O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Adilson César Abreu Bernardi / Resumo: Assim como nos bovinos, a búfala pode ter mastite, sendo o Staphylococcus aureus o principal causador desta enfermidade. No entanto, é possível que sua prevalência possa estar superestimada. Este estudo objetivou comparar métodos fenotípico e genotípico na identificação de S. aureus em amostras de leite bubalino e ambiente de ordenha bem como propor uma nova PCR quantitativa em tempo real para identificação do mesmo. Para isso, de um total de 408 amostras obtidas de leite de búfalo, ambiente de ordenha e mãos de ordenhadores, 32 cepas presuntivas de S. aureus foram identificadas com base em seu crescimento fenotípico característico em ágar Baird Parker, reações positivas de Gram e catalase, capacidade de coagular plasma de coelho, e resultado positivo no ensaio de PCR Sa442 específico para a espécies. No entanto, testes adicionais revelaram que destas 32 estirpes, apenas 10 isolados apresentaram resultado positivo na aglutinação em látex, incluindo um S. chromogenes e um S. agentis. A análise de MALDI-TOF MS revelou que oito das 32 cepas eram S. aureus, 19 S. chromogenes, três S. agnetis e uma S. xylosus. Todas as oito cepas identificadas como S. aureus pela análise de MALDI-TOF e confirmadas pelo sequenciamento do 16S rRNA foram positivas na PCR do gene cydB específico para S. aureus. Além disso, foi encontrada uma cepa positiva para o gene sea, nove para o gene cna, uma para o gene sei, duas para o gene sem, uma para o gene seg, seis para o gene seh, 15 para o gene eno 11 p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Like cattle, buffalo may have mastitis, with Staphylococcus aureus being its main cause. However, it is possible that its prevalence may be overestimated. This study aimed to compare phenotypic and genotypic methods for S. aureus identification in samples of buffalo milk and milking environment as well as to propose a new quantitative real time PCR for its identification. For this, a total of 408 samples obtained from buffalo milk, milking environment and milkers hand, 32 presumed S. aureus strains were identified based on their characteristic phenotypic growth in Baird Parker agar, positive reactions of Gram and catalase, ability to coagulate rabbit plasma, and positive result in the species-specific Sa442 PCR assay. However, additional tests revealed that of these 32 strains, only 10 isolates tested positive for latex agglutination, including a S. chromogenes and a S. agentis. Analysis of MALDI-TOF MS revealed that eight of the 32 strains were S. aureus, 19 were S. chromogenes, three were S. agnetis and one was S. xylosus. All eight strains identified as S. aureus by MALDI-TOF analysis and confirmed by 16S rRNA sequencing were positive in S. aureus specific cydB gene PCR. In addition, a positive strain was found for the sea gene, nine for the cna gene, one for the sei gene, two for the sem, one for the seg gene, six for the seh gene, 15 for the eno 11 gene for the gene ebps two for the fib gene and 14 for the fnbA gene. Of the isolates, only one showed resistance to clindam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização. / Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres. / Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.

Introdução: A psoríase é uma doença inflamatória sistêmica crônica que afeta predominantemente a pele e as articulações. Sua etiologia é multifatorial e ainda não completamente entendida. A suscetibilidade genética à psoríase é um fator causal importante, e vários genes e polimorfismos têm sido associados à sua ocorrência. Poucos estudos avaliaram a influência dos polimorfismos C677T e A1298C do gene metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) na suscetibilidade à psoríase em diferentes populações (asiáticos e caucasides), e os resultados foram contraditórios. Material e métodos: Foram estudados 339 indivíduos caucasoides; desses, 142 eram pacientes com diagnóstico clínico de psoríase e 197 controles. Os grupos foram comparados quanto à freqüência dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR através de reação em cadeia da polimerase. Resultados: Para o polimorfismo C677T do gene MTHFR, a prevalência do genótipo mutante foi de 16,0% nos casos e 9,1% nos controles (p=0,103). Quando comparados os genótipos CC versus CT+TT, não houve diferença entre os grupos (p=0,605). A prevalência do genótipo CC para o polimorfismo A1298C foi de 2,8% nos casos e 4,1% nos controles (p=0,824). Quando comparados os genótipos AA versus AC + CC também não houve diferença significativa (p=0,943). A análise combinada dos genótipos foi similar entre os grupos. Conclusão: Nossos resultados não indicam qualquer associação entre os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR e suscetibilidade à psoríase nem demonstraram ação sinérgica da presença de ambos na redução de atividade da enzima MTHFR.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-18T11:36:43Z No. of bitstreams: 1 marcelle_f_m_silva_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 2789273 bytes, checksum: 9eec02b2cff5e8b7d0e13273295ee5ea (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcelle_f_m_silva_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 2789273 bytes, checksum: 9eec02b2cff5e8b7d0e13273295ee5ea (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-25T13:20:16Z No. of bitstreams: 1 marcelle_f_m_silva_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 2789273 bytes, checksum: 9eec02b2cff5e8b7d0e13273295ee5ea (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina (jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2014-10-01T16:29:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcelle_f_m_silva_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 2789273 bytes, checksum: 9eec02b2cff5e8b7d0e13273295ee5ea (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-01T19:12:19Z (GMT). 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A análise filogenética do gene que codifica para a proteína VP7 demonstrou que as mesmas agrupam juntamente com amostras humanas brasileiras de genótipo G5 (IAL28, Br 1054 e Br H8), no entanto a análise do gene que codifica para a proteína VP4 demonstrou que circularam três linhagens do genótipo P[8] (P[8]-1, P[8]-2, e P[8]-3) no Brasil entre 1986 e 2005 em associação com G5. As análises filogenéticas para os genes que codificam para VP1, VP2, e VP3 demonstraram que os mesmos pertencem ao genogrupo Wa-Like, comum a humanos, o que sugere que estas amostras possam ter se originado de uma amostra de RV-A humano. As análises filogenéticas dos genes de VP1, VP2 e Vp3 revelaram que todas as amostras foram classificadas dentro dos genótipos R1, M1 e C1, respectivamente Os resultados do presente estudo enfatizam a importância do monitoramento contínuo e a caracterização molecular das amostras de RV-A circulantes, principalmente para prever a possível emergência e/ou re-emergência de genótipos após a introdução de uma vacina contra RV-A nos diferentes continentes do mundo e para se melhor entender a dinâmica e o padrão de evolução dos RV-A de genótipo G5. / The group A rotavirus (RV-A) genotype G5, which is common in pigs but also detected in horses and cattle was frequently detected in stool samples collected in the 1980s and the early 1990s in Brazil. After 1996, the G5 has disappeared as an endemic/epidemic strain, becoming only sporadically detected. On the other hand the RV-A G9 has showed a broad geographic distribution. Recently, the G5 was reported in children with severe diarrhea in Argentina, Brazil, Cameroon, Paraguay, People’s Republic of China, and Vietnam. It suggests that the G5, although uncommon overall in humans, is found worldwide. Twenty-eight G5P[8] human RV-A strains isolated from a 19-year long sample collection (from 1986 to 2005), representing four different Brazilian states, was analyzed, and the genetic variability for VP1, VP2, VP3, VP4 and VP7 genes was determined. The nucleotide sequencing and phylogenetic analyses were performed. Based on VP7 gene phylogenetic analysis, all the analyzed sequences were clustered with other Brazilian G5 strains. The VP4 genes analyzes showed that three P[8] genetic lineages (P[8]-1, P[8]-2 and P[8]-3) circulated in Brazil between 1986 and 2005 in association with genotype G5. The analyzed partial sequences of VP1, VP2 and VP3 showed high identity with RV-A Wa-like strains, which suggests that they might have originated from a human RV-A strain. The phylogenetic analysis revealed that all Brazilian strains were classified as genotype R1, M1 and C1 for VP1, VP2 and VP3 genes, respectively. Our results show that the inner RV-A genotype G5 proteins have been adapted in humans for at least 20 years, emphasizing the importance of continuous virological surveillance of circulating RV-A to detect new variants and possible antigenic changes with potential effect on vaccine effectiveness and contribute to a better understanding of the dynamics and pattern of RV-A G5 evolution.

CABRAL, Paula Brito e. Perfil de marcadores sorológicos, salivares e moleculares de Mycobacterium leprae entre contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase. 2012. 82 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-11-01T15:14:21Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbcabral.pdf: 940316 bytes, checksum: 4e4b84a12cb3c19056d54bd626f283f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2012-11-06T13:53:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbcabral.pdf: 940316 bytes, checksum: 4e4b84a12cb3c19056d54bd626f283f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbcabral.pdf: 940316 bytes, checksum: 4e4b84a12cb3c19056d54bd626f283f9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Leprosy household contacts are group at high risk of developing the disease. We investigated the presence M. leprae DNA in nasal mucosa and anti-PGL1 serum IgG/IgM and salivary IgA/IgM antibodies from leprosy household contacts (n=135) in two endemic regions, Ceara, Brazil. Good correlation between serum IgM and IgG isotypes was observed both in MB and in PB leprosy household contacts (r = 0.39, p <0.0001). However, their levels were much different (p <0.0001). Among the contacts positive for serum IgM, 74 (87%) were found to be negative for serum IgG. In respect to the salivary antibodies, PB leprosy household contacts showed correlation between IgA and IgM (r = 0.60, p <0.0001); the same was observed in MB leprosy contacts (r = 0.77, p <0.0001). It was observed that in 75.3% of the leprosy household contacts who were positive to serum anti-PGL1, their salivary antibodies were negative. On the other hand, 50% of the leprosy household contact who were negative to serum anti-PGL1 antibodies, their salivary antibodies were positive. M. leprae DNA was found in nasal swab in 9 MB household leprosy contacts (10.6%) and in 3 PB leprosy contacts (6.0%). We concluded that quantitative analysis of serum and salivary anti-PGL1 in leprosy contacts is necessary for mounting strategies to survey subclinical leprosy infections in order to prevent development of the disease. / Os contatos de pacientes com hanseníase é um grupo de alto risco de desenvolver a doença, logo a precocidade no diagnóstico é uma importante ferramenta para o controle da enfermidade. Nós investigamos a presença de DNA de Mycobacterium leprae, através da Reação em Cadeia Polimerase (PCR), na mucosa nasal e anticorpos anti-PGL1 séricos, IgG/IgM, e salivares, IgA/IgM, por meio do ensaio imunoenzimático ligado à fase sólida (ELISA), em contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase (n=135) e seus casos índices. O estudo foi realizado em duas cidades endêmicas para a doença no Ceará, Crato e Maracanaú. Uma boa correlação entre os isotipos IgA e IgM salivares e IgG sérico foi observada quando comparou-se os contatos intradomiciliares e seus casos índices (p<0,01, p<0,005 e p<0.0001, respectivamente). Entretanto, essa relação não foi observada para IgM sérico anti-PGL1 (p>0,05). Observou-se alta frequência de IgM sérico anti-PGL1 no grupo de contatos negativos para IgG sérico anti-PGL1 (71/121, 58,6%). Dentre os contatos positivos para IgG sérico anti-PGL1, o nível de anticorpos séricos IgM anti-PGL1 positivos também foi alto (10/14, 71,4%). Em relação aos anticorpos salivares, contatos de pacientes com a forma clínica PB mostraram boa correlação entre IgA e IgM (r = 0.54, p <0.0001); o mesmo foi verificado em contatos de pacientes com a forma clínica MB (r = 0.61, p <0.0001). Foi observado que dos contatos positivos para os anticorpos salivares anti-PGL1, 53,3% obtiveram níveis de anticorpos séricos negativos. Por outro lado, dos contatos que foram negativos para os anticorpos salivares, 71,1% obtiveram níveis de anticorpos séricos positivos. O DNA de Mycobacterium leprae foi encontrado em swabs nasais de 9 contatos de pacientes portadores da forma clínica MB da hanseníase (10,6%) e em 3 contatos de pacientes portadores da forma clínica PB (6.0%). Nós concluímos que análises quantitativas de anticorpos séricos e salivares anti-PGL1 em contatos de pacientes com hanseníase são necessárias para montar estratégias de levantamento de infecções subclínicas da hanseníase, a fim de prevenir o desenvolvimento da doença.

MARQUES, Lívia Érika Carlos. Quantificação por PCR em tempo real de Mycobacterium leprae em amostras de secreção nasal e biópsias de pele em hansenianos. 2013. 72 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-10T13:45:20Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_lecmarques.pdf: 1846913 bytes, checksum: d8b054eabf9baa0a616cbcbc29750b1d (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-16T13:39:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_lecmarques.pdf: 1846913 bytes, checksum: d8b054eabf9baa0a616cbcbc29750b1d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T13:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_lecmarques.pdf: 1846913 bytes, checksum: d8b054eabf9baa0a616cbcbc29750b1d (MD5) Previous issue date: 2013 / Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy, is not cultivable in axenic medium. The quantification of bacilli performed by skin bacilloscopy and histopathology is useful for the clinical classification of leprosy and treatment monitoring. However, this methodology yields low results regards to sensitivity and specificity. On the other way, the real-time quantitative PCR (qPCR) is a sensitive and specific assay that allows quantification of a varied of samples and also can be used for differential diagnosis of many pathogens. To this date, no studies have evaluated the sensitivity and specificity of qPCR for the diagnosis of leprosy from nasal secretion samples. Therefore, this study aimed at detecting and quantifying DNA from M. leprae by qPCR from nasal secretion and biopsy samples from leprosy cases, correlating with clinical and bacteriological index. We analyzed 61 samples of nasal secretion and 19 biopsy specimens of skin lesion (paired) from confirmed leprosy cases seen at the National Reference Center for Sanitary Dermatology Dona Libânia. All samples were subjected to DNA extraction followed by amplification by nested PCR of a region of 238 bp which targets a RLEP2 repetitive sequence. The samples were subjected to quantification of 16S rRNA region of the genome of M. leprae by qPCR, which specificity was verified by amplicon melting temperature (Tm = 79.5 ° C). The method was able to detect amounts over to 20 fg of M. leprae DNA, equivalent to four bacilli units. Nasal secretion assay was able to confirm the diagnosis in 89.7% of the multibacillary cases (MB) and 73.3% of the paucibacillary cases (PB). In addition, MB patient biopsies sensitivity was 100%. The number of bacilli detected in nasal secretion samples from leprosy patients ranged from 1.39 x 10³ to 8.02 x 105 bacilli, while detection in MB patient biopsy ranged from 1,87 x 103 to 1,50 x 106. The real-time PCR is more sensitive than conventional PCR and can be used as a complementary tool for the clinical and histopathological diagnosis of leprosy. / O Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, não é cultivável em meio axênico. A quantificação do bacilo realizada pelo exame baciloscópico e histopatológico é útil para a classificação da hanseníase na escolha e monitoramento do tratamento. No entanto, esta metodologia produz resultados de especificidade e sensibilidade limitada. A PCR em tempo real (qPCR) é um ensaio sensível e específico que permite a quantificação a partir de diversas amostras e pode ser utilizada no diagnóstico diferencial de muitos patógenos. Até o momento, nenhum estudo avaliou a sensibilidade e especificidade da qPCR para o diagnóstico da hanseníase utilizando amostras de secreção nasal. Portanto, este estudo teve como objetivo detectar e quantificar o DNA de M. leprae por qPCR em amostras de secreção nasal e biópsias de pacientes com hanseníase, correlacionando com a avaliação clínica e o índice baciloscópico. Foram analisadas 61 amostras de muco nasal e 19 amostras de biópsia de lesão de pele (pareadas) de casos confirmados de hanseníase atendidos no Centro de Referência Nacional em Dermatologia Sanitária Dona Libânia. Todas as amostras foram submetidas à extração e amplificação de DNA por nested PCR da região de 238 pb da sequência RLEP2. Posteriormente as amostras foram submetidas à quantificação da região 16S rRNA do genoma de M. leprae pela qPCR, cuja especificidade foi verificada através da curva de dissociação (Tm=79,5ºC). O método foi suficientemente sensível para detectar 20 fg de DNA de M. leprae, o equivalente a quatro bacilos. Na análise da secreção nasal, o ensaio foi capaz de confirmar o diagnóstico em 89,7% dos casos multibacilares (MB), e 73,3% dos casos paucibacilares (PB). A sensibilidade foi de 100% na analise de biópsias de pacientes MB. O número de bacilos detectados nas amostras de secreção nasal de pacientes com hanseníase se manteve no intervalo de 1,39 x 103 a 8,02 x 105 bacilos, enquanto a detecção em biópsia de pacientes MB variou de 1,87 x103 a 1,50 x 106. A PCR em tempo real é mais sensível do que a PCR convencional e pode ser utilizada como uma ferramenta complementar para o diagnóstico clínico e histopatológico da hanseníase.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Encefalite causada por Toxoplasma gondii e a causa mais frequente de lesao em Sistema Nervoso Central no paciente com sindrome da imunodefiCiência adquirida (aids) (LUFT et ai, 1992). Toxoplasma pode infectar qualquer celula cerebral. Portanto, a clinica da neurotoxoplasmose (NT) nao e especifica e pode incluir sinais e sintomas focais ou nao de disfuncao do sistema nervoso central. A apresentacao clinica varia de uma apresentacao insidiosa, que envolve semanas, a um estado confusional agudo ou mesmo fulminante. A toxoplasmose ocorre em estagios avancados da doenca e a ausencia de anticorpos anti-toxoplasma pelo metodo da imunotluorescencia nao exclui o diagnostico (PORTER et ai, 1992). O tratamento geralmente e baseado no diagnostico presuntivo e a terapia padrao e a combinacao de sulfadiazina, pirimetamina e leucovorim (LUFT et al, 1992). Apos o inicio da terapia especifica, a resposta clinica e radiologica e utilizada como confirmacao diagnostica. Ha uma grande dificuldade de metodos diagnosticos acurados para confirmacao dos casos. O objetivo do presente estudo e apresentar um metodo para deteccao do DNA de T.gondii por PCR-Multiplex em tempo real. Resultados: Entre as 51 amostras de liquores colhidos, obtivemos uma sensibilidade de 68,8 por cento, especificidade de 100 por cento, valor preditivo positivo de 100 por cento e um valor preditivo negativo de 87,8 por cento. Conclusao: O PCR em tempo real em LCR apresentou uma elevada especificidade e sensibilidade em pacientes com suspeita de toxoplasmose cerebral. Sendo um metodo pouco invasivo, poderia ser incluido no algoritmo diagnostico em pacientes com sida com lesao em SNC / Toxoplasmosis Encephalitis (TE) is the main cause of focal disease in Central Nervous System in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) (LUFT et al, 1992). Toxoplasma can infect any brain cell. However, the clinical signs aren’t specific and present or not signs and focal symptoms of central nervous system dysfunction. Clinical presentation varies from insidiousis forms to an acute mental status change or to a fulminant form. Toxoplasmosis occurs in advanced stages of human immunodeficiency virus infection, and the absence of antitoxoplasma antibodies on immunofluorescence assay does not exclude the diagnosis (PORTER et al, 1992). Treatment is often based in presumptive diagnosis and the standard treatment is the combination of pyrimethamine plus sulfadiazine plus folinic acid (LUFT et al, 1992). After the beginning of the specific therapy, the clinic and radiologic response is the way to confirm the diagnosis. However, there is a great difficult in diagnosis method to confirm the cases. In this study, we‘ve aim to present a method to detect T.gondii DNA by Real-Time polymerase chain reaction (PCR) Multiplex. Results: Among 51 cerebrospinal fluid samples, we had 68,8% of sensibility, 100% of specificity, 100% of positive predictive value and 87,8% of negative predictive value. Conclusions: The real time PCR in LCR presented a high specificity and sensibility in patients under suspicion of encephalitis toxoplasmosis. Being a less invasive method, we could include it in the algorithmic diagnosis in HIV-infected patients with CNS focal lesion. / CNPq: 132682/2004 -4 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10760.pdf: 1064252 bytes, checksum: 004a25425d1ff48cb7008d70c5c93c7e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As técnicas mais utilizadas no diagnóstico laboratorial de rotina para tuberculose pulmonar (TBP) apresentam sensibilidade variável. Diversos testes de amplificação de ácidos nucléicos têm sido propostos para o diagnóstico rápido da tuberculose pulmonar em associação com a pesquisa de BAAR, cultura e o diagnóstico clínico. Neste estudo avaliamos o desempenho de um teste in house de PCR colorimétrico utilizando a seqüência IS6110 em amostras de escarro, lavado brônquio alveolar e aspirado traqueal de 150 pacientes internados com suspeita clínica de TBP em um Hospital Geral Universitário no período de março a dezembro de 2005. Foi realizada a PCR colorimétrica em amostras não processadas (ANP) e em sedimentos. A validade do teste foi estimada em comparação com a baciloscopia, cultura e diagnóstico clínico de TBP. A sensibilidade do teste in house PCR colorimétrico foi de 41,93% (ANP) e 48,38% (sedimento) e a especificidade de 98,21% (ANP) e 97,67% (sedimento) em comparação com a cultura. O teste in house PCR colorimétrico teve uma boa concordância, kappa = 0,6, em comparação com a baciloscopia e kappa = 0,5 quando comparado à cultura. Com respeito ao diagnóstico clínico a sensibilidade foi de 28,6% (ANP e sedimento) e a especificidade de 98,2% (ANP) e 97,3% (sedimento) Os valores preditivos positivo e negativo obtidos foram de 83,3% e 81,1% para ANP e de 76,9% e 81,2% para sedimento, respectivamente. O teste in house de PCR colorimétrico apresentou baixa sensibilidade, mas demonstrou ser altamente específico para o diagnóstico de TBP, além de apresentar boa concordância com os demais métodos utilizados na rotina laboratorial em um Hospital Geral Universitário para o diagnóstico de TBP. Em relação ao diagnóstico clínico observamos alto valor preditivo (positivo e negativo) e alta probabilidade positiva pós-teste. / The techniques most widely used in the routine laboratory diagnosis of pulmonary tuberculosis (PTB) show variable sensitivities. Various nucleic acids amplification tests have been proposed for the rapid diagnosis of PTB in association with the acid-fast bacillus staining, culture and clinical diagnosis. We evaluated the performance of an in-house colorimetric PCR test using the IS6110 sequence in samples of sputum, broncho-alveolar lavage and tracheal aspirate from 150 patients with clinical suspicion of PTB admitted to a General University Hospital in the period from March to December 2005. The colorimetric PCR test was applied to non-processed samples (NPS) and to the sediment. The validity of the test was estimated in comparison with culture and clinical diagnosis of PTB. The sensitivity of the in house colorimetric PCR test was 41.93% (NPS) and 48.38% (sediment) and specificity 98.21% (NPS) and 97.67% (sediment). The in house colorimetric PCR test had a good agreement, kappa = 0.6, in comparison to the acid-fast staining and kappa = 0.5 when compared to culture. Considering the clinical diagnosis, sensitivity was 28.6% (NPS and sediment) and specificity 98.2% (NPS) and 97.3% (sediment). The positive and negative predictive values were 83.3% and 81.1% for NPS and 76.9% and 81.2% for sediment, respectively. The in house colorimetric PCR test showed low sensitivity, high specificity and good agreement compared with acid-fast bacillus staining and culture used for diagnosis of PTB in a routine microbiology laboratory at a General University Hospital The test also showed high predictive values (positive and negative) and high positive post-test probability when the clinical diagnosis was considered. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações