulation of condensin in the absence of Sen1. This indicates that the quality control of transcription impacts the distribution of condensin on mitotic chromosomes. We propose that above a certain density threshold, the accumulation of RNAPIII constitutes a barrier for the translocation of condensin on chromosomes.

Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. <p>Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome.<p>Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée. <p>Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines. <p>Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire. / Chromatin is more than just the eucaryotic DNA packaging system; it is the substrate of all reactions involving DNA in eukaryotic cells and actively regulates RNA Polymerase II (RNAPolII) access to DNA. Responsible for all mRNA transcription in eucaryotes, the RNAPolII must, following its recruitment to the pre-initiation complex, overcome the chromatin barrier in order to transcribe genes. The RNAPolII CTD allows for the co-transcriptional coordination of mRNA maturation and chromatin modifications. The work covered in this thesis addresses two aspects of transcription: the chromatin substrate, with the localization of H2A variant, H2A.Z, and the transcription complex with the phosphorylation cycle of the RNAPolII CTD. Following the introduction, chapter 2 constitutes a detailed and annotated Saccharomyces cerevisiae ChIP-chip protocol, from the culture to the hybridization of the array, with an emphasis on the proper controls required for chromatin study. This technique, extremely powerful for the in vivo study of all DNA transactions, leads to a better understanding of chromatin function in nuclear phenomena, thanks to the localization of histone variants and modifications. The third chapter maps the H2A.Z variant across the yeast genome at ~300 base pairs resolution using ChIP-chip. Our data shows that H2A.Z is incorporated into one or two promoter-bound nucleosomes at the majority of genes. H2A.Z enrichment is anticorrelated with transcription, and the results suggest that it configures chromatin structure to poise genes for transcriptional activation. Furthermore, we have shown that H2A.Z can regulate nucleosome positioning. The next chapter focuses on the transcription machinery and, more precisely, on the phosphorylation cycle of RNAPolII. The CTD contains repetitions of a heptapeptide (YSPTSPS) on which all serines are differentially phosphorylated along genes in a prescribed pattern during the transcription cycle. Here, we systematically profiled the location of the RNAPII phospho-isoforms in wild-type cells and mutants for most CTD modifying enzymes. The results provide evidence for a uniform CTD cycle across genes. Together with results from in vitro assays, these data reveal a complex interplay between the modifying enzymes, identify Ssu72 as the Ser7 phosphatase and show that proline isomerization is a key regulator of CTD dephosphorylation at the end of genes. Moreover, it reinforces the notion of variants of the phosphorylation marks, even though the exact nature of the variant is still difficult to identify. The discussion introduces the studies that followed this work, including new projects conceived in our lab.

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire. / Chromatin is more than just the eucaryotic DNA packaging system; it is the substrate of all reactions involving DNA in eukaryotic cells and actively regulates RNA Polymerase II (RNAPolII) access to DNA. Responsible for all mRNA transcription in eucaryotes, the RNAPolII must, following its recruitment to the pre-initiation complex, overcome the chromatin barrier in order to transcribe genes. The RNAPolII CTD allows for the co-transcriptional coordination of mRNA maturation and chromatin modifications. The work covered in this thesis addresses two aspects of transcription: the chromatin substrate, with the localization of H2A variant, H2A.Z, and the transcription complex with the phosphorylation cycle of the RNAPolII CTD. Following the introduction, chapter 2 constitutes a detailed and annotated Saccharomyces cerevisiae ChIP-chip protocol, from the culture to the hybridization of the array, with an emphasis on the proper controls required for chromatin study. This technique, extremely powerful for the in vivo study of all DNA transactions, leads to a better understanding of chromatin function in nuclear phenomena, thanks to the localization of histone variants and modifications. The third chapter maps the H2A.Z variant across the yeast genome at ~300 base pairs resolution using ChIP-chip. Our data shows that H2A.Z is incorporated into one or two promoter-bound nucleosomes at the majority of genes. H2A.Z enrichment is anticorrelated with transcription, and the results suggest that it configures chromatin structure to poise genes for transcriptional activation. Furthermore, we have shown that H2A.Z can regulate nucleosome positioning. The next chapter focuses on the transcription machinery and, more precisely, on the phosphorylation cycle of RNAPolII. The CTD contains repetitions of a heptapeptide (YSPTSPS) on which all serines are differentially phosphorylated along genes in a prescribed pattern during the transcription cycle. Here, we systematically profiled the location of the RNAPII phospho-isoforms in wild-type cells and mutants for most CTD modifying enzymes. The results provide evidence for a uniform CTD cycle across genes. Together with results from in vitro assays, these data reveal a complex interplay between the modifying enzymes, identify Ssu72 as the Ser7 phosphatase and show that proline isomerization is a key regulator of CTD dephosphorylation at the end of genes. Moreover, it reinforces the notion of variants of the phosphorylation marks, even though the exact nature of the variant is still difficult to identify. The discussion introduces the studies that followed this work, including new projects conceived in our lab.