Reatores enzimáticos com membrana (REM) combinam muitas das características desejáveis em um bioprocesso, tais como: reator de elevada produtividade, reprodutibilidade no tempo, fácil controle e automação, operação em regime contínuo, eficiente separação de biocatalisador, substratos e produtos, com a viabilidade do uso de enzimas sem necessidade de imobilização. Este estudo faz parte do desenvolvimento e otimização de um bioprocesso que utiliza um reator enzimático com membrana com a enzima invertase, que catalisa a hidrólise da sacarose produzindo uma mistura equimolar de glicose e frutose. Estudou-se a influência de algumas variáveis operacionais e de reação no comportamento do REM. Este reator consiste de um tanque agitado de 50 mL onde células de Saccharomyces cerevisiae, contendo a invertase, ficam retidas por meio de uma membrana (Øporo 0,45µm), disposta na parte inferior do sistema. A configuração deste é semelhante a um reator contínuo tipo tanque agitado (CSTR). Inicialmente, avaliou-se a influência das variáveis: concentração de sacarose e concentração de enzima, por meio de experimentos seriais, que possibilitaram fixar estas variáveis em níveis adequados, de 500 mM e 1 mg/mL, respectivamente, para a continuidade dos ensaios por meio de planejamentos experimentais fatoriais. Foi utilizado um planejamento experimental (23 + estrela) e a análise de superfície de resposta para avaliar a influência das variáveis: vazão de alimentação do substrato, temperatura e pH. Para a análise estatística dos resultados, utilizaram-se como respostas o grau de conversão da sacarose e a produtividade em frutose, determinadas em amostragens feitas durante o tempo de operação do reator, em média de 8 a 9 horas por condição avaliada. Dos resultados obtidos, mostraram-se significativos, com 95% de confiança, os efeitos lineares e quadráticos da vazão e temperatura. As condições ótimas encontradas foram: vazão de alimentação entre 0,4 e 1,0 mL/min e temperatura 51°C. O grau de conversão obtido foi de aproximadamente 95%, com as seguintes condições experimentais: concentração da suspensão de células de 1mg/mL, temperatura de 51°C, pH 5,5; concentrações de sacarose de 500 mM e vazão de alimentação de 1,0 mL/min. Para esta condição obteve-se uma produtividade da ordem de 0,6 mmol frutose/h.mg invertase. Os desvios entre os valores previstos pelo modelo estatístico e pelo modelo experimental foram da ordem de 3%. Em função dos resultados obtidos neste trabalho concluiu-se que esta concepção de reator é eficiente para a bioconversão da sacarose e, portanto, o processo contínuo com reator com membrana é promissor para o desenvolvimento de processos enzimáticos desta natureza. / Enzymatic membrane reactors combine several desirable characteristics in a bioprocess, such as high productivity, reproducibility, easy control and automation, continuous operation, efficient separation of biocatalyst, substrate and products, and the use of enzymes without immobilization. This work is part of the development and optimization of a bioprocess using an enzymatic reactor which utilizes a membrane reactor for the enzymatic hydrolysis of sucrose in a solution of fructose and glucose, containing the enzyme invertase. The influence of some operational and reaction variables on the performance of the membrane reactor was studied. The bioreactor consisted of a 50 mL-stirred tank where intact cells of Saccharomyces cerevisiae, containing invertase in the cell wall, are retained inside the reactor by a microfiltration membrane (Øpore 0.45µm). The flat sheet membrane is fixed at the bottom of the device. The reactor configuration is similar to a continuous stirred tank reactor (CSTR). Initially, the influence of sucrose and enzyme concentration was evaluated through a series of experiments in order to determine the suitable levels of these variables. Sucrose was set to 500 mM and enzyme set to 1 mg/mL. This allowed the work to continue by means of experimental factorial designs. It was utilized a 23 full experimental design followed by a 2nd order statistical design and, the surface response methodology in order to evaluate the influence of volume feeding rate of the substrate, temperature and pH on fructose productivity and sucrose conversion. The values were obtained during the reactor operation. The average operation time was trom 8 to 9 hours for all evaluated conditions. From the statistical analysis, it was concluded that the linear and quadratic effects of temperature and flow rate on the results were the most significant with 95% of confidence. The optimum conditions found for this bioprocess were volume feeding rate between 0.4 and 1.0 mL/min and temperature of 51°C. The degree of conversion of sucrose obtained experimentally was 95%, in the following experimental conditions: cell concentration of 1mg/mL, temperature of 51°C, pH 5.5; sucrose concentration of 500 mM and feeding rate of 1.0 mL/min. For this operational condition it was obtained a productivity of about 0.6 mmol fructose/h.mg invertase. The deviation between the predicted values by the statistical model and the experimental data was 3%. Based on the results obtained in this work, it can be concluded that this conception of bioreactor is efficient for the bioconversion of sucrose and, a continuous membrane reactor process is very promising for the development of this kind of enzymatic process.

Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert®, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 h-1, 35ºC e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado. / The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil\'s GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert®, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35ºC and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.

A conversão enzimática da sacarose pela ação sucessiva da invertase e da glicose oxidase (GOD), permite obter produtos de maior valor agregado, a saber, frutose e o ácido glicônico, dois produtos de amplo uso na indústria farmacêutica, alimentícia e química. Foi estudada a aplicação da invertase imobilizada em resinas aniônicas do tipo Dowex® (um copolímero de poliestireno-divinilbenzeno) sobre a hidrólise da sacarose bem como a oxidação da glicose pela glicose oxidase solúvel ou imobilizada no mesmo suporte em separado (sistema bifásico), utilizando-se um reator de membrana acoplado à membrana de ultrafiltração (100kDa) ou de microfiltração (5µm). Posteriormente, avaliou-se o desempenho de ambas as formas de enzimas, solúveis ou imobilizadas num sistema monofásico empregando o mesmo reator. A bioconversão executada em sistema bifásico permitiu a obtenção de xarope de frutose da ordem de 70% através da separação de glicose e frutose utilizando-se a resina catiônica 50W:8-100. O rendimento de 96,6% e 67,4% para as formas solúveis e imobilizadas respectivamente foram obtidas em sistema monofásico. O não desprendimento das enzimas dos suportes viabilizou o uso da membrana de microfiltração, trazendo vantagens à operação de biorreator com membrana. / The enzymatic conversion of sucrose through a successive action of invertase and glucose oxidase (GOO) allows the obtainment of products with higher commercial value, fructose and gluconic acid, which are widely used in pharmaceutical, food and chemical industries. Invertase and GOO immobilized on Dowex® anionic resin (a polystyrene divinylbenzene copolymer) as well as soluble GOD were used in a membrane bioreactor (MS) for sucrose hydrolysis and glucose oxidation. The MB was coupled with a UF-membrane (100kDa) or a MF-membrane (5µm). The bioconversion was conducted in two steps (biphasic system) as well as in one step (monophasic system). The bioconversion operated in a biphasic system permitted obtaining a fructose syrup with a concentration of about 70% through a separation of glucose and fructose using a cationic resin, 50W:8-100. As for the monophasic system, the yield of 96.6% and 67.4% for soluble and immobilized forms were attained respectively. No leakage of the enzymes from the support allowed the use of a microfiltration membrane, adding advantages to the membrane bioreactor operation.