<p>RNase P is an essential ribonuclease responsible for removal of the 5’ leader of tRNA precursors. Bacterial RNase P consists of an RNA subunit and a small basic protein. The catalytic activity is associated with the RNA subunit, i.e. bacterial RNase P RNA is a ribozyme. The protein subunit is, however, essential for activity in vivo. RNase P RNA, as well as the holoenzyme, requires the presence of divalent metal ions for activity. The aim of this thesis was to increase our understanding of the catalytic mechanism of RNase P RNA mediated cleavage. The importance of the nucleotides close to the cleavage site and the roles of divalent metal ions in RNase P RNA-catalyzed reaction were investigated. Escherichia coli RNase P RNA (M1 RNA) was used as a model system.</p><p>It was shown that different metal ions have differential effects on cleavage site recognition. Cleavage activity was rescued by mixing metal ions that do not promote cleavage activity by themselves. This suggests that efficient and correct cleavage is the result of metal ion cooperativity in the RNase P RNA-mediated cleavage reaction. The results suggested that one of the metal ions involved in this cooperativity is positioned in the vicinity of a well-known interaction between RNase P RNA and its substrate. Based on my studies on how different metal ions bind to RNA and influence its activity we raise the interesting possibility that the activity of biocatalysts that depend on RNA for activity are up- or downregulated depending on the intracellular concentrations of the bulk biological metal ions Mg²⁺ and Ca²⁺.</p><p>The nucleotides upstream of the cleavage site in the substrate were found to influence the cleavage efficiency. This was not exclusively due to intermolecular base pairing within the substrate but also dependent on the identities of the nucleotides at position –2 and –1. The strength of the base pair at position –1/+73 was demonstrated to affect cleavage efficiency. These observations are in keeping with previous suggestion that the nucleotides close to the cleavage site are important for RNase P cleavage. We conclude that the residue at -1 is a positive determinant for cleavage by RNase P. Hence, my studies extend our understanding of the RNase P cleavage site recognition process.</p>

RNase P is an essential ribonuclease responsible for removal of the 5’ leader of tRNA precursors. Bacterial RNase P consists of an RNA subunit and a small basic protein. The catalytic activity is associated with the RNA subunit, i.e. bacterial RNase P RNA is a ribozyme. The protein subunit is, however, essential for activity in vivo. RNase P RNA, as well as the holoenzyme, requires the presence of divalent metal ions for activity. The aim of this thesis was to increase our understanding of the catalytic mechanism of RNase P RNA mediated cleavage. The importance of the nucleotides close to the cleavage site and the roles of divalent metal ions in RNase P RNA-catalyzed reaction were investigated. Escherichia coli RNase P RNA (M1 RNA) was used as a model system. It was shown that different metal ions have differential effects on cleavage site recognition. Cleavage activity was rescued by mixing metal ions that do not promote cleavage activity by themselves. This suggests that efficient and correct cleavage is the result of metal ion cooperativity in the RNase P RNA-mediated cleavage reaction. The results suggested that one of the metal ions involved in this cooperativity is positioned in the vicinity of a well-known interaction between RNase P RNA and its substrate. Based on my studies on how different metal ions bind to RNA and influence its activity we raise the interesting possibility that the activity of biocatalysts that depend on RNA for activity are up- or downregulated depending on the intracellular concentrations of the bulk biological metal ions Mg2+ and Ca2+. The nucleotides upstream of the cleavage site in the substrate were found to influence the cleavage efficiency. This was not exclusively due to intermolecular base pairing within the substrate but also dependent on the identities of the nucleotides at position –2 and –1. The strength of the base pair at position –1/+73 was demonstrated to affect cleavage efficiency. These observations are in keeping with previous suggestion that the nucleotides close to the cleavage site are important for RNase P cleavage. We conclude that the residue at -1 is a positive determinant for cleavage by RNase P. Hence, my studies extend our understanding of the RNase P cleavage site recognition process.

La RNase P est une endoribonucléase responsable de la maturation de l'extrémité 5' des ARNt prématures. Holoenzyme très conservée, elle est constituée d'une composante ARN formant le noyau catalytique et d'une composante protéique dont le nombre de sous-unités est variable : une protéine chez les bactéries, 5 chez les archées et d'au moins 9 chez les eucaryotes. Les eucaryotes possèdent également une autre endoribonucléase, la RNase MRP dont la composition est proche de la RNase P tant au niveau ribonucléique que protéique mais avec une spécificité de substrat propre. Dans cette étude, nous proposons une méthode originale et spécifique pour purifier la RNase P et la RNase MRP de S. cerevisiae. Grâce à la microscopie électronique et au traitement d'images, nous avons déterminé la première structure de ces deux holoenzymes à une résolution d'environ 1.5 nm. Ces structures révèlent une architecture modulaire commune où les protéines stabilisent la composante ARN et contribuent à l'édification de cavités et de conduits. Les spécificités structurales sont localisées en des positions stratégiques pour l'identification et la coordination du substrat.

CsrA is a global post-transcriptional regulatory protein that has a great impact on many physiological pathways in a cell. It regulates central carbon metabolism, motility and biofilm formation as well as virulence, pathogenesis, quorum sensing and the oxidative stress response. However, CsrA is in turn also regulated by CsrB and CsrC sRNAs, among other factors. In this study, we explore its regulatory effect on three different genes/operons, cstA, glgCAP and flhDC. We performed beta-galactosidase assays on wild type (wt) and RNase P temperature sensitive (ts) cells to determine the dependence on RNaseP for the CsrA, CsrB and CsrC regulatory cascade on these three genes. Our results showed a clear decrease in cstA and glgCAP activity during CsrA activation, suggesting a regulatory cascade in which inhibition of RNase P leads to an inactivation of CsrB and CsrC. This in turn leads to an activation of CsrA and an inhibition of cstA and glgCAP. The effect on flhDC, however, was not as clear and needs further investigation.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

Η ριβονουκλεάση P είναι το ένζυμο το οποίο αναλαμβάνει την δημιουργία του 5´ ώριμου άκρου όλων των πρόδρομων μορίων tRNA. Πρόκειται για ένα ριβονουκλεο-πρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο εντοπίζεται στα κύτταρα των οργανισμών και από τις τρεις κύριες φυλογενετικές περιοχές, τα Βακτήρια, τα Αρχαία και τους Ευκαρυώτες. Αποτελείται από μια υπομονάδα RNA απαραίτητη για την κατάλυση, ενώ το μέγεθος και ο αριθμός των πρωτεϊνικών υπομονάδων ποικίλλει από μια μικρή στα βακτήρια έως δέκα πρωτεΐνες στο ολοένζυμο που απομονώνεται από τα ανθρώπινα κύτταρα. Η υπομονάδες RNA των βακτηρίων καθώς επίσης και μερικών αρχαίων μπορούν να καταλύσουν την αντίδραση ωρίμανσης του tRNA απουσία της πρωτεΐνης in vitro, είναι δηλαδή ριβοένζυμα. Η ανακάλυψη αυτή διεύρυνε τις αντιλήψεις μας για τις ιδιότητες των βιομορίων και επανέφερε στο προσκήνιο την θεωρία του κόσμου του RNA. Στο ευκαρυωτικό ριβοένζυμο, ο ρόλος των πρωτεϊνών είναι πιο ουσιαστικός, καθώς η υπομονάδα RNA φαίνεται ότι χάνει μεγάλο μέρος της λειτουργικής της ανεξαρτησίας. Η διαλεύκανση των λειτουργών της κάθε υπομονάδας θα δώσει σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη της RNase P από ένα αρχέγονο ένζυμο σε ένα πολύπλοκο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum διαθέτει μια απαραίτητη για την δραστικότητα υπομονάδα RNA όπως και όλα τα ένζυμα αυτού του είδους. Παράλληλα διαθέτει έντονο πρωτεϊνικό χαρακτήρα καθώς διαθέτει την χαμηλότερη πυκνότητα επιπολής σε σχέση με ένζυμα RNase P από άλλους οργανισμούς. Οι πληροφορίες αυτές προέρχονται από τον αρχικό χαρακτηρισμό του ενζυμικού συμπλόκου, και δεν παρέχουν στοιχεία για την ακριβή σύστασή του. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός ενός από τα γονίδια που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του Dictyostelium, ομόλογα προς χαρακτηρισμένα γονίδια από τον άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες. Το γονίδιο drpp30 κωδικεύει μια πρωτεΐνη 40.7 kDa, σημαντικά μεγαλύτερη από τις ομόλογες της. Η πρωτεΐνη DRpp30 υπερεκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα, και μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό της χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Η συμμετοχή της DRpp30 στο μακρομοριακό σύμπλοκο της RNase P πιστοποιήθηκε με ανοσοβιοχημική προσέγγιση, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη προσδένει τo pre-tRNA υπόστρωμα του ενζύμου, καθώς και την υπομονάδα RNA in vitrο. Το μοντέλο ομολογίας της DRpp30 βάσει της κρυσταλλικής δομής της ορθόλογης Ph1877 από τα αρχαία, φανερώνει ότι η πρωτεΐνη αποκτά τη δομή αβ βαρελιού (ΤΙΜ barrel fold). Κατά τη διάρκεια της διατριβής, οι προσπάθειες για τον εντοπισμό του γονιδίου της RNA υπομονάδας ήταν σε εξέλιξη, όταν το εν λόγω γονίδιο αναγνωρίστηκε μέσω φυλογενετικών συγκρίσεων από την ομάδα του Norman Pace. Το μετάγραφο του γονιδίου εντοπίστηκε σε ενεργά κλάσματα RNase P, και παράλληλα εντοπίστηκε και ένα μικρότερο μετάγραφο του ίδιου γονιδίου. Προσδιορίστηκαν τα ακριβή 5´και 3´ άκρα των δύο αυτών μορίων και ακολούθησε κλωνοποίηση τους. Τα in vitro μετάγραφα των δύο κλωνοποιημένων αλληλουχιών μπορούν να υποκαθιστούν την ενδογενή RNA υπομονάδα του ολοενζύμου in vitro, ενώ δεν εντοπίστηκε έως τώρα ενζυμική δραστικότητα που να σχετίζεται με τα δύο αυτά μόρια. / Ribonuclease P is a ubiquitus ribonucleoprotein enzyme, responsible for the production of the 5´ mature ends of all precursor tRNA molecules. RNase P endonucleolytic activity has been isolated from organisms representing the three domains of life, namely Bacteria, Archaea and Eukarya. It has been shown to contain an essential RNA subunit and one (Bacteria) or more (Archaea, Eukaryotes) proteins. The RNase P RNA subunits from bacteria and some archaea are catalytically active in vitro, whereas those from eukaryotes and most archaea have lost most of their functionality and require protein subunits for activity. RNase P has been characterized biochemically and genetically in several systems, and structures for both RNA and protein subunits have emerged. The integration of structural and functional data is slowly forming a scenario for the evolution of RNase P from an ancient enzyme to a highly organized ribonucleoprotein complex. Dictyostelium discoideum RNase P harbors an essential RNA subunit, and has high protein content, as judged by its low boyant density. Nevertheless, our knowledge on the exact composition was limited. In the current study, a gene showing significant similarity to human Rpp30 RNase P protein subunit was identified in Dictyostelium genome. The gene encodes a protein (DRpp30) which is significantly larger than its homologues, due to an unusual C-terminus. The gene was cloned, overexpressed, and was used for the production of polyclonal antibodies. The participation of DRpp30 in the macromolecular complex of RNase P was verified by an immunobiochemical approach. The recombinant protein was shown to bind specifically both the RNase P RNA subunit and the pre-tRNA substrate in vitro, thus giving a first insight of its role in the holoenzyme complex. Homology modeling using as a template the archaeal Ph1887p, and molecular dynamics simulations of the modeled structure suggest that DRpp30 adopts a TIM-barrel fold. While our efforts to isolate the gene encoding the RNA subunit of D. discoideum RNase P were in progress, Norman Pace and his group identified it through phylogenetic comparison. The full transcript of the gene was detected in active RNase P samples along with a smaller transcript of the same gene. The exact 5´and 3´ ends of both transcripts were identified and were cloned. Both these transcripts can substitute the endogenous RNA subunit in vitro, but no enzymatic activity associated with these RNA molecules could be detected so far.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

No description available.

No description available.