Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rangelia vitalii is a member of the protozoan phylum Apicomplexa, class Sporozoasida, order Piroplasmorida, that causes a disease called rangeliosis in dogs, popularly known as " bleeding plague" or "nambyuvú". The transmission of this parasite occurs through tick and affects dogs in rural and periurban areas especially in hotter times of the year, which favors an increase in ticks population. To date this disease has been described only in Brazil. Rangeliosis is characterized by anemia, jaundice, fever, splenomegaly, generalized lymph node enlargement, hemorrhage along the gastrointestinal tract, and persistent bleeding through the tips of the pinnae, external surface of the ears, nose, and oral cavity. The aim of this study was to evaluate hematologic changes and consequent bone marrow response during the acute phase in dogs experimentally infected with Rangelia vitalii. 12 dogs were, divided into two groups: group A consisted of five healthy animals, and group B consisted of seven dogs experimentally infected with R. vitalii. After inoculation, the animals were monitored for parasitemia by blood smears from the tips of the ear. In group B the parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes five days post-inoculation (PI). Blood samples with EDTA for complete blood count (CBC) were performed on days 0, 10, 20 and 30 PI and on days 10 to 20 PI the reticulocyte count. After blood collection, the dogs were anesthetized bone marrow aspiration for the myelogram. This study demonstrated a reduction (P <0.01) in erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin in the infected group compared to control. On day 10 PI the infected animals showed a normocytic normochromic anemia, however, on day 20 PI was observed macrocytic hypochromic anemia and increased (P <0.05) in the red cell distribution width (RDW) in the infected group compared to control. A decreased (P <0.05) in total leukocyte count as a result of a decrease in neutrophil and eosinophil count was observed in the infected animals (P <0.05). In the infected group there was also an increase in lymphocyte and monocyte count in comparasion to control (P <0.05). Increased (P <0.01) in the reticulocyte count was observed in the infected group compared to the control group. The myelogram showed a decrease (P <0.05) in myeloid:erythroid ratio as a result of increased erythroid precursors (rubriblast, prorubricyte, rubricyte and metarubricyte) and a decrease in the myeloid lineage (myelocyte, band and segmented). Other cells such as lymphocytes, plasma cells and macrophages were more frequent in bone marrow on day 20 PI in the infected group compared to the control group. Our results, we conclude that rangeliosis can lead to a regenerative, immunomediated, hemolytic anemia, together with leukopenia due to neutropenia and eosinopenia, as well as lymphocytosis and monocytosis. These findings were observed in the acute phase experimental of infection and are similar to those found in cases of natural infection at different stages of the disease. / Rangelia vitalii é um protozoário do filo Apicomplexa, classe Sporozoasida, ordem Piroplasmorida, que provoca, em caninos, uma doença denominada de rangeliose conhecida popularmente como "peste do sangue" ou "nambyuvú". A transmissão deste parasito ocorre através do carrapato e afeta cães das zonas rurais e periurbanas principalmente nas épocas mais quentes do ano, que favorecem o aumento populacional de carrapatos. Até o momento essa doença foi descrita somente no Brasil. A rangeliose pode causar anemia, icterícia, febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, hemorragias no trato gastrintestinal e sangramento persistente pelas bordas e face externa das orelhas, narinas e cavidade oral. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações hematológicas e a resposta da medula óssea em cães infectados experimentalmente com Rangelia vitalii durante a fase aguda da infecção. Foram utilizados 12 cães, separados em dois grupos: grupo A composto por cinco animais saudáveis, e grupo B constituído por sete cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Após inoculação, os animais foram monitorados para avaliação da parasitemia por meio de esfregaços sanguíneos de ponta de orelha. No grupo B o parasito foi encontrado no interior de eritrócitos, neutrófilos e monócitos cinco dias pós-inoculação (PI). As coletas de sangue com EDTA para a realização do hemograma foram feitas nos dias 0, 10, 20 e 30 PI. Nos dias 10 e 20 PI também foram realizadas as contagens de reticulócitos. Posteriormente à coleta de sangue, os cães foram anestesiados para coleta dos aspirados de medula óssea para realização do mielograma. Este estudo demostrou redução (P<0,01) no número eritrócitos, hematócrito e hemoglobina no grupo infectado em relação ao controle. No dia 10 PI os animais infectados apresentaram anemia normocítica normocrômica, entretanto, no dia 20 PI foi observada anemia macrocítica hipocrômica e aumento (P<0,05) na amplitude de distribuição eritroide no grupo infectado. Houve redução (P<0,05) nos leucócitos totais no grupo infectado, em relação ao grupo controle, em consequência da redução de neutrófilos e eosinófilos (P<0,05). Também ocorreu aumento (P<0,05) na contagem de linfócitos e monócitos nos cães infectados em relação ao grupo controle. Aumento (P<0,01) na contagem de reticulócitos foi observado no grupo infectado em relação ao grupo controle. No mielograma foi observado uma diminuição (P<0,05) na relação mieloide:eritroide em consequência do aumento dos precursores eritroides (rubriblasto, prorubrícito, rubrícito e metarrubrícito) e diminuição na linhagem mieloide (mielócito, bastonetes e segmentados). Outras células como linfócitos, plasmócitos e macrófagos foram mais frequentes no mielograma no dia 20 PI no grupo infectado em relação ao grupo controle. A partir dos resultados, pode-se concluir que a rangeliose causa anemia hemolítica imunomediada extravascular regenerativa, que coincide com leucopenia por neutropenia e eosinopenia, além, de linfocitose e monocitose. Estes achados que ocorrem na fase aguda da infecção experimental, são semelhantes aos encontrados em casos de infecção natural, nas diferentes fases da doença.

The parasite Rangelia vitalii is the etiologic agent of rangeliosis, a disease that leads to a wide variety of clinical signs, including hemostatic disorders characterized by bleeding. However, the causes of this process have not been established. The aim of this study was to evaluate the production of megakaryocytes, platelet count, clotting time, platelet activity and to determine the activity of enzymes that hydrolyze nucleotides and adenine nucleosides in platelets of dogs experimentally infected with R. vitalii. For this study, 12 dogs were separated in two groups: Group A was composed by five healthy dogs, and group B composed by seven dogs experimentally infected with R. vitalii. After inoculation, the animals were monitored by blood smears. The parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes five days post-inoculation (PI). Blood collection to perform platelet count, coagulation tests and measurement of platelet aggregation was performed on days 0, 10 and 20 PI. On days 10 and 20 PI, after this procedure, the dogs were anesthetized for collecting bone marrow samples to evaluate the production of megakaryocytes. To measure the activity of ectonucleotidases and adenosine deaminase, blood samples were collected on days 12 and 21 PI. Blood samples were stored in tubes containing EDTA to quantification of platelets, evaluation of platelet aggregation and measurement of enzymatic activity. The blood was stored in tubes containing citrate for realization of the clotting time. This study revealed a reduction (P<0.01) of platelet numbers in the infected group when compared to control group. Prothrombin time and active partial thromboplastin time showed no significant difference between infected and control animals. There was an increase (P<0.01) in the number of megakaryocytes in infected group when compared with control group. A reduction (P<0.01) of platelet aggregation was observed in dogs infected with R. vitalii. The hydrolysis of ATP, ADP, AMP and deamination of adenosine decreased (P<0.01) on day 12 PI. On day 21 PI, the activity of adenosine deaminase remained reduced (P<0.01), whereas it was observed an increase (P<0.05) in NTPDase levels. From these results, we can conclude that rangeliosis is responsible for severe thrombocytopenia during the acute phase of infection, and this can be due to splenic sequestration and/or immune-mediated thrombocytopenia. Also, alterations in purinergic system contribute to the occurrence of hemostatic disorders observed in this disease. / O parasito Rangelia vitalii é o agente etiológico da rangeliose, uma enfermidade que cursa com uma grande variedade de sinais clínicos, incluindo desordens hemostáticas caracterizadas por sangramentos. Entretanto, as causas das alterações no processo hemostático nessa doença ainda não foram esclarecidas. O objetivo deste estudo foi avaliar os distúrbios hemostáticos através da produção de megacariócitos e contagem de plaquetas, a coagulação sanguínea, a atividade plaquetária e determinar a atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeo de adenina em plaquetas de cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Para este estudo, 12 cães foram separados em dois grupos: Grupo A foi composto por cinco cães saudáveis, e grupo B com sete cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Após inoculação, os animais foram monitorados quanto à parasitemia por esfregaço sanguíneo. O parasito foi encontrado no interior de hemácias, neutrófilos e monócitos cinco dias pós-inoculação (PI). As coletas de sangue para a realização da contagem plaquetária, testes de coagulação e mensuração da agregação plaquetária foram realizadas nos dias 0, 10 e 20 PI. Nos dias 10 e 20 PI, após esse procedimento, os cães foram anestesiados para coleta do aspirado de medula óssea com a finalidade de avaliar a produção de megacariócitos. Para avaliar a atividade das ectonucleotidases e adenosina desaminase, as coletas de sangue foram realizadas nos dias 12 e 21 PI. Este estudo demonstrou redução (P<0,01) no número de plaquetas entre o grupo infectado em relação ao controle. Os tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativado não apresentaram diferença significativa entre animais infectados e controles. Ocorreu aumento (P<0,01) do número de megacariócitos no grupo infectado quando comparado com o controle. Foi observado uma diminuição (P<0,01) na agregação plaquetária em cães infectados por R. vitalii. A hidrólise de ATP, ADP, AMP e desaminação da adenosina foram reduzidas (P<0,01) no dia 12 PI quando comparadas com o grupo controle. No dia 21 PI, a atividade da adenosina desaminase manteve-se reduzida (P<0,01), enquanto que ocorreu aumento (P<0,05) na atividade da ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase). A partir dos resultados, pode-se concluir que a rangeliose é responsável por grave trombocitopenia na fase aguda da infecção, a qual pode estar associada ao sequestro e/ou destruição imunomediada e, que alterações no sistema purinérgico contribuem para a ocorrência das desordens hemostáticas observadas na infecção pelo parasito R. vitalii.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rangelia vitalii is the etiologic agent of rangeliosis, a hemorrhagic disease that was described in dogs from South and Southeast Brazil, Uruguay and Argentina. The immunological aspects involved in this disease have not been fully elucidated. This study aimed to investigate the immunological parameters in rangeliosis by the determination of serum cytokines, nitric oxide, electrophoretic profile, acute phase proteins and immunoglobulins of dogs experimentally infected with R. vitalii. Twelve dogs were divided into two groups: Group A (control) composed by uninfected animals (n=5) and Group B consisting of animals inoculated with R. vitalii (n=7). After inoculation, animals were monitored by blood smear. Blood samples were collected through the jugular vein on days 0, 10 and 20 post-inoculation (PI) to determine the serum levels of interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), oxidation products of nitric oxide (NOx), electrophoretic profile, acute phase proteins (C-reactive protein and alpha 1 acid glycoprotein) and immunoglobulins (IgG, IgM, IgA and IgE). The parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes on day 5 PI in infected group. This study showed an increase (P<0.01) of cytokines levels in the infected group when compared to control group. Serum levels of NOx increased on days 10 (P<0.01) and 20 PI (P<0.05) in infected animals. Total protein decrease on days 10 (P<0.01) and 20 (P<0.05) PI. There was a reduction (P<0.01) in albumin in infected group when compared with control group. Alpha-1 globulin and gamma globulin fractions increased (P<0.01) on day 20 PI in infected animals. Alpha-2 globulin (days 10 and 20 PI) and beta-2 globulin (day 10 PI) were decreased (P<0.05) in infected animals when compared to control group. Beta-1 globulin fraction did not differ statistically. Serum C-reactive and alpha 1 acid glycoprotein concentrations increased (P<0.05) on days 10 and 20 PI in infected animals. IgG was increased on days 10 (P<0.05) and 20 PI (P<0.01) in infected animals. It was observed an increase (P<0.01) in the levels of IgM, IgA, and IgE in infected animals compared to control group. From these results, we can conclude that rangeliosis causes alterations in serum cytokines, nitric oxide metabolites, serum proteins and stimulates the synthesis of acute phase proteins and immunoglobulins. These alterations may be associated with the host immune protection against the piroplasms, similar to what occurs in other hemoparasite infections. / Rangelia vitalii é o agente etiológico da rangeliose, uma doença de curso hemorrágico que foi descrita em cães no Sul e Sudeste do Brasil, Uruguai e Argentina. Os aspectos imunológicos envolvidos nessa doença não foram totalmente elucidados. Nesse estudo objetivou-se investigar os parâmetros imunológicos na rangeliose, através da determinação sérica de citocinas, óxido nítrico, perfil eletroforético, proteínas de fase aguda e imunoglobulinas de cães experimentalmente infectados por Rangelia vitalii. Foram utilizados 12 cães divididos em dois grupos: Grupo A (controle) composto por animais não infectados (n=5) e Grupo B composto por animais inoculados com R. vitalii (n=7). Após inoculação, os animais foram monitorados por esfregaço sanguíneo. Foi coletado sangue da veia jugular nos dias 0, 10 e 20 pós-inoculação (PI) para a dosagem sérica das citocinas interferon gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 1 (IL-1) e interleucina 6 (IL-6), dosagem de produtos de oxidação do óxido nítrico (NOx), perfil eletroforético, dosagem de proteínas de fase aguda (proteína C-reativa e alfa 1 glicoproteína ácida) e imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA e IgE). No grupo infectado o parasita foi encontrado no interior de eritrócitos, neutrófilos e monócitos no dia 5 PI. Esse estudo demonstrou aumento (P<0,01) dos níveis de citocinas séricas no grupo infectado em relação ao grupo controle. Os níveis séricos de NOx aumentaram nos dias 10 (P<0,01) e 20 PI (P<0,05) nos animais infectados. A proteína total reduziu nos dias 10 (P<0,01) e 20 PI (P<0,05). Ocorreu redução (P<0,01) de albumina no grupo infectado em relação ao grupo controle. As frações alfa-1 globulina e gama globulina aumentaram (P<0,01) nos animais infectados no dia 20 PI. Alfa-2 globulina (dias 10 e 20 PI) e beta-2 globulina (dia 10 PI) decresceram (P<0,05) nos animais infectados em comparação ao grupo controle. A fração beta-1 globulina não diferiu estatisticamente. As concentrações séricas de proteína C- reativa e alfa-1 glicoproteína ácida aumentaram (P<0,05) nos dias 10 e 20 PI nos animais infectados. Ocorreu aumento de IgG nos dias 10 PI (P<0,05) e 20 PI (P<0,01) no soro dos animais infectados. Foi observado aumento (P<0,01) de IgM, IgA e IgE nos animais infectados em relação ao grupo controle. A partir dos resultados pode-se concluir que a rangeliose causa alteração na concentração de citocinas séricas, nos metabólitos do óxido nítrico, nas proteínas séricas e estimula a síntese de proteínas de fase aguda e imunoglobulinas. Estas alterações podem ser associadas à resposta imune do hospedeiro contra o piroplasma.