Le complexe de liaison de la coiffe des ARN (CBC) joue un rôle essentiel dans leur maturation et déclenche une variété de réactions biochimiques, via son interaction avec différents partenaires. Deux complexes, CBC-ARS2-PHAX (CBCAP), et CBC-ARS2-ZC3H18-NEXT (CBCN), ont récemment été montré comme important pour cibler les ARN vers l'export (CBCAP) ou la dégradation (CBCN). Cependant, les mécanismes par lesquels la sélection se fait pour l'une voie ou l'autre reste mystérieuse. Ainsi, une question majeure qui reste à résoudre est de savoir quand et comment ces complexes sont recrutés sur les ARN. Dans ce travail, j'ai utilisé la procédure du iCLIP (Cross-Linking and Immuno-Precipitation), afin d'identifier les cibles de ces complexes sur l'ensemble du transcriptome humain. J'ai réalisé un iCLIP sur cinq composants de CBCAP et CBCN, et j'ai comparé les résultats à ceux obtenus avec RBM7, un composant de NEXT précédemment étudié par iCLIP. Mes résultats indiquent que: (i) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 se lient près de la coiffe des ARN, tandis que RBM7 et MTR4 se lient partout; (ii) CBP20, ARS2, PHAX et ZC3H18 s'associent à un large ensemble d'ARN transcrits par l'ARN polymérase II et montrent une faible sélectivité; (iii) la liaison de ces protéines varie avec l'état de maturation des ARN, avec le CBC enrichi sur les ARN matures, tout comme ARS2/PHAX/ZC3H18 et MTR4 (bien que dans une moindre mesure), tandis que RBM7 est préférentiellement lié sur les pre-mRNAs non épissés; (iv) une liaison différentielle de RBM7 et MTR4 sur les ARN, avec RBM7 enrichi sur les introns et les PROMPTs, et MTR4 plus présent sur les ARN mature. Bien que des expériences additionnelles soient requises, nous proposons que le CBCAP et le CBCN se lient à un même ensemble d'ARN, ce qui indique à la fois une compétition entre ZC3H18 et PHAX pour la liaison à ces ARN, et l'absence de voies de routage bien déterminées qui ciblerait les ARN vers l'une ou l'autre de ces protéines. Le devenir des ARN pourrait ainsi être déterminé par d'autres caractéristiques des ARN, ou encore par des protéines additionnelles. Ces facteurs pourraient s'allier aux protéines liées à la coiffe afin de favoriser la formation du CBCAP ou du CBCN. Dans le but d’identifier des facteurs additionnels, j'ai réalisé un screen d'interaction par spectrométrie de masse après purification de ARS2 ou CBP80. Ceci a été fait dans des conditions natives ou après un cross-link des complexes à la formaldéhyde, afin de stabiliser les interactions transitoires. Ceci a permis d'identifier de nouveaux partenaires de ARS2 et de CBP80, dont la majorité sont impliqués dans l'épissage des ARN. Des expériences additionnelles seront nécessaires pour valider ces interactions. / The cap-binding complex (CBC) plays a pivotal role in post-transcriptional processing events and orchestrates a variety of metabolic pathways, through association with different interaction partners. Two CBC sub-complexes, the CBC-ARS2-PHAX (CBCAP) and the CBC-nuclear exosome targeting (NEXT) complex (CBCN), were recently shown to target capped RNA either toward export or degradation, but the mechanisms by which they can discriminate between different RNA families and route them toward different metabolic pathways still remain unclear. A major question to be answered is how and when the different CBC subcomplexes are recruited to the RNP. Here, we used an individual nucleotide-resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) approach to identify the transcriptome-wide targets for 5 different components of the CBCAP and CBCN complexes, and compared results to the previously analysed NEXT-component RBM7. We report that: (i) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 bind close to the cap, while RBM7 and MTR4 bind throughout the mRNA body; (ii) CBP20, ARS2, PHAX and ZC3H18 associate with a broad set of RNA polymerase II (PolII)-derived RNAs and have only mild species preferences; (iii) binding varies with the RNA maturation stage, with the CBC being highly enriched on mature mRNA, ARS2/PHAX/ZC3H18/MTR4 less so, and RMB7 preferentially bound to pre-mRNAs; (iv) MTR4 and RBM7 show different specificities, with RBM7 being highly enriched on introns and promoter upstream transcripts (PROMPTs), while MTR4 is additionally present on mature RNAs. Although more experimental work is needed to fully support our model, we propose that CBCAP and CBCN bind overlapping sets of RNAs, indicating a competition between the proteins ZC3H18 and PHAX, and the lack of a strict RNA sorting mechanism. RNA fate may therefore be determined by additional RNA features and/or by other RNA-binding proteins, which may synergize with the cap and drive the formation of one specific CBC subcomplex instead of another. In an attempt to identify yet unknown factors that may interact with cap-bound CBCAP and CBCN, we performed a protein interaction screen leveraging affinity capture-mass spectrometry (ACMS), using ARS2 and CBP80 as bait proteins. As a complementary approach, we also employed a formaldehyde-based chemical cross-linking strategy, aimed at stabilizing weak/transient interactions. Although we failed to detect any transient interactions involving the CBC, we identified several potential CBC80 and ARS2 interactors, the majority of which are involved in pre-mRNA splicing. Additional quantitative experiments are required to validate our ACMS results and confirm the existence of such protein interactions in vivo.

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La biogenèse des ribosomes est un processus hautement complexe impliquant plusieurs centaines de facteurs de synthèse dont la finalité est la production de toutes les protéines de la cellule. Chaque étapes de la ribogenèse est une source potentielle d’erreur et est vérifiée par des mécanismes de contrôle de qualité redondants et rigoureux. <p><p>Dans la première partie de ma thèse, j’ai collaboré à une meilleure compréhension d’une des voies de la surveillance nucléolaire, celle qui dégrade les pré-ribosomes défectueux recrutée à partir de l’extrémité 3’ des ARN ribosomiques (ARNr). Suite à une erreur d’assemblage, les pré-ARNr sont polyadénylés par le complexe nucléaire TRAMP, ce dernier est recruté cotranscriptionnellement. Les ARNr polyadénylés deviennent alors des substrats pour l’exosome et sont dégradés. <p><p>On ignore comment la synthèse des ARNr, leur maturation et la surveillance nucléolaire sont intégrées mais on suspecte l’existence d’une interface physico-fonctionnelle à l’ADNr. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons testé si des cofacteurs de l’exosome, les protéines Nrd1/Nab3 étaient impliquées dans la surveillance des pré-ARNr. Nous rapportons que, chez la levure S. cerevisiae, le facteur d’élongation Spt5 interagit avec l’ARN polymérase (Pol) I et avec Nrd1. L’interaction entre Spt5 et ces deux protéines requiert la présence d’un domaine particulier situé à l’extrémité C-terminal ressemblant au « Carboxy-terminal domain » (CTD) de la Pol II appelé « Carboxy terminal repeat » (CTR). Spt4/Spt5 et Nrd1/Nab3 interagissent fonctionnellement avec Rrp6, sous-unité catalytique de l’exosome. Ces complexes colocalisent à l’ADNr, comme déterminé par ChIP. Des mutations dans le domaine de liaison à l’ARN (RRM – « RNA recognition motif ») de Nrd1 mais pas dans son domaine de liaison au CTD (CID – « carboxy-terminal interacting domain ») de la Pol II et dans le RRM de Nab3 mènent à l’accumulation de transcrits ribosomiques aberrants polyadénylés. Ceci indique que Nrd1/Nab3 contribue au recrutement de la surveillance nucléolaire à la Pol en cours d’élongation pour « scruter » les transcrits ribosomiques naissants. <p><p>Nous proposons un modèle dans lequel Nrd1/Nab3 sont recrutées à la machinerie d’élongation de la transcription via leur interaction avec Spt5 afin de surveiller la synthèse des transcrits ribosomiques. Si un problème dans la fabrication des transcrits naissants a lieu, des sites de liaison pour Nrd1/Nab3 sur les pré-ARNr normalement recouverts de facteurs de synthèse seraient dénudés. Ceci marquerait les transcrits ribosomiques aberrants et entrainerait leur dégradation par les machineries de dégradation TRAMP et exosome. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ces dernières décennies ont été marquées par la découverte de la transcription dite « cachée » ou « pervasive ». Il a été en effet montré que la majeure partie du génome des eucaryotes est transcrite, donnant naissance à la formation de nombreux ARNs non-codants. La délimitation des unités de transcription apparait essentielle dans le contrôle de l’expression des gènes mais également dans le maintien de l’intégrité des processus associés à l’ADN en limitant notamment l’apparition de conflits avec la transcription. Dans ce contexte, l’initiation et la terminaison de la transcription représentent des étapes clés dans le partitionnement du génome et le métabolisme des ARNs. Nous avons montré que certains facteurs de transcription, appelés GRFs (General Regulatory Factors) chez la levure S. cerevisiae, jouent un rôle important dans le contrôle de la transcription pervasive à la fois au niveau de l’initiation mais également de la terminaison de la transcription et sont également requis pour assurer la fidélité de la transcription des gènes codant les ARN messagers. Nous avons prouvé que les GRFs liés au niveau des régions promotrices sont capables d’induire la terminaison de la transcription en bloquant physiquement la progression d’ARN polymérases issues de la translecture des terminateurs situés en amont. D’après nos études, cette voie de terminaison appelée « roadblock » est très répandue à l’échelle du génome et joue un rôle important dans la protection des promoteurs contre l’interférence transcriptionnelle. Nous avons également découvert que les GRFs limitent la transcription pervasive en obstruant les sites d’initiations ectopiques situés à proximité de leur site de fixation sur l’ADN. Ces facteurs sont aussi impliqués dans le contrôle de l’expression des gènes codants en favorisant l’utilisation de sites d’initiations les plus appropriés, c’est-à-dire, permettant la synthèse d’ARNs ayant un fort potentiel codant. Le rôle des GRFs dans le contrôle de l’initiation apparait intimement lié à leur capacité à correctement positionner les nucléosomes au niveau des promoteurs en collaboration avec les facteurs de remodelage de la chromatine. / The last decades have been marked by the discovery of pervasive transcription. Indeed, many studies have shown that transcription by RNA polymerase II is not restricted to annotated regions but is widespread in eukaryotic genomes, leading to the production of a plethora of non-coding RNAs. Precise delimitation of transcriptional units appears to be essential to ensure robust fidelity of gene expression and to maintain the integrity of DNA-associated events by preventing the occurrence of conflicts with transcription. In this respect, accurate transcription initiation and termination represent crucial mechanisms to partition the genome and define the correct processing of RNA molecules. Here, we show that yeast general regulatory factors (GRFs), a class of highly expressed transcription regulators, control pervasive transcription at the level of initiation and termination and are also involved in the fidelity of initiation of mRNA-coding genes. We demonstrate that GRFs bound at promoter regions can elicit transcription termination by physically impeding the progression of polymerases mainly deriving from readthrough transcription at upstream canonical termination sites. We provide evidence that this termination pathway named roadblock is widespread throughout the yeast genome and protects promoter regions from transcriptional interference. Furthermore, we establish that the presence of general regulatory factors also limits pervasive transcription at the level of initiation, notably by occluding spurious transcription start sites present in the vicinity of their binding sites. We also unveil the importance of these factors in promoting correct transcription start site selection at mRNA-coding genes thus favouring the synthesis of transcripts with an appropriate coding potential. Finally, we determine that the role of GRFs in controlling proper initiation is intimately linked to their ability to correctly position nucleosomes in promoters, a role that occurs independently from but in cooperation with chromatin remodelers.

The life-cycle of RNA is determined by several processing steps, which allow the cell to export and translate a coding transcript. The cell has developed an astonishingly complex mechanism to ensure the integrity of RNA processing steps. The quality control mechanism of RNA balances the biosynthesis and degradation of various transcripts, adding another layer of gene regulation to the complex system of gene expression. The exosome is a central piece of the RNA quality control mechanism as it degrades many of the aberrant or non-functional RNAs in the nucleus and the cytoplasm. This project characterizes and highlight a response to mutation of components from the RNA quality control mechanism in Saccharomyces cerevisiae. These perturbations include functional components of the exosome (Csl4 and Dis3), a cofactor of the nuclear exosome (Rrp6), an essential protein for pre-rRNA processing (Enp1) and a component of RNA export machinery (Srm1). Here, I present bioinformatics approaches to characterize the cellular response at a level of transcript expression and polyadenylation size. The stress response embedded in the gene expression profile is highly similar between the mutants. This work suggests a generic response to a failure in different components of the RNA quality control machinery. / Le cycle de vie des ARN est déterminé par différentes étapes permettant à la cellule d’exporter et de traduire un transcrit codant. La cellule a développé un mécanisme incroyablement complexe pour s’assurer de l’intégrité des étapes de maturation de l’ARN. Le mécanisme de contrôle de qualité balance la biosynthèse et la dégradation de différents transcrits, ce qui ajout un niveau de régulation au système de l’expression génique. L’exosome est une pièce centrale du mécanisme de contrôle de qualité de l’ARN alors qu’elle dégrade une grande partie des transcrits aberrants ou non-fonctionnels dans le noyau et le cytoplasme. Ce projet caractérise et souligne la réponse cellulaire à la suite de la mutation de composantes du mécanisme de contrôle de qualité de l’ARN chez Saccharomyces cerevisiae. Ces perturbations comportent des composantes fonctionnelles du complexe de l’exosome (Csl4 et Dis3), un cofacteur de l’exosome nucléaire (Rrp6), une protéine essentielle pour la maturation des pré-ARNr (Enp1) et une composante de la machinerie d’export de l’ARN (Srm1). Ici, je présente des approches bio-informatiques pour caractériser la réponse cellulaire au niveau de l’expression des transcrits et de la taille des segments polyadénylés. La réponse au stress cellulaire intégré dans le profil d’expression du génome est très similaire entre les mutants. Ce travail suggère une réponse générique à la suite de la perturbation de différentes composantes du mécanisme de contrôle de qualité de l’ARN.

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Après un cycle de la production des protéines, les sous-unités des ribosomes terminés sont dissociés, afin de les rendre disponibles pour de nouveaux cycles de traduction. Si lors de la traduction le ribosome pause, il ne pourra pas terminer la traduction et être recyclé par la voie classique. Un mécanisme de recyclage alternatif a évolué pour dissocier de tels ribosomes arrêtés. Un complexe composé des facteurs Dom34 et Hbs1 induit leur dissociation. Ce complexe est aussi impliqué dans des voies de contrôle qualité qui ciblent des ARN qui causent des arrêts ribosomiques. Dans cette thèse, l'importance de plusieurs sites fonctionnels du complexe Dom34-Hbs1 pour ces voies contrôle qualité des ARNs est étudiée. De plus, la relation entre ces voies et leurs détails sont examiné. Finalement, un nouveau rôle de Dom34-Hbs1, en dissociant des ribosomes inactifs ce qui rend leurs sous-unités disponibles pour de nouveaux cycles de la traduction, est décrit. / Protein production is a cyclic process that consists of four stages: initiation, elongation, termination and recycling. During recycling the subunits of terminated ribosomes are dissociated, to make them available for new rounds of translation. If ribosomes stall during translation, ribosomes cannot terminate properly and canonical recycling cannot occur. Cells have mechanisms to rescue these stalled ribosomes. A complex formed by the factors Dom34 and Hbs1 induces their dissociation. This compex in RNA quality control, targeting RNAs that cause ribosomal stalling. In this thesis the importance of several functional sites of the Dom34-Hbs1 complex for the degradation of these RNA sis investigated. Details of and therelationship between RNA quality control pathways in which the complex functions are further investigated. Finally, a new role of this complex, dissociating inactive ribosomes and there by making their subunits available to re-enter the translation cycle is described.