Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol / Coorientador : Prof. Dr. Marcelo Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 22/10/2010 / Inclui referências : f.76-84 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: O crescente aumento das culturas de sementes transgênicas e do comercio de produtos que contenham derivados dos mesmos foi constatado ao longo dos anos. Este fator levou a consolidação das indústrias de produtoras de sementes geneticamente modificadas no mundo. Atualmente, observa-se uma manifestação de interesses antagônicos envolvendo a comercialização destes produtos em relação aos produtos sem traços de transgenia. A dicotomia entre o risco avaliado e a percepção dos riscos dos transgênicos define o seu nível de aceitação entre as diferentes sociedades globais. Uma planta geneticamente modificada (PGM) é um organismo vivo que possui suas características genéticas alteradas de maneira não natural, ou seja, cuja composição gênica foi alterada por meio de processo de engenharia genética. Este é conhecido como um evento de transformação e tem sido amplamente aplicado às commodities agrícolas. Assim, a soja Roundup Ready ™ (RR™), evento GTS 40-3-2, tornou-se a cultura predominante de sementes transgênicas no mundo. Esta variedade foi desenvolvida para conferir à soja tolerância ao herbicida a base do princípio ativo glifosato, da marca comercial Roundup Ready™, desenvolvido e patenteado pela Monsanto Company. Questões relativas à detecção e a rastreabilidade dos OGMs auferiram um grande interesse mundial, devido à difusão global crescente e por suas implicações sócio-econômicas e na saúde da população. Além disso, com a utilização excessiva de transgênicos na produção de alimentos, foram estabelecidos regulamentos de rotulagem, produção, comercialização e destinação em diversos países para proteger os direitos dos consumidores e produtores. Além da busca pela regulamentação, as questões de interesse do consumidor resultaram no desenvolvimento de diferentes métodos para detectar e?ou quantificar alimentos derivados de culturas geneticamente modificadas e de suas matérias-primas. O presente trabalho pretendeu estabelecer uma metodologia que poderia ser aplicada como padrão qualitativo às sementes e grãos de soja comercializados no Brasil, em acordo com a normatização do País e com as comunidades estrangeiras. Foram utilizados dois métodos de extração para identificar as melhores qualidades de DNA extraídos de grãos e sementes de soja. O método de Brometo de Hexadecil Trimetil Amônio (CTAB) demonstrou os melhores resultados na extração do DNA genômico das amostras. A técnica de PCR padronizada para verificação de pureza varietal foi capaz de detectar a presença de quantidades conhecidas de soja RR™ em misturas intencionais de sementes OGMs em quantidades conhecidas de sementes convencionais. A sensibilidade da metodologia mostra que o método é confiável e facilmente reprodutível desde que os padrões pré-estabelecidos sejam seguidos. Baseado neste estudo, o método poderá ser ajustado para a identificação de OGMs em outras matérias-primas alimentícias e, também, para alimentos processados. Palavras-chave: Soja Roundup Ready™. Reação de Polimerização em Cadeia. Certificação e Detecção de Sementes e Grãos Geneticamente Modificados. / Abstract: The strong increase in genetic modified seed production verified over the years led to a consolidation of the transgenic seed industries worldwide. Currently, expressive antagonic issues have risen regarding the trade of these products in relation to the products without any transgenic trace. The dichotomy between the evaluated risk and the perceived risk of transgenic use has defined their level of acceptability among the different global societies. A Genetically Modified Plant (PMO) is a living organism whose genetic composition has been altered by means of genetics technology. This process is referred to as the transformation event and has been widely applied to agricultural commodities. Thus, the Roundup Ready™ (RR™), soy event GTS 40-3-2, developed by Monsanto Company has become the most prevalent transgenic crop in the world. This variety was developed to confer inplant tolerance to gliphosate-based agricultural herbicide Roundup Ready™. With the widespread use of GMOs in food production, labeling regulations have been established in some countries to protect the right of consumers and producers. Further than regulatory demand, consumer concern issues have resulted in the development of several methods to detect and quantify foods derived from genetically engineered crops and their raw materials. Polymerase Chain Reaction has proved to be the method of choice to detect the presence or absence of the introduced genes of GMOs at the DNA level. In this study, it was utilized two methods of DNA extraction for identifying the best quality of DNA of the samples. The Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) has showed to be the best method for the DNA extraction of the samples. The present paper aimed to verify if the PCR technique can detect RR™ soybean seeds among conventional seeds. The results showed that this method could be applied with high sensibility in order to certificate conventional soybean seeds. Keys words: Roundup Ready™ soybean. Polymerase Chain Reaction. Certification. Certification and Detection of Genetically Modified Seeds and Grains.

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Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 30/01/2015 / Inclui referências : f.101-137 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: A Doença de Chagas é uma enfermidade causada por Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que afeta milhões de pessoas na América Latina. No diagnóstico da doença, testes sorológicos, detecção direta do parasito ou PCR convencional são usados como testes confirmatórios. Porém, estes métodos apresentam restrições quanto à sensibilidade e especificidade. Além disso, microepidemias associadas a alimentos vem demonstrando a importância crescente na via de transmissão oral, a partir do ciclo silvestre. Assim, padronizar metodologias com melhor sensibilidade e especificidade, para detectar o parasito em humanos e em alimentos é necessária. O objetivo desse trabalho foi padronizar a técnica de Real Time PCR para avaliar pacientes chagásicos crônicos e contatos, assim como detectar T. cruzi em alimentos, favorecendo a implantação dessa metodologia em laboratórios, bancos de sangue e como ferramenta no monitoramento do parasito em sangue e alimentos. Para tal, foram desenhados seis iniciadores (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R e Bp4F/Bp4R) usando as sequências das cepas referência de T. cruzi y152 e Esmeraldo obtidas no genebank. Além destes, primers conhecidos e validados pela literatura foram também incluídos a título de comparação (TCZ1/TCZ2 e S35/S36). Para a otimização da técnica (concentração de primers e de DNA e CT de amplificação), foram usadas cepas de T. cruzi, T. rangeli e de Leishmania sp. Após a padronização a melhor especificidade analítica foi observada para o primer Bp1F/Bp1R (detectou apenas T. cruzi). O primer Ep1F/Ep1R permitiu detectar 0,0001 ng/?L do parasito e para TCZ1/TCZ2 a detecção mínima foi de 0,00001 ng/?L de DNA do parasito pela análise da curva padrão. Para validar a metodologia padronizada foram avaliadas 66 amostras de pacientes com doença de Chagas de regiões endêmicas (Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul), 11 amostras de indivíduos com relação de parentesco com os pacientes (contatos), e 30 indivíduos que não possuíam nenhum histórico ou diagnóstico para presença do parasito. Essas amostras foram submetidas à técnica de Real Time PCR aqui padronizada com os primers TCZ1/TCZ2 e Ep1F/Ep1R. A análise da curva ROC usando os primers TCZ1/TCZ2 mostrou uma sensibilidade de 79,2% e especificidade 69,8% (AUC = 69,2%). Para os primers Ep1F/Ep1R a sensibilidade foi 71,7% e especificidade 76,7% (AUC = 77,4%). O teste de McNemar demonstrou que ambos os iniciadores apresentaram maior discordância de resultados com a reação de imunofluorescência (RIFI) em pacientes chagásicos. Em indivíduos contatos o primer Ep1F/Ep1R apresentou maior discordância com a RIFI e ensaio imunoenzimático (ELISA). TCZ1/TCZ2 não apresentou discordância relevante. Ep1F/Ep1R demonstrou maior positividade (72,72%) para esse grupo. Portanto, o primer Ep1F/Ep1R assumiu melhor desempenho quanto à especificidade na determinação de T. cruzi em amostras de sangue que TCZ1/TCZ2. Em amostras de açaí, quando avaliado o açaí in natura (sem tratamento prévio) foi obtido 33% de sensibilidade para cepa de T. cruzi isolada de humanos (HC27) e 76% para a cepa isolada de Panstrongylus megistus (CUR98). Para amostras de açaí autoclavada verificou-se 71% de resultados positivos para ambas as cepas referidas acima. Além disso, em amostras contaminadas artificialmente com T. cruzi (cepa HC27) o limite de detecção foi de 0,75 parasito (p)/mL e com a cepa CUR98 a detecção mínima foi de 0,000019 p/mL. Dentre os primers desenhados Ep1F/Ep1R apresentou bons resultados na determinação de T. cruzi em sangue e açaí, o que encoraja a utilização da técnica de Real Time PCR para o monitoramento de amostras de açaí. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Sangue. Açaí. Primers. Sensibilidade. Especificidade. / Abstract: Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909, and affects millions of people in Latin America. Diagnostic tests to confirm the disease include indirect tests (antibody in serum), direct detection of the parasite in blood and conventional PCR (DNA detection). However, these methods have limitations because the serological tests detect antibodies and not the parasite, or have low sensitivity (e.g., the parasite is in the internal organs or the chronic phase). In addition, microepidemics associated with foods have shifted the emphasis to the oral route of transmission during the silvatic cycle. Therefore, standardized methodologies with improved sensitivity and specificity are needed to detect the parasite in blood and foods. The aim of this study was to standardize the real-time PCR technique for assessing chronic Chagas patients and contacted individuals, as well as for detecting T. cruzi in foods. To accomplish these objectives, six primers were improved (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R and Bp4F/Bp4R) using the sequences of references strains (T. cruzi y152 and Emerald) obtained from GenBank. Known primers validated in the literature were also included (TCZ1/TCZ2 and S35/S36). Trypanosoma cruzi, T. rangeli and Leishmania sp. strains were employed for optimization (concentration of primers, DNA and CT amplification). The best analytical specificity was observed for the Bp1F/Bp1R primer. The Ep1F/Ep1R primer had minimum detection of 0.0001 ng/?L, while TCZ1/TCZ2 had minimum detection of 0.00001 ng/?L of DNA from the parasite, based on an analysis of the standard curve. To validate the standardized methodology, 66 samples from chronic patients in endemic regions (Paraná, São Paulo and Rio Grande do Sul) were assessed, along with 11 samples from patients' relatives (contacts) and 30 individuals with no history or diagnosis for the presence of the parasite. The samples were submitted to the standardized real-time PCR technique with the TCZ1/TCZ2 and Ep1F/Ep1R primers. On analysis of the ROC curve, Ep1F/Ep1R had 71.7% sensitivity and 76.7% specificity (AUC = 77.4%), while TCZ1/TCZ2 exhibited 79.2% sensitivity and 69.8% specificity (AUC = 69.2%). McNemar's test showed that both primers had greater discordance in their results with the immunofluorescence reaction (IFR) in Chagas patients. Ep1F/Ep1R performed better than the TCZ1/TCZ2 primer, in terms of specificity for the determination of T. cruzi in blood samples. In açaí samples, an assessment of açai in natura (without previous treatment) revealed 33% sensitivity for the T. cruzi when HC27 strain isolated from humans was used and 76% for the CUR98 strain isolated from Panstrongylus megistus. In autoclaved açai samples, 71% positivity was detected for both strains. In addition, for artificially samples infected with HC27 strain, the limit of detection was 0.75 parasites (p)/mL, whereas the minimum detection for the CUR98 strain was 0.000019 p/mL. Ep1F/Ep1R showed good results in determining T. cruzi in blood and açai, favoring the use of the real-time PCR technique for screening blood and açai samples. Key-words: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Blood. Açaí. Primers. Sensitivity. Specificity.

Orientador : Prof. Dr. Antonio F. P. de F. Wouk / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa: Curitiba, 24/03/2009 / Inclui referências ao final de cada capítulo / Área de concentração : Patologia veterinária / Resumo: Os micoplasmas hemotrópicos são bactérias gram negativas, em forma de cocos, anéis ou bacilos, que parasitam eritrócitos de uma grande variedade de mamíferos, entre eles os cães. A hemoplasmose nos cães é geralmente um achado laboratorial. Raramente cães sem comprometimento imunológico ou não esplenectomizados desenvolvem a infecção. Os sinais da doença incluem febre, anorexia, mucosas pálidas e a anemia, quando presente, é discreta a moderada. A hemoplasmose nos cães é causada pelas bactérias Mycoplasma haemocanis (Mhc) e "Candidatus Mycoplasma haematoparvum" (CMhp). A transmissão ocorre pelo repasto do carrapato Rhipicephalus sanguineus, transfusão sanguínea, transmissão vertical de cadela para filhotes foi reportada, porém não há certeza se é transmitido por via placentária ou no momento do parto. O diagnóstico é feito pela visualização do agente infeccioso sobre a membrana eritrocitária ao exame do esfregaço sanguíneo, sem identificação da espécie de micoplasma. O diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR) é considerado padrão ouro por ter maior sensibilidade e especificidade que a citologia. O PCR para hemoplasmas é feito com a amplificação dos genes 16SrRNA e rnpB. O sequenciamento destes genes permite a identificação entre as espécies de hemoplasmas caninos e felinos. Foram realizados testes em 99 amostras de sangue de cães provenientes de um laboratório comercial da cidade de Curitiba. Foi realizada a extração do DNA e PCR para os genes GAPDH, gene constitutivos que garantem a qualidade de extração, 16SrRNA para Mycoplasma haemofelis (Mhf) "Candidatus Mycoplasma haemominutum" (CMhm) e "Candidatus Mycoplasma turicensis" (CMtc). Das 94 amostras positivas para o GAPDH, 16 (17,02%) geraram amplicons para pelo menos uma das três espécies testadas, nenhuma amostra apresentou co-infecção com mais de uma espécie. Do total de amostras, 9/94 (9,57%) foram positivos para Mhc, 4/94 (4,26%) para CMhp e 3/94 (3,19%) para CMTC, num total de 16 amostras positivas. Destas, 13 pertenciam ao grupo de 64 anêmicos (20,31%) e as outras 3 ao grupo de 30 não anêmicos (10,0%), com o dobro de risco de animais anêmicos possuírem a infecção. Um total de 10/46 (21,74%) machos foram positivos e 6/48 (12,5%) fêmeas foram positivas para hemoplasmas, indicando maior probabilidade de machos serem positivos. Um total de 2/18 animais com até 12 meses (11,12%) foram positivos, e 14/76 com mais de 12 meses (18,42%) foram positivos, mostrando maiores chances de cães com mais de 12 meses serem positivos. Não houve diferença significativa entre as idades dos animais positivos e negativos, e entre os hematócritos dos cães anêmicos e cães não anêmicos. Porém houve diferença significativa entre a presença de hemoplasmas e anemia, indicando que os hemoplasmas podem causar anemia em cães. Relata-se pela primeira vez a presença de "Candidatus Mycoplasma turicensis" em cães em Curitiba, Brasil. Palavras-chave: Cão, micoplasmas hemotrópicos, PCR, anemia / Abstract: Hemotropic mycoplasmas are gram negative, coccoid, ring or rod shaped bacteria,which parasite erythrocytes of a wide variety of mammals, including dogs. Hemoplasmosis in dogs is often a laboratory finding. Dogs without immunological restrain or non-splenectomized rarely develop the infection. Signs of disease include fever, anorexia, pale mucous membranes and anemia, when present, is mild to moderate. Hemoplasmosis in dogs is caused by bacteria Mycoplasma haemocanis (Mhc) and "Candidatus Mycoplasma haematoparvum" (CMhp). Transmission occurs by Rhipicephalus sanguineus tick feeding, blood transfusion, vertical transmission from bitch to offspring has been reported, however transplacental or at birth transmission has not been elucidated yet. Diagnosis is made by visualization of infectious agent on the erythrocyte membrane over blood smear examination, with no species identification. Diagnosis of polymerase chain reaction (PCR) is considered the gold standard due to higher sensitivity and specificity than cytology. Hemoplasma PCR is performed by 16SrRNA and rnpB gene amplification. Sequencing of these genes may allow to species identification between canine and feline hemoplasmas. A total of 99 samples were tested in dogs from a commercial laboratory in Curitiba, Brazil. DNA extraction and PCR for GAPDH housekeeping gene, which insures quality control of extraction, 16SrRNA for Mycoplasma haemofelis (Mhf) "Candidatus Mycoplasma haemominutum" (CMhm) and "Candidatus Mycoplasma turicensis" (CMtc). Out of 94 positive samples for GAPDH, 16/94 (17.02%) produced amplicons of at least one of three tested species, and no sample presented co-infection with more than one species. A total of 9/94 (9.57%) were positive for Mhc, 4/94 (4.26%) for CMhp and 3/94 (3.19%) for CMtc. Out of 16 positive samples, 13 were from the 64 anemic group (20.31%) and other 3 were from the 30 non-anemic group (10.0%), showing a double likelihood of anemic dogs to have the infection. A total of 10/46 dogs (21.74%) were positive, and 6/48 (12.5%) were positive for hemoplasmas, showing higher chances of males to be positive. According to age, 2/18 animals younger than 12 months of age (11.12%) were positives and 14/76 older than 12 months (18.42%) were positive, showing higher chances of older dogs to be positive. No significant differences were found between ages and positive/negative animals, and between packed cell volume of anemic and non-anemic dogs. However a significant difference was found between presence of hemoplasma and anemia, showing that hemoplasmas may cause anemia in dogs. "Candidatus Mycoplasma turicensis" has been reported for the first time infecting dogs in Curitiba, Brazil. Palavras-chave: dog, hemotropic hemoplasma, PCR, anemia

Ehrlichia canis e Anaplasma platys são parasitas de células sanguíneas transmitidos por carrapatos de larga distribuição mundial. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de E. canis e A. platys em cães naturalmente infectados no município de Porto Alegre, RS, Brasil, através de técnicas sorológicas e moleculares; realizar análise molecular dos agentes através do sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA e compará-lo com sequências disponíveis no Genbank. Adicionalmente, avaliamos os parâmetros hematológicos e possíveis fatores de risco associados à infecção. Amostras de sangue foram coletadas de 146 cães residentes no Bairro Arquipélago, região suburbana de Porto Alegre e 53 cães mantidos no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ). Dentre os animais analisados, 27 (13,56%) apresentaram resultado positivo na nPCR e 20 (10,2%) apresentaram sorologia positiva para A. platys. Através da ferramenta BLASTn, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas e mostraram similaridade de 99,75% a 100% em relação a outras sequências de A. platys disponíveis no Genbank. Neste estudo não foi observada a presença de E. canis. DNA do agente não foi amplificado em nenhuma das amostras analisadas através de técnicas moleculares, e tampouco foram detectados cães sororreagentes, indicando a baixa prevalência do agente no município. Ao comparar a prevalência de infecção/exposição entre as populações estudadas, não observamos diferença significativa entre elas. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros hematológicos e fatores de risco analisados nos animais infectados ou expostos, exceto a contagem de basófilos, que foi associada positivamente com infecção por A. platys. / Erlichia canis and Anaplasma platys are tick borne disease which has a worldwide geographic distribution. The aim of this study was to detect the presence of E. canis and A. platys in naturally infected dogs in Porto Alegre/RS – Brazil by serological and molecular techniques, performing molecular analysis of the agents by sequencing of a fragment of the 16S rRNA and comparing it with sequences available in Genbank. Additionally, we evaluated the hematological parameters and potential risk factors associated with infection. Blood samples were collected from 146 dogs living in the Arquipelago neighborhood, a suburban area of Porto Alegre and 53 dogs from Control Centrer of Zoonosis (CCZ). Among the examined animals, 27 (13.56%) were positive by nPCR and 20 (10.2%) were seropositive for A. platys. Through the BLASTn, the sequences obtained in this study were compared and showed similarity of 99.75% to 100% as compared to other sequences of A. platys available in Genbank. None of the dogs showed antibodies or E. canis DNA, indicating the low occurrence of the agent in Porto Alegre. There were no significant differences between positive groups and hematological parameters, or among the risk factors evaluated, except basophils count was associated with A. platys infection.

Ehrlichia canis e Anaplasma platys são parasitas de células sanguíneas transmitidos por carrapatos de larga distribuição mundial. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de E. canis e A. platys em cães naturalmente infectados no município de Porto Alegre, RS, Brasil, através de técnicas sorológicas e moleculares; realizar análise molecular dos agentes através do sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA e compará-lo com sequências disponíveis no Genbank. Adicionalmente, avaliamos os parâmetros hematológicos e possíveis fatores de risco associados à infecção. Amostras de sangue foram coletadas de 146 cães residentes no Bairro Arquipélago, região suburbana de Porto Alegre e 53 cães mantidos no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ). Dentre os animais analisados, 27 (13,56%) apresentaram resultado positivo na nPCR e 20 (10,2%) apresentaram sorologia positiva para A. platys. Através da ferramenta BLASTn, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas e mostraram similaridade de 99,75% a 100% em relação a outras sequências de A. platys disponíveis no Genbank. Neste estudo não foi observada a presença de E. canis. DNA do agente não foi amplificado em nenhuma das amostras analisadas através de técnicas moleculares, e tampouco foram detectados cães sororreagentes, indicando a baixa prevalência do agente no município. Ao comparar a prevalência de infecção/exposição entre as populações estudadas, não observamos diferença significativa entre elas. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros hematológicos e fatores de risco analisados nos animais infectados ou expostos, exceto a contagem de basófilos, que foi associada positivamente com infecção por A. platys. / Erlichia canis and Anaplasma platys are tick borne disease which has a worldwide geographic distribution. The aim of this study was to detect the presence of E. canis and A. platys in naturally infected dogs in Porto Alegre/RS – Brazil by serological and molecular techniques, performing molecular analysis of the agents by sequencing of a fragment of the 16S rRNA and comparing it with sequences available in Genbank. Additionally, we evaluated the hematological parameters and potential risk factors associated with infection. Blood samples were collected from 146 dogs living in the Arquipelago neighborhood, a suburban area of Porto Alegre and 53 dogs from Control Centrer of Zoonosis (CCZ). Among the examined animals, 27 (13.56%) were positive by nPCR and 20 (10.2%) were seropositive for A. platys. Through the BLASTn, the sequences obtained in this study were compared and showed similarity of 99.75% to 100% as compared to other sequences of A. platys available in Genbank. None of the dogs showed antibodies or E. canis DNA, indicating the low occurrence of the agent in Porto Alegre. There were no significant differences between positive groups and hematological parameters, or among the risk factors evaluated, except basophils count was associated with A. platys infection.

Ehrlichia canis e Anaplasma platys são parasitas de células sanguíneas transmitidos por carrapatos de larga distribuição mundial. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de E. canis e A. platys em cães naturalmente infectados no município de Porto Alegre, RS, Brasil, através de técnicas sorológicas e moleculares; realizar análise molecular dos agentes através do sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA e compará-lo com sequências disponíveis no Genbank. Adicionalmente, avaliamos os parâmetros hematológicos e possíveis fatores de risco associados à infecção. Amostras de sangue foram coletadas de 146 cães residentes no Bairro Arquipélago, região suburbana de Porto Alegre e 53 cães mantidos no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ). Dentre os animais analisados, 27 (13,56%) apresentaram resultado positivo na nPCR e 20 (10,2%) apresentaram sorologia positiva para A. platys. Através da ferramenta BLASTn, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas e mostraram similaridade de 99,75% a 100% em relação a outras sequências de A. platys disponíveis no Genbank. Neste estudo não foi observada a presença de E. canis. DNA do agente não foi amplificado em nenhuma das amostras analisadas através de técnicas moleculares, e tampouco foram detectados cães sororreagentes, indicando a baixa prevalência do agente no município. Ao comparar a prevalência de infecção/exposição entre as populações estudadas, não observamos diferença significativa entre elas. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros hematológicos e fatores de risco analisados nos animais infectados ou expostos, exceto a contagem de basófilos, que foi associada positivamente com infecção por A. platys. / Erlichia canis and Anaplasma platys are tick borne disease which has a worldwide geographic distribution. The aim of this study was to detect the presence of E. canis and A. platys in naturally infected dogs in Porto Alegre/RS – Brazil by serological and molecular techniques, performing molecular analysis of the agents by sequencing of a fragment of the 16S rRNA and comparing it with sequences available in Genbank. Additionally, we evaluated the hematological parameters and potential risk factors associated with infection. Blood samples were collected from 146 dogs living in the Arquipelago neighborhood, a suburban area of Porto Alegre and 53 dogs from Control Centrer of Zoonosis (CCZ). Among the examined animals, 27 (13.56%) were positive by nPCR and 20 (10.2%) were seropositive for A. platys. Through the BLASTn, the sequences obtained in this study were compared and showed similarity of 99.75% to 100% as compared to other sequences of A. platys available in Genbank. None of the dogs showed antibodies or E. canis DNA, indicating the low occurrence of the agent in Porto Alegre. There were no significant differences between positive groups and hematological parameters, or among the risk factors evaluated, except basophils count was associated with A. platys infection.

Rhodococcus equi (R.equi), uma bactéria gram-positiva intracelular facultativa, é uma causa importante de pneumonia em potros com idade entre 3 semanas e 5 meses. A manifestação clinica mais comum da doença é a broncopneumonia piogranulomatosa com abscedação. Na pneumonia causada por R. equi os primeiros sinais clínicos podem não ser aparentes até que as alterações patológicas estejam bastante avançadas, por esse motivo, o diagnóstico precoce e acurado de potros com pneumonia por R. equi se torna fundamental. O diagnóstico definitivo baseia-se na detecção de R. equi na cultura bacteriológica e identificação molecular a partir da amostra de lavado traqueal; no entanto, essa técnica é invasiva, traz riscos para o animal e é relativamente cara. A ultrassonografia (US) para detecção precoce tem se tornado uma pratica de rotina em muitas fazendas endêmicas para rodococose equina. Com o advento dessa prática de triagem, a forma mais identificada de pneumonia por R. equi tem sido a subclínica, onde os animais apresentam presença de alterações pulmonares mas não apresentam sinais clínicos da doença. Atualmente, vapA é o gene com função demonstrada na virulência. Identificação de R. equi por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de fezes tem se mostrado efetivo para o reconhecimento precoce do agente. Ultrassonografia torácica e PCR das amostras de fezes e swab nasal foram realizadas em 22 potros desde as 3 até as 16 semanas de idade (intervalos de 15 dias) de 3 fazendas endêmicas de criação de cavalos no sul do Brasil para identificar a ocorrência de doença subclínica. A associação entre a ultrassonografia torácica e PCR das amostras de fezes possibilitaram a detecção de doença subclínica e identificação de pontos críticos de controle dessa doença. Considerando o fato de que 95.4% dos potros apresentaram doença subclínica e que nenhum deles desenvolveu a doença clínica demonstra que o tratamento desses casos não é justificável para a população analisada. / Rhodococcus equi, a gram-positive facultative intracellular pathogen, is an important cause of pneumonia in foals between 3 weeks and 5 months of age. Pneumonia caused by R. equi is an insidious disease in which clinical signs may not be apparent until pathologic changes are well progressed. Because of the insidious progression of infection to severe clinical signs, early and accurate diagnosis of foals with R. equi pneumonia is important. Definitive diagnosis is based on R. equi detection by bacterial culture and molecular identification from tracheobronchial aspirate (TBA), this procedure is invasive, labor-intensive, requires skill, carries risks to foals, and is relatively expensive. The sequential thoracic ultrasonography (TUS) to early detection of the disease has been adopted as a screening method in many endemic farms; for this reason, subclinical disease has been the most frequently observed form. Nowadays, vapA is the only virulent gene identified. Fecal polymerase chain reaction (PCR) is a noninvasive technique with good diagnostic accuracy. Thoracic ultrasound screening (TUS) and PCR from fecal and nasal swab samples were performed in 22 foals from 3 to 16 weeks of age from 3 endemic farms at south of Brazil to identify the occurrence of R. equi subclinical disease. The association of TUS and fecal PCR detection of virulent R. equi provided a possibility of identification of critical points in disease control. Considering the fact that 95.4% of the foals showed evidence of subclinical disease and none of them developed any signs of clinical disease, the antibiotic treatment was not reasonable for the foals followed.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 157.pdf: 1283280 bytes, checksum: 5a67dedd4e379d7321d874f0d661ce18 (MD5) Previous issue date: 1998 / Durante os anos 50, houve uma epidemia de peste bubônica no Brasil. Em busca do reservatório, cerca de 60.000 roedores foram coletados, examinados e taxidermizados. Todos os animais foram arquivados no Museu Nacional do Rio de Janeiro. Como muitos roedores eram de áreas onde a leishmaniose e a peste eram concomitantes, decidimos investigar se esses animais poderiam ser reservatório de Leishmania. Examinamos um total de 20 animais de Baturité, Ceará, e 19 da Ilha Grande, Rio de Janeiro. Essas duas áreas foram escolhidas por terem história de leishmaniose epidemiologicamente bem estudada. Fragmentos de pele de 1mm3 foram coletados de orelha, cauda e pés de cada animal. Fragmentos de lesao cutânea, presente em três roedores, também foram coletados. O DNA genômico foi isolado, usando-se um kit para isolamento de DNA tecidual. Oligonucleotídeos que se associam à origem de replicaçao das duas fitas das moléculas de minicírculo foram usados em hot start PCR, amplificando a regiao conservada do minicírculo de kDNA. Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em gel de agarose corado pelo brometo de etídio e visualizados sob luz UV. Todos os produtos foram aplicados em membrana de nylon usando-se aparelho de dot blot e hibridizados com sonda de L. Braziliensis M2903 e L.amazonensis L575. Pela PCR, Leishmania amazonensis foi encontrada L575. Pela PCR, Leismania amazonensis foi encontrada na orelha de dois animais, um Oryzomys subflavus e um Thrichomys apereoides. A hibridaçao com sonda de L. braziliensis foi negativa em todos os casos. Ambos os roedores positivos eram de Baturité. A infecçao por L. amazonenesis é, primariamente, uma zoonose, e pode ser encontrada em grande variedade de hospedeiros entre animais silvestres, inclusive roedores, marsupiais e raposas. Indica a viabilidade de reconstruir a história das leishmanioses pela PCR, o que pode favorecer o entendimento dos eventos históricos que influenciaram a leishmaniose tegumentar americana no Brasil. / During the fifities there was an epidemics of plague in Brazil. Seeking for reservoirs, around 60000 rodents were colected, examined and taxidermized. All animals were stored in the archives of the Nacional Museum of Rio de Janeiro, Brazil. Since many of the rodents were from areas where leishmaniasis was concomitant, we decided to investigate if these animals would be a reservoir for Leishmania. We examined 20 animals from Baturité, Ceará, and 19 from Ilha Grande, Rio de Janeiro. These two areas were chosen because there had been a previous epidemiological study of leishmaniasis. Skin fragments of 1 mm3 from the ear, tail and foot from each animal were collected. In addition, a fragment from a cutaneous lesion, present in three of the animals, was also collected. Genomic DNA was isolated by using the QIAmp tissue kit. Oligonucleotides that anneal to the origin of replication of both strands of the minicircle molecules were used in a hot start PCR, amplifying the conserved region of the minicircle kDNA. The amplified products were analysed by agarose gel eletrophoresis, ethidium bromide staining, and were visualized under UV light. All products were applied to a nylon membrane using a dot-blot apparatus and hybridized with a preamplified product of L. braziliensis M2903 strain or L. amazonensis L575 as probe. Leishmania amazonensis was found by PCR in the ear of two animals, one Oryzomys subflavus and one Thrichomys apereoides. Hybridization with the L. braziliensis probe was negative in all cases. Both animals were from Baturité. L amazonensis infection is primarily a zoonosis, found in a wide range of hosts among wild animals, including rodents, marsupials and foxes. The results of this study indicate that it is likely to reconstruct the history of leishmaniasis by PCR and that it might be possible to understand the historical events that have influenced American leishmaniasis in Brazil.

Rhodococcus equi (R.equi), uma bactéria gram-positiva intracelular facultativa, é uma causa importante de pneumonia em potros com idade entre 3 semanas e 5 meses. A manifestação clinica mais comum da doença é a broncopneumonia piogranulomatosa com abscedação. Na pneumonia causada por R. equi os primeiros sinais clínicos podem não ser aparentes até que as alterações patológicas estejam bastante avançadas, por esse motivo, o diagnóstico precoce e acurado de potros com pneumonia por R. equi se torna fundamental. O diagnóstico definitivo baseia-se na detecção de R. equi na cultura bacteriológica e identificação molecular a partir da amostra de lavado traqueal; no entanto, essa técnica é invasiva, traz riscos para o animal e é relativamente cara. A ultrassonografia (US) para detecção precoce tem se tornado uma pratica de rotina em muitas fazendas endêmicas para rodococose equina. Com o advento dessa prática de triagem, a forma mais identificada de pneumonia por R. equi tem sido a subclínica, onde os animais apresentam presença de alterações pulmonares mas não apresentam sinais clínicos da doença. Atualmente, vapA é o gene com função demonstrada na virulência. Identificação de R. equi por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de fezes tem se mostrado efetivo para o reconhecimento precoce do agente. Ultrassonografia torácica e PCR das amostras de fezes e swab nasal foram realizadas em 22 potros desde as 3 até as 16 semanas de idade (intervalos de 15 dias) de 3 fazendas endêmicas de criação de cavalos no sul do Brasil para identificar a ocorrência de doença subclínica. A associação entre a ultrassonografia torácica e PCR das amostras de fezes possibilitaram a detecção de doença subclínica e identificação de pontos críticos de controle dessa doença. Considerando o fato de que 95.4% dos potros apresentaram doença subclínica e que nenhum deles desenvolveu a doença clínica demonstra que o tratamento desses casos não é justificável para a população analisada. / Rhodococcus equi, a gram-positive facultative intracellular pathogen, is an important cause of pneumonia in foals between 3 weeks and 5 months of age. Pneumonia caused by R. equi is an insidious disease in which clinical signs may not be apparent until pathologic changes are well progressed. Because of the insidious progression of infection to severe clinical signs, early and accurate diagnosis of foals with R. equi pneumonia is important. Definitive diagnosis is based on R. equi detection by bacterial culture and molecular identification from tracheobronchial aspirate (TBA), this procedure is invasive, labor-intensive, requires skill, carries risks to foals, and is relatively expensive. The sequential thoracic ultrasonography (TUS) to early detection of the disease has been adopted as a screening method in many endemic farms; for this reason, subclinical disease has been the most frequently observed form. Nowadays, vapA is the only virulent gene identified. Fecal polymerase chain reaction (PCR) is a noninvasive technique with good diagnostic accuracy. Thoracic ultrasound screening (TUS) and PCR from fecal and nasal swab samples were performed in 22 foals from 3 to 16 weeks of age from 3 endemic farms at south of Brazil to identify the occurrence of R. equi subclinical disease. The association of TUS and fecal PCR detection of virulent R. equi provided a possibility of identification of critical points in disease control. Considering the fact that 95.4% of the foals showed evidence of subclinical disease and none of them developed any signs of clinical disease, the antibiotic treatment was not reasonable for the foals followed.