Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-13T17:19:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Ivonete Queiroz.pdf: 1073414 bytes, checksum: af4071808ba3af365237d21558158bf4 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-28T12:19:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Ivonete Queiroz.pdf: 1073414 bytes, checksum: af4071808ba3af365237d21558158bf4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T12:19:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Ivonete Queiroz.pdf: 1073414 bytes, checksum: af4071808ba3af365237d21558158bf4 (MD5) / CAPES / A hanseníase é uma doença infectocontagiosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae, caracterizada por lesões na pele e ampla apresentação clínica, a qual depende principalmente da resposta imunológica do hospedeiro frente à infecção pelo Mycobacterium leprae. Esta infecção está distribuída mundialmente persistindo como grave problema de saúde pública no Brasil. As incapacidades e deformidades duradouras decorrentes dos quadros reacionais podem ocorrer antes, durante ou após a instituição do tratamento específico. Os episódios reacionais inflamatórios são decorrentes da exacerbação abrupta da resposta imune mediada por célula contra antígenos do M. leprae. O episódio reacional tipo 1 ou reação reversa é uma ocorrência inflamatória aguda que acomete a pele e nervos periféricos, sendo causa comum de incapacidade física. A reação tipo 2 ou eritema nodoso hansênico acomete somente pacientes virchowianos (LL) e borderline-virchowianos (BL) com presença de muitos bacilos e pouca ou nenhuma imunidade celular ao M. leprae. O objetivo principal deste estudo foi avaliar a moléculas MARCO Scavenger, Receptor peptídeo formil 1(FPR1) e Receptor peptídeo N-formil 2 (FPR2) em monócitos de pacientes com hanseníase em associação ao desenvolvimento de reações hansênicas, para alcançar este objetivo células mononucleares do sangue periférico foram obtidas de pacientes com diferentes formas clínicas da hanseníase. A marcação de superfície celular foi realizada por citometria de fluxo e os dados analisados com FlowJo em 35 pacientes com hanseníase, divididos em 19 paucibacilar e 16 multibacilar. Os nossos resultados mostraram que os pacientes com a forma paucibacilar apresentam a frequência de monócitos intermediários aumentada. Não houve diferença estatística na média de intensidade de fluorescência (MFI) de CD80, CD86 e MHC II entre monócitos de pacientes com a forma paucibacilar e multibacilar da hanseníase. No entanto, monócitos intermediários de pacientes com a forma multibacilar apresentaram média de intensidade de fluorescência maior em CD86 e MCHII. Os nossos dados sugerem que o receptor FPR1 pode ter um papel relevante para detecção na amplificação da resposta inflamatória de indivíduos com hanseníase quando comparado com as outras moléculas aplicadas neste estudo. / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, characterized by skin lesions and extensive clinical presentation which depends mainly on the immune front of the host response to infection by Mycobacterium leprae. This infection is distributed worldwide persist as a serious public health problem in Brazil. Disability and lasting deformities resulting from reaction symptoms can occur before, during or after the institution of specific treatment. Reactional inflammatory episodes are due to the abrupt exacerbation of immune cell-mediated response against M. leprae antigens. The episode reaction type 1 or reverse reaction is an acute inflammatory occurrence that affects the skin and peripheral nerves, and common cause of disability. Reaction type 2 or ENL only affects lepromatous patients (LL) and borderline-lepromatous (BL) with the presence of many bacilli and little or no cellular immunity to M. leprae. To assess the association of biomarkers MARCO Scavenger, Formyl peptide receptor (FPR1) and N-formyl peptide receptor 2 (FPR2) in monocytes of patients with leprosy associated with the development of leprosy reactions, mononuclear cells from peripheral blood were obtained from patients with different clinical forms of leprosy. To achieve this goal peripheral blood mononuclear cells were obtained from patients with different clinical forms of leprosy. The cell surface stain was performed by flow cytometry and the data analyzed with FlowJo in 35 patients with leprosy, divided into 19 paucibacillary and 16 multibacillary patients. Our results showed that patients with the paucibacillary form exhibit increased monocyte frequency. There was no statistical difference in the mean fluorescence intensity (MFI) of CD80, CD86 and MHC II between monocytes of paucibacillary and multibacillary leprosy patients. However, intermediate monocytes from patients with the multibacillary form had higher mean fluorescence intensity in CD86 and MCHII. Our data suggest that the FPR1 receptor may play a relevant role in detecting the amplification of the inflammatory response of individuals with leprosy when compared with the other molecules applied in this study.

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes