Neste trabalho desenvolvemos métodos analíticos e moleculares para a detecção, isolamento e classificação filogenética de Alicyclobacillus spp. a partir de sucos de laranja e frutos ácidos, pelas técnicas: RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD, seqüenciamento do 16S rRNA e análise por métodos eletroforéticos. A sensibilidade na detecção dos A. acidoterrestris foi melhorada por meio de reações de nested RT-PCR, utilizando primers internos (amplicon de 191 bp) que foram desenhados a partir do primeiro amplicom de 294 bp. O limite de detecção foi estudado com as reações RT-PCR e nested RT-PCR, sendo capazes de detectar concentrações de 0,1 UFC mL-1 para culturas puras e 2 UFC mL-1 em sucos de laranja artificialmente inoculados. A inibição de esporos de A. acidoterrestris também foi estudada para monitorar a diminuição da viabilidade com tratamento térmico e Sapindus saponaria (200 mg L-1), utilizando RT-PCR e nested RT-PCR. Com o tratamento térmico de 99 oC por 1 h o grau de inibição dos esporos foi de 96,3%. Enquanto que, com a fração purificada de S. saponaria (200 mg L-1) incubada à 45 oC por 2 dias foi de 93,6%, mas com incubação de 99 oC por 1 h foi de 98,7%, na mesma concentração de saponina. Todas as análises de quantificação de produtos de RT-PCR e nested RT-PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em microchip no Bioanalyzer 2100 (Agilent), com os kits DNA 500 e DNA 1000 LabChip®, obtendo-se maior sensibilidade nos microchips. A classificação molecular de dezenove cepas, isoladas a partir de diferentes sucos e frutos ácidos, foram estudadas utilizando RAPD-PCR e eletroforese capilar em microchips. Utilizando cinco primers aleatórios nas reações de RAPD, foi possível estudar os polimorfismos analisados nos microchips. Segundo as análises eletroforéticas, as cepas de suco concentrado e diluído de laranja (1, 2, 6) suco concentrado de limão (lim) e suco de laranja in natura (T2, T3), apresentaram similaridades genéticas com a A. acidoterrestris. O estudo de análise filogenética baseada na comparação de seqüências de DNA da região variável do gene 16S rRNA de Alicyclobacillus acidoterrestris, foi utilizado para identificar e agrupar onze cepas isoladas de superfícies e sucos de frutos ácidos. Na árvore filogenética gerada pelo método neighbor joining e bootstrap 1000x, as cepas analisadas mostraram similaridades de 99% entre todas elas, observando-se uma maior similaridade do controle A. acidoterretris (C2) com a cepa isolada de suco concentrado de limão (lim), e uma boa discriminação entre controles das espécies A. acidocaldarius, A. cicloheptanicus, A. sendaiensis e Sulfobacillus acidophilus. / In this work, we developed analytical and molecular methods for detection, isolation and phylogenetic classification of Alicyclobacillus spp. from orange juice and acid fruits using RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD and sequencing of 16S rRNA techniques and electrophoretic methods of analysis. The sensitivity on the detection of A. acidoterrestris in orange juice was improved by nested RT-PCR, using internal primers (amplicon of 191 bp) that were designed after sequencing the first amplicon (294 bp). The detection limit was studied with RT-PCR and nested RT-PCR assay, it was able to detect concentrations of 0.1 UFC mL-1 for media culture and 2 UFC mL-1 in inoculated orange juice. The inhibition in spores from A. acidoterrestris was also studied to monitoring the diminution of viability with heat treatment and Sapindus saponaria (200 mg mL-1), using RT-PCR and nested RT-PCR assays. The inhibition by heat treatment at 99 oC for 1 h was 96.3%. However, incubation with S. saponaria at 45 oC for 2 days inhibited 93,6%, however, with incubation of 99 oC for 1 h was 98,7%, in the same concentration of saponin. The quantification of the RT-PCR and nested RT-PCR amplification product were accomplished by capillary electrophoresis in microchips using the Bioanalyzer 2100 in conjunction with the LabChip (TM) DNA 500 and DNA 1000. The molecular classification of nineteen strains isolated from different juice and acidic fruit, were studied using RAPD-PCR and capillary electrophoresis in microchips. Using five random primers in the RAPD assay, it was possible to study the polymorphisms analyzed in microchips. According to electrophoresis analyses, the strains from concentrated and diluted orange juices (1, 2, 6), lemon concentrated juice (lim) and natural orange juice (T2, T3), showed genetic similarities with the A. acidoterrestris. The study of the phylogenetic analyses based on DNA comparison sequences of the variable region of 16S rRNA gene from Alicyclobacillus acidoterrestris, was utilized for the identification and grouping of eleven strains isolated from surface and juice of acid fruits. In the phylogenetic tree produced by neighbor joining and bootstrap 1000, the strains showed similarities of 99% among all strains, showing a high similarity of A. acidoterrestris with a strain isolated from lemon concentrate juice (lim), and a good discrimination between the species A. acidocaldarius, A. cycloheptanicus, A. sendaiensis and Sulfobacillus acidophilus.

No Brasil, a transmissão dos quatro sorotipos do vírus dengue ao homem ocorre através da picada da fêmea infectada de Aedes aegypti, também considerado vetor principal de outros arbovírus, como chikungunya e Zika. Além dessa espécie, o Aedes albopictus é considerado vetor potencial desses arbovírus. Populações brasileiras de Ae. aegypti e Ae. albopictus demonstraram a capacidade de realizar alguns repastos sanguíneos em diferentes hospedeiros dentro de um único ciclo de oviposição, o que chamamos de discordância gonotrófica. Paralelamente, a vigilância do DENV a partir de sua detecção em fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus que nunca se alimentaram de sangue é essencial para uma melhor compreensão da dinâmica de transmissão vertical desse agente etiológico. O objetivo desse estudo foi avaliar a paridade, a presença de sangue no estômago e o desenvolvimento ovariano de fêmeas de Ae. aegypti e de Ae. albopictus coletadas no Parque Esporte para Todos da Universidade de São Paulo - Cidade Universitária e na Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, bem como detectar DENV em fêmeas dessas espécies, oriundas de ovos coletados no Parque Municipal do Piqueri, São Paulo. Fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus capturadas tiveram o abdômen e ovários avaliados, através da técnica de dissecção. A investigação do RNA viral foi feita através de Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR). Foram encontrados 27% e 34% de fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus paridas, respectivamente, bem como 77% e 60% de fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus, respectivamente, com sangue no estômago. Foi constatado que 36% das fêmeas de Ae. aegypti estavam em discordância gonotrófica, enquanto essa taxa para Ae. albopictus foi de 27%. A transmissão vertical não foi detectada nas populações estudas. O campus da Faculdade de Saúde Pública e o Parque dos Esportes mostraram-se favoráveis para a manutenção e longevidade das duas espécies estudas. Apesar da transmissão vertical natural não ter sido detectada em nosso estudo, a investigação desse fenômeno é essencial para a compreensão da dinâmica de transmissão de arbovírus na natureza. / In Brazil, the transmission of the four serotypes of the dengue virus to human is transmitted out through the bite of the infected female of Aedes aegypti, it is also considered a vector of the main etiological agents of other arboviruses, such as chikungunya and Zika. In addition, Aedes albopictus is considered a potential arbovirus vector. Brazilian populations of Ae. aegypti and Ae. albopictus have already demonstrated an ability to perform some blood supply in different hosts within a single oviposition cycle, which we call gonotrophic discordance. At the same time, surveillance of the DENV from its detection in Ae. aegypti and Ae. albopictus that has never fed on blood is essential for a better understanding of the dynamics of vertical transmission of etiologic agent. The objective was to evaluate the parity, the presence of blood in the stomach and the ovarian development of Ae. aegypti and Ae. albopictus collected in the Parque Esporte para todos of Universidade de São Paulo - Cidade Universitária and Faculdade de Saúde Pública of Universidade de São Paulo, as well as detecting DENV in females of these species, from eggs collected in the Parque Municipal do Piqueri, São Paulo. Females of Ae. aegypti and Ae. albopictus captured, from the results obtained, through the technique of dissection. The investigation of the virus was done through Reverse Transcription followed by Polymerase Chain Reaction. We found 27% and 34% of Ae. aegypti and Ae. albopictus parous, 77% and 60% of Ae. aegypti and Ae. albopictus, respectively, with blood in the stomach. It was found that 36% of Ae. aegypti was in gonotrophic discordance, while that rate for Ae. albopictus was 27%. Vertical transmission was not detected in the selections studied. The campus of the Faculdade de Saúde Pública and the Parque Esporte para todos were favorable to the maintenance and longevity of the two species studied. Vertical nature transmission was not detected in our study, an investigation is an essential event for understanding the transmission of arbovirus data in nature.

INTRODUÇÃO: Em grandes cidades, como São Paulo, a pequena porcentagem de matas existentes é representada pelos parques municipais. Estas áreas, além de representarem ambientes de lazer para as pessoas, albergam uma enorme diversidade biológica, desde mosquitos até aves e mamíferos. A interação destas espécies favorece a circulação de Flavivirus, causadores de importantes doenças humanas, que têm nas aves um importante reservatório. Atribui-se às aves migratórias o papel de carreadoras dos vírus, já que as mesmas percorrem longas distâncias para completar seu ciclo biológico. A chegada de aves do Hemisfério Norte ocorre em alguns Parques, o que favoreceria a dispersão de alguns vírus, como o Vírus do Nilo Ocidental, já que nestas áreas estão presentes mosquitos potencialmente vetores. OBJETIVOS: identificar infecção por Flavivírus nas aves dos parques municipais de São Paulo. MÉTODOS: De Março de 2012 a Janeiro de 2013, foram coletadas amostras de swab de cloaca, orofaringe e sangue de aves capturadas em redes de neblina de duas áreas do município de São Paulo: Parque Anhanguera e Fazenda Castanheiras/APA Bororé Colônia. As aves foram anilhadas e liberadas após a coleta do material. Foi realizada técnica de RT-PCR em tempo real, utilizando iniciadores genéricos que amplificam fragmento do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento. RESULTADOS: Foi capturado um total de 231 aves, em sua maioria da Ordem Passeriformes. De um total de 463 amostras, nenhuma amostra apresentou presença de RNA viral. DISCUSSÃO: Em se tratando de alguns Flavivírus, os passeriformes são considerados os reservatórios mais competentes no ciclo de transmissão, pois atingem altos níveis de viremia. Cabe ressaltar que algumas espécies desta ordem, de ocorrência na cidade de São Paulo, já foram identificadas como portadoras dos vírus Rocio e Ilhéus. A ausência de positividade é esperada, pois embora altamente sensível, a técnica de PCR depende do estado de viremia das aves, que é curta. CONCLUSÃO: Os parques municipais são áreas que aproximam aves, mosquitos e humanos, pelo papel ambiental e de lazer que os mesmos representam. Este fato classifica estas áreas como locais com potencial de transmissão de Flavivirus, o que torna importante a continuação este estudo, aumentando as áreas de abrangência, para conhecer os Flavivírus circulantes e realizar vigilância para vírus que podem ocasionar problemas de Saúde Pública / INTRODUCTION: In big cities, as São Paulo, the little percentage of existing forests is represented by the municipal parks. These áreas, besides acting as entertainment environments to the users, promote a huge biodiversity, including mosquitoes, birds and mammals. These species interaction promotes Flavivirus circulation, viruses responsible for important human diseases. The avian species are important reservoirs for these viruses, specially the migrating birds that can fly for long distances, carrying these viruses to several areas. In some parks, the arrival of migrating birds from the North Hemisphere is documented, fact that can support some viruses dispersion, for example, the West Nile Vírus, considering that in these areas potencial vector for this virus can be found. OBJECTIVES: detect Flavivirus infection in birds captured in municipal parks of São Paulo city. METHODS: from March, 2012 to January, 2013, oropharyngeal and cloacal swabs, and blood samples were collected from birds captured in mist-net webs located in two municipal areas: Anhanguera Park and Castanheiras Farm/APA Bororé Colônia. The birds were ringed and released after samples collection. The real time RT-PCR was performed, using generic primers which amplify NS5 gene fragment. Positive samples were forwarded to sequence analysis. RESULTS: a total of 231 birds were capture, in which the majority belongs to Passeriforms order. Of 463 samples collected, all samples were negative for the viral RNA presence. DISCUSSION: when talking about Flaviviruses, the passeriforms are considered the most competent reservoirs in the transmission cycle, because they can achieve great viremia levels. Some passeriforms species, endemic in São Paulo city, were identified as Rocio and Ilhéus viruses carriers in previous studies. The negativity is expected, once the Real Time RT-PCR, although highly sensitive, depends on the viremia duration, which is short in avian species. CONCLUSION: the public parks are areas which encloses birds, mosquitoes and the human being, for the environmental and entertainment role they play. This fact classifies these parks as areas with great potencial of Flavivirus transmission, ressalting the great importance to continue this study, increasing the number of areas, to detect the circulating Flavivirus and to perform surveillance for viruses which can cause public health problems

No Brasil, a transmissão dos quatro sorotipos do vírus dengue ao homem ocorre através da picada da fêmea infectada de Aedes aegypti, também considerado vetor principal de outros arbovírus, como chikungunya e Zika. Além dessa espécie, o Aedes albopictus é considerado vetor potencial desses arbovírus. Populações brasileiras de Ae. aegypti e Ae. albopictus demonstraram a capacidade de realizar alguns repastos sanguíneos em diferentes hospedeiros dentro de um único ciclo de oviposição, o que chamamos de discordância gonotrófica. Paralelamente, a vigilância do DENV a partir de sua detecção em fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus que nunca se alimentaram de sangue é essencial para uma melhor compreensão da dinâmica de transmissão vertical desse agente etiológico. O objetivo desse estudo foi avaliar a paridade, a presença de sangue no estômago e o desenvolvimento ovariano de fêmeas de Ae. aegypti e de Ae. albopictus coletadas no Parque Esporte para Todos da Universidade de São Paulo - Cidade Universitária e na Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, bem como detectar DENV em fêmeas dessas espécies, oriundas de ovos coletados no Parque Municipal do Piqueri, São Paulo. Fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus capturadas tiveram o abdômen e ovários avaliados, através da técnica de dissecção. A investigação do RNA viral foi feita através de Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR). Foram encontrados 27% e 34% de fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus paridas, respectivamente, bem como 77% e 60% de fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus, respectivamente, com sangue no estômago. Foi constatado que 36% das fêmeas de Ae. aegypti estavam em discordância gonotrófica, enquanto essa taxa para Ae. albopictus foi de 27%. A transmissão vertical não foi detectada nas populações estudas. O campus da Faculdade de Saúde Pública e o Parque dos Esportes mostraram-se favoráveis para a manutenção e longevidade das duas espécies estudas. Apesar da transmissão vertical natural não ter sido detectada em nosso estudo, a investigação desse fenômeno é essencial para a compreensão da dinâmica de transmissão de arbovírus na natureza. / In Brazil, the transmission of the four serotypes of the dengue virus to human is transmitted out through the bite of the infected female of Aedes aegypti, it is also considered a vector of the main etiological agents of other arboviruses, such as chikungunya and Zika. In addition, Aedes albopictus is considered a potential arbovirus vector. Brazilian populations of Ae. aegypti and Ae. albopictus have already demonstrated an ability to perform some blood supply in different hosts within a single oviposition cycle, which we call gonotrophic discordance. At the same time, surveillance of the DENV from its detection in Ae. aegypti and Ae. albopictus that has never fed on blood is essential for a better understanding of the dynamics of vertical transmission of etiologic agent. The objective was to evaluate the parity, the presence of blood in the stomach and the ovarian development of Ae. aegypti and Ae. albopictus collected in the Parque Esporte para todos of Universidade de São Paulo - Cidade Universitária and Faculdade de Saúde Pública of Universidade de São Paulo, as well as detecting DENV in females of these species, from eggs collected in the Parque Municipal do Piqueri, São Paulo. Females of Ae. aegypti and Ae. albopictus captured, from the results obtained, through the technique of dissection. The investigation of the virus was done through Reverse Transcription followed by Polymerase Chain Reaction. We found 27% and 34% of Ae. aegypti and Ae. albopictus parous, 77% and 60% of Ae. aegypti and Ae. albopictus, respectively, with blood in the stomach. It was found that 36% of Ae. aegypti was in gonotrophic discordance, while that rate for Ae. albopictus was 27%. Vertical transmission was not detected in the selections studied. The campus of the Faculdade de Saúde Pública and the Parque Esporte para todos were favorable to the maintenance and longevity of the two species studied. Vertical nature transmission was not detected in our study, an investigation is an essential event for understanding the transmission of arbovirus data in nature.

O gênero Hantavírus está incluído na família Bunyaviridae que são vírus emergentes associados a roedores que podem infectar o homem causando graves doenças. Nas Américas, os Hantavírus causam uma síndrome pulmonar e cardiovascular (SPCVH) com alta letalidade. Cerca de 1600 casos de SPCVH já foram notificados no Brasil causando mais de 600 óbitos. Sete espécies de Hantavírus são conhecidas no Brasil incluindo o vírus Araraquara que circula nas regiões de cerrado do país associado ao roedor Necromys lasiurus. Para o desenvolvimento de uma RT-PCR em tempo real para detecção e quantificação de Hantavírus, mostramos as etapas para o desenvolvimento de uma one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I para Hantavírus Araraquara que se mostrou específica para o gênero e capaz de detectar até 10 cópias por mL de RNA viral na amostra. Além disso, realizamos um estudo filogenético utilizando algoritmos bayesianos, com 190 sequências completas do gene da nucleoproteína, oriundas de 30 países durante um período de 25 anos (1985-2010) que encontravam-se disponíveis no GenBank (NCBI). Baseando-se em uma taxa média de 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) substituições nucleotídicas por sítio/ano, foi possível inferir que os Hantavírus teriam aproximadamente 1917 anos. O processo de dispersão dos Hantavírus pelo mundo teria ocorrido há aproximadamente 500 anos, e a introdução destes vírus nas Américas teria ocorrido há 549 anos (95% HPD 1555-341 anos), via América Central ou México, originando os Hantavírus adaptados aos roedores da subfamília Neotominae, e pelo Brasil surgindo há 406 anos (95% HPD 1150-250 anos) os Hantavírus associados a roedores da subfamília Sigmodontinae, e posteriormente dispersaram para todo o continente sul-americano. O trabalho contribui de forma relevante para o diagnóstico das infecções por Hantavírus com a one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I e também, contribui para o entendimento da filogenia e história destes vírus, oferecendo subsídios ao entendimento sobre como teria ocorrido o espalhamento dos Hantavírus pelo mundo. / The genus Hantavirus is included in the family Bunyaviridae are viruses emerging carried by rodents, which can infect humans causing serious illness. In the Americas, the Hantavirus causing a pulmonary syndrome (HPS) with high lethality. About 1,600 cases of HPS have been reported in Brazil, cause over 1600 deaths. Seven species of Hantavirus are known in Brazil, including Araraquara virus circulating in Cerrado regions (or Savannah regions) of the related in rodents Necromys lasiurus. The development of a real-time RT-PCR for detection and quantitation of Araraquara virus, here we show the steps for developing a one-step SYBR Green real-time RT-PCR for virus Araraquara which proved to be specific for the genus and capable of detecting up to 10 copies of viral RNA per ml in the sample. Furthemore, we performed a phylogenetic analysis using Bayesian algorithms, with 190 complete sequences of the nucleoprotein gene, originating from 30 countries over a 25 year period (1985-2010) that were available in GenBank (NCBI). Based on an average rate of 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) nucleotide substitutions per site/year, it was possible to infer that the Hantavirus would be about 1917 years old. The Hantavirus spreading in the world have occurred for nearly 500 years, and the introduction of these viruses have occurred in the Americas 549 years ago (95 years% HPD 1555-341) bye Central America or Mexico, causing the Hantavirus adapted to rodents subfamily Neotominae, and Brazil emerged 406 years ago (95% HPD 1150-250 years) the Hantavirus associated with rodents subfamily Sigmodontinae, and subsequently disseminated to South America. The work contributes significantly to the diagnosis of Hantavirus infections with one-step SYBR Green real-time RT-PCR and also contributes to an understanding of the phylogeny and evolutionary history of these viruses, offering subsidies have occurred understanding of how the Hantavirus spread of the worldwide.

Os ovos embrionados são estruturas complexas compostas pelo embrião e as membranas de suporte (corioalantóide, amniótica, gema). O desenvolvimento embrionário e suas membranas geram diversos tipos de células que são necessárias para a replicação bem sucedida de uma grande variedade de vírus. Dentre os vírus entéricos, os ovos embrionados foram usados como o principal hospedeiro para o isolamento, cultivo e propagação da grande maioria destes. O presente trabalho descreve o isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF), assim como a caracterização macroscópica do vírus relacionado com problemas entéricos em lotes de aves comerciais no Brasil. Amostras intestinais provenientes de galinhas ou frangos de corte sadias ou com problemas entéricos (diarreia) e que se apresentaram positivas, através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) e da técnica da trancriptase reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR), para Astrovírus de Galinha, Parvovírus de Galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Rotavírus Aviário, Reovírus Aviário, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas e Adenovírus Aviário Tipo 1 foram selecionadas para a realização do isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados SPF. Mortalidade e lesões macroscópicas como hemorragias, edema, nanismo, enrolamento, aspecto gelatinoso e deformações foram encontradas nos embriões, porém as membranas de suporte do ovo não apresentaram alteração. A confirmação viral nas passagens nos ovos foi realizada mediante o uso da PCR ou RT-PCR. Houve a replicação de Astrovírus de galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Adenovírus Aviário do Tipo 1, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas, Parvovírus de Galinha e Reovírus Aviário nos ovos embrionados SPF, inoculados via saco da gema, aos sete dias de idade. No entanto, estes vírus também foram isolados em ovos embrionados de 14 dias de idade. A inoculação pelo saco da gema se mostrou uma ótima via para o isolamento viral. Foram isoladas duas amostras de Parvovírus de Galinha, oito amostras de Astrovírus de Galinha, sete amostras do Vírus da Bronquite das Galinhas, dezesseis amostras de Vírus da Nefrite Aviária, onze amostras de Adenovírus Aviário do Tipo 1 e três amostras de Reovírus Aviário. Nenhuma amostra de Rotavírus Aviário foi isolada. As características macroscópicas apresentadas nos embriões foram similares em todos os vírus isolados. Várias amostras utilizadas não apresentaram lesões e foram negativas na detecção molecular, e foram consideradas amostras negativas no isolamento viral. A positividade nas provas moleculares (PCR e RT-PCR) e a presença de lesões nos embriões determinou o isolamento virale confirmou que os ovos embrionados de galinha são excelentes hospedeiros para o isolamento, cultivo, propagação e caracterização de vírus relacionados com problemas entéricos, no Brasil. As alterações encontradas no embrião sugerem a patogenicidade do vírus e o possível dano que causariam ao desenvolver a doença. Futuros trabalhos determinarão a relação existente entre os vírus isolados neste estudo e aqueles isolados em todo o mundo, estabelecendo homologia ou heterogeneidade entre eles. / The embryonated eggs are complex structures composed by embryo and support membranes (yolk sac, chorioallantoic membrane, amniotic sac). The embryo development and their membranes produced many kinds of cells that are necessary for successful replication of many viruses. Between the enteric viruses, the embryonated eggs have been used as the principal host for isolation, culture and propagation of many of these viruses. The present work describes the isolation, culture, propagation and macroscopic characterization of astrovírus, adenovirus, coronavirus, parvovirus, reovírus e rotavirus, related to enteric problems in commercial flows at Brazil in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Intestinal samples from hens or chickens health or with enteric problems (diarrhea), but showed positive for chicken astrovírus, chicken parvovirus, avian nephritis vírus, avian rotavirus, avian reovirus, bronchitis infectious vírus and fowl adenovirus type 1, through PCR and RT-PRC reactions, were selected for making of isolation, culture and propagation in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Mortality and macroscopic lesions presented in the embryos characterized by hemorrhages, edemas, stunting, enrollment, gelatin features and deformations, however the support membranes not presented any damaged. The viral confirmation in the eggs passages was carry out using the polymerase chain reaction and transcriptase reverse of the polymerase chain reaction. Chicken astrovírus, avian nephritis vírus, fowl adenovirus type 1, bronchitis infectious vírus, chicken parvovirus and avian reovírus grow well in chickens embryonated eggs specific pathogen free SPF, inoculated in the yolk sac on seven days-old, however these viruses were isolated in embryonated eggs of fourteen days-old, too. The inoculation by yolk sac resulted be a optimal route for viral isolation, getting isolate two samples of chicken parvovirus, eight samples of chicken astrovirus, seven samples of bronchitis infectious vírus, sixteen samples of avian nephritis vírus, eleven samples of fowl adenovirus type one and three samples of avian reovirus, but any samples was isolated for avian rotavirus. The macroscopic characteristics presented in the embryos were similar in all of isolated viruses. Many samples used not present lesions and were negative in the molecular detection, considering as negative samples to viral isolation. The positivity in the molecular tests (PCR and RT-PCR) and the presence of injuries in the embryo determinate the presence of enteric vírus and that chicken astrovírus, avian nephritis vírus, fowl adenovirus type 1, bronchitis infectious vírus, chicken parvovirus and avian reovírus were isolated, confirming that the chicken embryonated eggs are excellent host for isolation, culture, propagation and characterization of vírus related with enteric problems at Brazil. The patogenicity presented in the embryo determinate the harmful the vírus are and the possible damage that their will produce in the development of disease. Future works will establish the relation exist between the isolated vírus in this work and the other viruses around the world, and their roll in the enteric disease.

<p>Influenca kopitara je ozbiljno, akutno, visoko kontagiozno, respiratorno oboljenje kopitara sa karakterističnom kliničkom slikom u tipu respiratornog simptoma. Ovo oboljenje izazivaju dva suptipa influenca A virusa (EIV &ndash; ekvini influenca virus) &ndash; H7N7 (ranije poznat kao tip 1) i H3N8 (ranije poznat kao tip 2) iz familije Orthomyxoviridae. Cilj istraživanja je bio da se uporede različite dijagnostičke metode za dijagnostiku influenca A virusa kod kopitara sa različitim vakcinalnim statusom i kliničkim nalazom. U eksperimentu je učestvovalo 61 grlo. Sprovedena je epizootiolo&scaron;ka anketa, grla su klinički pregledana, analizirana je kompletna krvna slika, urađen HI, Direktigen i RT-PCR test. Rezultati su pokazali prisustvo oba suptipa virusa. Registrovane su seropozitivne jedinke kod kojih je dokazano prisustvo antigena virusa influence, ali bez dokazanog prisustva genoma virusa influence.</p> / <p>Equine influenza is a serious, acute, highly contagious, respiratory disease, equine with characteristic clinical picture in the type of respiratory syndrome. This disease is caused by two subtypes of influenza A virus (EIV - equine influenza virus) - H7N7 (formerly known as type 1) and H3N8 (formerly known as type 2) from the family Orthomyxoviridae. The aim of the research was to compare different diagnostic methods for the diagnosis of influenza A virus in equine vaccine with different status and clinical findings. The experiment involved 61 throat. Conducted epidemiological surveys, clinical throat examined, analyzed the complete blood count, done HI, Directigen and RT-PCR test. The results showed the presence of both subtypes of the virus. Seropositive individuals are registrated in which the presence of an influenza virus antigen is confirmed, but without evidence of the presence of the influenza virus genome.</p>

A instabilidade genética é um importante evento associado ao carcinoma epidermóide de boca, sendo alterações na região cromossômica 11q constantemente relatadas. Neste estudo, genes localizados na região cromossômica 11q, especificamente os genes CTTN, PPFIA1, SHANK2, TAOS1 e MMP-7, foram investigados quanto a diferenças de expressão de transcritos entre carcinomas epidermóides de boca e suas margens correspondentes. A expressão desses genes foi relacionada com aspectos clínicos e histológicos, com critérios de agressividade estabelecidos, e com a sobrevida dos pacientes. Foram analisadas pela técnica de qRT-PCR 29 amostras congeladas de tumores e 25 margens. Todos os genes apresentaram maiores valores de expressão nos tumores em comparação com as margens, embora apenas o gene MMP-7 tenha exibido valores estatisticamente significantes. A expressão do gene MMP-7 mostrou fraca associação com tumores menos agressivos, e os outros genes apresentaram maiores valores de expressão em tumores mais agressivos, sem significância estatística. Não houve diferença estatística entre a freqüência das variáveis clínicas e histopatológicas com a expressão dos genes estudados, porém o PPFIA1 demonstrou maiores níveis de expressão em tumores de assoalho. Em relação à sobrevida, a expressão elevada de PPFIA1 pode implicar em um maior risco de óbito. Assim, é possível a participação do gene MMP-7 no desenvolvimento da neoplasia, e a relação do PPFIA1 com o risco de óbito, porém a expressão de transcritos dos genes CTTN, SHANK2, TAOS1 e MMP-7 não pode ser relacionada com agressividade tumoral e prognóstico. / Genetic instability is an important event associated with oral squamous cell carcinoma, and alterations in the chromosome region 11q are constantly reported. In this study, genes located on chromosome region 11q, specifically genes CTTN, PPFIA1, SHANK2, TAOS1 and MMP-7, were investigated for differences in the expression of transcripts in oral squamous cell carcinoma and their corresponding margins. The expression of these genes was correlated with clinical and histological aspects, aggressiveness criteria established, and with patient survival. Twenty-nine frozen samples of tumors and 25 samples of margin tissue were analyzed using qRT-PCR. All genes showed a higher expression in tumors, compared with the margins, although only the MMP-7 gene demonstrated statistically significant values. The expression of the MMP-7 gene showed weak association with less aggressive tumors, and the other genes showed higher expression in more aggressive tumors, without statistical significance. There was no statistical difference between the frequency of clinical and histopathological variables and the expression of genes studied, however the PPFIA1 gene demonstrated higher levels of expression in tumors of the floor of mouth. With regard to survival, the high expression of PPFIA1 may imply a greater risk of death. Thus, it is possible that the MMP-7 gene participates in the development of malignancy, and PPFIA1 expression may also be associated with risk of death, however, the expression of transcripts of the CTTN, SHANK2, TAOS1 and MMP-7 genes may not be related to tumor aggressiveness and prognosis.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lidianne Lunguinho.pdf: 986527 bytes, checksum: 1ca17f21ab0579c64d64579574eb4365 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The guarana, Paulinia cupana var. sorbilis, is a native plant and grown in the Amazon region. His greatest production was concentrated in the State Amazonas, Bahia, but currently the largest producer and Acre, Para, Mato Grosso, Rondônia are major producers. (Calderazo et. Al., 1986). The expansion of its culture is attributed to great use in industry soft drinks and pharmacopeia. Belonging to the family Sapindaceae, is a plant lowland tropical, shrubs, woody vines adapted to the climate hot and humid, produces the fruit known as guarana. Geographically There are two varieties defined, and sorbilis typica: being the first is the most widely cultivated, accounting for nearly all domestic production, the the second found in limited quantities in the river basins of the Upper Orinoco and Rio Negro. The objectives of this dissertation were to verify the occurrence of patterns different flowering among clones of guarana, maintained with and without fertilization; probe the existence of orthologs (homologous sequences) of genes Arabidopsis involved in flowering in plants and guarana, analyze the spatial and temporal expression of orthologous genes LEAFY, AGAMOUS and apetala in vegetative tissues and reproductive guarana. Took place during the flowering period of 2004 (August to October) were counted in ten inflorescences of four plants of each clone in three segments of its rachis and number of flowers functionally male and functionally female. Statistical analysis was done by tabulating the weekly number of female flowers and male to facilitate the analysis of correlation with the length of inflorescences. The results suggest that the occurrence of phase predominantly in female inflorescences is a feature less that the number of plastic phases predominantly male. To amplify by RT-PCR total RNA from different tissues and DNA of guarana primers were synthesized for apetala, LEAFY, AGAMOUS and primers for the actin gene transcripts were used as control of RNA concentration. Transcription experiments RT and amplification were carried out at temperatures of annealing primers 45 to 50 ° C, generating very faint specific bands and / or mainly nonspecific. . The results achieved not by state shows that the guarana genes LEAFY, AGAMOUS and apetala 1 highly similar sequences that served as the template for the synthesis of primers. / O guaranazeiro, Paulínia cupana var. sorbilis, é uma planta nativa e cultivada na região Amazônica. Sua maior produção concentrou-se no Estado do Amazonas, mas atualmente a Bahia e o maior produtor e o Acre, Para, Mato Grosso, Rondönia são grandes produtores. (Calderazo et. al., 1986). A expansão de sua cultura é atribuída, à grande utilidade na indústria de refrigerantes e farmacopéia. Pertencente a família Sapindaceae, é uma planta tropical de baixa altitude, arbustiva, lenhosa, trepadeira adaptada ao clima quente e úmido, produz o fruto conhecido como guaraná. Geograficamente existem duas variedades definidas, a Sorbilis e a Typica: sendo que a primeira é a mais cultivada, responsável por quase toda a produção nacional, a segunda encontrada em quantidades restritas nas bacias fluviais do Alto Orenoco e Alto Rio Negro. Os objetivos dessa dissertação foram verificar a ocorrência de padrões diferentes de florescimento entre clones de guaranazeiro, mantidos com e sem adubação; sondar a existência de ortologos (seqüências homologas) de genes de Arabidopsis implicados no florescimento em plantas de guaranazeiro e, analisar o padrão espacial e temporal de expressão dos ortologos dos genes LEAFY, APETALA e AGAMOUS em tecidos vegetativos e reprodutivos de guaranazeiro. Realizou-se durante o período de florescimento do ano de 2004 (agosto a outubro) foi realizada a contagem em dez inflorescências de quatro plantas de cada clone em três segmentos do seu raquis do número de flores funcionalmente masculinas e funcionalmente femininas. A análise estatística foi realizada mediante a tabulação semanal do número de flores femininas e masculinas para facilitar a análise de correlação com o comprimento das inflorescências. Os resultados permitiram sugerir que a ocorrência de fases predominantemente femininas nas inflorescências é uma característica menos plástica que o número de fases predominantemente masculinas. Para amplificar por RT-PCR o RNA total de diferentes tecidos e o DNA de guaranazeiro foram sintetizados primers para APETALA, LEAFY, AGAMOUS e primers para os transcritos do gene da ACTINA foram utilizados como controle de concentração do RNA. Os experimentos de transcrição reversa e amplificação foram realizados em temperaturas de anelamento dos primers de 45 a 50 °C, gerando bandas especificas muito tênues e/ou, principalmente, inespecificas. .Os resultados alcançados não pertiram afirmar que o guaranazeiro apresenta genes LEAFY, APETALA 1 e AGAMOUS altamente similares as seqüências que serviram de modelo para a síntese dos primers.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO-CYNTHIA PINTO.PDF: 1386521 bytes, checksum: cd8c6e6b087f4a1705287014f9b5ac34 (MD5) Previous issue date: 2009-07-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Human rotavirus constitutes one of the most important causes of diarrheic disease in children less than five years in the whole world. In 2006, the National Program of Immunization of Health Minister introduced a monovalent vaccine against rotavirus objecting the reduction of prevalence of rotaviruses. With the object of verifying the occurrence of genotypes of human rotavirus in children of 0 the 12 months vaccinated and non vaccinated residents in the city of Manaus in Amazon, had been analyzed during a year (may/2007 may/2008), a total of 294 feces diarrheic samples that had been colleted of children attended hospital of children in the city of Manaus. This analyzes was carried through by the detention of the viral genome through the techniques of PAGE (Polyacrilamide Gel Eletrophoresis) and RT-PCR (Reverse transcription Polymerase Chain Reaction). Through the PAGE method can be observed a positivity of 9.5% of the human rotavirus samples, and of these samples 36% were of vaccinated children against rotavirus. All of the positive samples of human rotavirus had been typed by the method of RT-PCR with use of specific primers for genotypes G (G1, G2, G3, G4 and G9) and genotypes P (P[8], P[4], P[6], P[9] e P[10]). By the typing, it was detected genotype G in 42.9% of the positive samples for rotavirus with detection only of genotype G2 and genotype P was detected in 94% of positive samples with detection only of P[4]. The combinations of genotypes G and P appeared in 50% of the positive samples for G and P, and all of these combinations were G2P[4]. It was observed that 17% of the positive samples for genotype G and 0,6% of the positive sample for genotype P had not presented characteristics for none of searched genotypes G and P. The number of positive samples for human rotavirus had been similar in such a way in children of the masculine sex how much in children of the feminine sex, being that these samples had predominated in children with age between 7 and 12 months. The positive samples of human rotavirus had been found in every months of had lasted the study with exception of august of 2007 and march of 2008. The vaccination reduce the human rotavirus incidence in children that had been take the two doses of vaccine, perhaps the emergency of the genotype G2P[4] observed in this study could not be associated to the vaccine. / Os rotavírus humanos constituem uma das mais importantes causas de doença diarréica em crianças menores de cinco anos no mundo. Em 2006, o Programa Nacional de Imunização do Ministério da Saúde introduziu uma vacina monovalente contra o rotavírus visando à redução da prevalência das rotaviroses. Com o objetivo de verificar a ocorrência de rotaviroses em crianças de 0 a 12 meses vacinadas e não vacinadas atendidas nos pronto-socorros infantis do município de Manaus no Amazonas, foram analisadas durante 13 meses (maio/2007 a maio/2008), um total de 294 amostras de fezes diarréicas coletadas de crianças atendidas em prontos socorros infantis do município de Manaus. Esta análise foi realizada pela detecção do genoma viral através das técnicas de EGPA (Eletroforese em Gel de Poliacrilamida) e RT-PCR (Reação da Polimerase em Cadeia com Transcriptase Reversa). Por meio do método da EGPA pode-se observar uma positividade de 9,5% das amostras para rotavírus humano, sendo que destas amostras, 36% eram de crianças vacinadas contra rotavírus. Todas as amostras positivas na EGPA para rotavírus humano foram tipadas pelo método de RT-PCR com utilização de primers específicos para os genótipos G (G1, G2, G3, G4 e G9) e genótipos P (P[8], P[4], P[6], P[9] e P[10]). Pela tipagem foi detectado o genótipo G em 42,9% das amostras positivas para rotavírus com detecção apenas do genótipo G2 e o genótipo P foi detectado em 94% das amostras positivas para rotavírus com aparecimento apenas do genótipo P[4]. As combinações dos genótipos G e P apareceram em 50% das amostras positivas para G e P, sendo todas da combinação G2P[4]. Foi observado que 17% das amostras positivas para o genótipo G e 0,6% das amostras positivas para o genótipo P não apresentaram características de nenhum dos genótipos G e P pesquisados. O número de amostras positivas para rotavírus humano foi semelhante tanto em crianças do sexo masculino quanto em crianças do sexo feminino, sendo que estas amostras predominaram em crianças de 7 a 12 meses. As amostras positivas para rotavírus humano, assim como para os genótipos G e P foram encontradas em todos os meses do estudo, com exceção de agosto de 2007 e março de 2008. A vacinação reduz a incidência de rotavírus humano em crianças que tomaram as duas doses da vacina, porém a emergência do genótipo G2P[4] observada neste estudo pode não estar associada à vacina.