Neste trabalho investigamos o efeito de doadores de H2S no prurido agudo mediado por PAR-2 em camundongos. A injeção i.d. do agonista PAR-2 SLIGRL-NH2, induziu prurido que não foi afetado pelo pré-tratamento com o antagonista H1 pirilamina. A coinjeção dos doadores de H2S GYY4137 (lento) ou NaHS (espontâneo) com SLIGRL-NH2 reduziu significativamente o prurido (P<0,05). A glibenclamida (bloqueador de canais KATP) e o SNP (doador de NO), mas não o ODQ (inibidor da sGC), evitaram estes efeitos. O antagonista TRPA1 HC-030031 reduziu significativamente o prurido induzido pelo SLIGRL-NH2 (P<0,05), mas o prurido induzido pelo agonista TPRA1 AITC não foi afetado por NaHS. Ensaios de Western blot mostraram que ambos PAR-2 e TRPA1 são expressos constitutivamente na pele de camundongos. Nossos dados mostram que o prurido secundário à ativação do PAR-2 pode ser reduzido por H2S, atuando via a abertura dos canais KATP e ativação da via NO-GMPc. Ademais, o receptor TRPA1 pode mediar o prurido induzido por SLIGRL-NH2, mas o H2S não interfere nesta via. / In this study we investigated the effect of H2S donors in PAR-2-mediated acute pruritus in mice. The i.d. injection of the PAR-2 agonist SLIGRL-NH2 induced itching that was unaffected by pre-treatment with the H1 antagonist pyrilamine. Co-injection of the H2S donors GYY4137 (slow) or NaHS (spontaneous) with SLIGRL-NH2 significantly reduced pruritis (P <0.05). Glibenclamide (a KATP channel blocker) and SNP (a NO donor), but not ODQ (a sGC inhibitor) prevented these effects. The TRPA1 antagonist HC-030031 significantly reduced SLIGRL-NH2-induced pruritus (P<0.05), but the pruritus induced by the TPRA1 agonist AITC was unaffected by NaHS. Western blot assays showed that both TRPA1 and PAR-2 are constitutively expressed in the mouse skin. Our data show that itching secondary to PAR-2 activation can be reduced by H2S which acts via the opening of KATP channels and activation of the NO-cGMP pathway. Furthermore, TRPA1 receptors may mediate SLIGRL-NH2-induced pruritus, however, H2S does not interfere with this pathway.

O receptor ativado por protease do tipo 2 (PAR2) está envolvido na patogênese de doenças inflamatórias crônicas, incluindo a periodontite. O PAR2 pode ser ativado pela gingipaína, produzida pela Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) e proteinase 3 (P3) do neutrófilo. A ativação do PAR2 desempenha um papel relevante nos processos inflamatórios ao induzir a liberação de importantes mediadores pró-inflamatórios associados à destruição periodontal. No presente estudo, o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico na expressão do PAR2 por células do fluido gengival, bem como a sua associação com os níveis de mediadores pró-inflamatórios e proteases ativadoras foram investigados em pacientes com periodontite. Além disso, avaliou-se in vitro o envolvimento da via de sinalização MAPK-p38 na ativação do PAR2 e a influência deste na produção de superóxido (O2-) e na capacidade de fagocitose em neutrófilos do sangue periférico humano infectados pela P. gingivalis. Um aumento significativo (P < 0,05) da expressão do RNAm e proteica do PAR2 por células do fluido gengival foi positivamente associado aos parâmetros clínicos inflamatórios e aos níveis de interleucina (IL)-6, IL-8, fator de necrose tumoral-, metaloproteinases da matriz (MMP)-2, MMP-8, fator de crescimento de hepatócitos e fator de crescimento endotelial vascular, avaliados por Bioplex. Níveis elevados de RNAm da gingipaína e P3, expressão reduzida do RNAm da dentilisina (P < 0,05), bem como redução significativa (P < 0,05) dos níveis de inibidores de protease secretados por leucócitos e elafina (avaliados por ELISA), também foram associados à superexpressão do PAR2. Sítios periodontalmente saudáveis de indivíduos com periodontite crônica apresentaram uma menor expressão do RNAm e proteica do PAR2 (P < 0,05). O tratamento periodontal resultou na diminuição significativa da expressão de PAR2 (P < 0,05), correlacionada com a diminuição da expressão de mediadores inflamatórios (P < 0,05), bem como com suas proteases ativadoras (P < 0,05). Além disso, o uso do antagonista do PAR2 suprimiu significativamente (P < 0,05) a produção de superóxido em neutrófilos do sangue periférico humano, denotando o papel do PAR2 nessa importante função celular. Dessa forma, concluímos que o tratamento periodontal, o qual resulta na diminuição dos níveis de proteases e mediadores pró-inflamatórios, está associado com uma diminuição da expressão do PAR2, portanto, sugerindo que a expressão de PAR2 é influenciada pela presença da infecção periodontal, e não uma característica constitutiva favorecendo a inflamação periodontal. / Protease-activated receptor-2 (PAR2) is implicated in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases including periodontitis; it can be activated by gingipain, produced by Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), and by neutrophil-protease 3 (P3). PAR2 activation plays a relevant role in inflammatory processes by inducing the release of important inflammatory mediators associated with periodontal breakdown. In the present study, the effect of non-surgical periodontal treatment on PAR2 expression and its association with levels of pro-inflammatory mediators, and activating proteases were investigated in chronic periodontitis patients. Moreover it was evaluated in vitro the role of MAPK-p38 signaling pathway during PAR2 activation and its influence on superoxide production and phagocytosis capacity in peripheral human neutrophils infected with P. gingivalis. A significant mRNA and protein over-expression of PAR2 (P < 0.05) in gingival crevicular fluid cells was positively associated to inflammatory clinical parameters, and to the levels of interleukin (IL)-6, IL-8, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteases (MMP)-2, MMP-8, hepatocyte growth factor, and vascular endothelial growth factor (evaluated by Bioplex). Elevated levels of gingipain and P3 (P < 0.05), and decreased levels of dentilisin mRNA, and protease inhibitors, secretory leucocyte protease inhibitor and elafina (P < 0.05) (evaluated by ELISA), were also associated to PAR2 overexpression. Periodontally healthy sites from chronic periodontitis individuals showed a diminished expression of PAR2 mRNA and PAR2 protein level (P < 0.05). Furthermore, periodontal treatment resulted in decreased PAR2 expression (P < 0.05), correlated with decreased expression of inflammatory mediators (P < 0.05) and activating proteases (P < 0.05). Moreover, PAR2 antagonist reduced significantly superoxide production in human neutrophils (P < 0.05) showing the role of PAR2 on this important cellular function. We concluded that periodontal treatment resulted on decreased levels of proteases, and pro-inflammatory mediators is associated to decreased PAR2 expression, therefore suggesting that PAR2 expression is influenced by the presence of periodontal infection, and not a constitutive characteristic favoring periodontal inflammation.

Neste trabalho investigamos o efeito de doadores de H2S no prurido agudo mediado por PAR-2 em camundongos. A injeção i.d. do agonista PAR-2 SLIGRL-NH2, induziu prurido que não foi afetado pelo pré-tratamento com o antagonista H1 pirilamina. A coinjeção dos doadores de H2S GYY4137 (lento) ou NaHS (espontâneo) com SLIGRL-NH2 reduziu significativamente o prurido (P<0,05). A glibenclamida (bloqueador de canais KATP) e o SNP (doador de NO), mas não o ODQ (inibidor da sGC), evitaram estes efeitos. O antagonista TRPA1 HC-030031 reduziu significativamente o prurido induzido pelo SLIGRL-NH2 (P<0,05), mas o prurido induzido pelo agonista TPRA1 AITC não foi afetado por NaHS. Ensaios de Western blot mostraram que ambos PAR-2 e TRPA1 são expressos constitutivamente na pele de camundongos. Nossos dados mostram que o prurido secundário à ativação do PAR-2 pode ser reduzido por H2S, atuando via a abertura dos canais KATP e ativação da via NO-GMPc. Ademais, o receptor TRPA1 pode mediar o prurido induzido por SLIGRL-NH2, mas o H2S não interfere nesta via. / In this study we investigated the effect of H2S donors in PAR-2-mediated acute pruritus in mice. The i.d. injection of the PAR-2 agonist SLIGRL-NH2 induced itching that was unaffected by pre-treatment with the H1 antagonist pyrilamine. Co-injection of the H2S donors GYY4137 (slow) or NaHS (spontaneous) with SLIGRL-NH2 significantly reduced pruritis (P <0.05). Glibenclamide (a KATP channel blocker) and SNP (a NO donor), but not ODQ (a sGC inhibitor) prevented these effects. The TRPA1 antagonist HC-030031 significantly reduced SLIGRL-NH2-induced pruritus (P<0.05), but the pruritus induced by the TPRA1 agonist AITC was unaffected by NaHS. Western blot assays showed that both TRPA1 and PAR-2 are constitutively expressed in the mouse skin. Our data show that itching secondary to PAR-2 activation can be reduced by H2S which acts via the opening of KATP channels and activation of the NO-cGMP pathway. Furthermore, TRPA1 receptors may mediate SLIGRL-NH2-induced pruritus, however, H2S does not interfere with this pathway.

O receptor ativado por protease do tipo 2 (PAR2) está envolvido na patogênese de doenças inflamatórias crônicas, incluindo a periodontite. O PAR2 pode ser ativado pela gingipaína, produzida pela Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) e proteinase 3 (P3) do neutrófilo. A ativação do PAR2 desempenha um papel relevante nos processos inflamatórios ao induzir a liberação de importantes mediadores pró-inflamatórios associados à destruição periodontal. No presente estudo, o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico na expressão do PAR2 por células do fluido gengival, bem como a sua associação com os níveis de mediadores pró-inflamatórios e proteases ativadoras foram investigados em pacientes com periodontite. Além disso, avaliou-se in vitro o envolvimento da via de sinalização MAPK-p38 na ativação do PAR2 e a influência deste na produção de superóxido (O2-) e na capacidade de fagocitose em neutrófilos do sangue periférico humano infectados pela P. gingivalis. Um aumento significativo (P < 0,05) da expressão do RNAm e proteica do PAR2 por células do fluido gengival foi positivamente associado aos parâmetros clínicos inflamatórios e aos níveis de interleucina (IL)-6, IL-8, fator de necrose tumoral-, metaloproteinases da matriz (MMP)-2, MMP-8, fator de crescimento de hepatócitos e fator de crescimento endotelial vascular, avaliados por Bioplex. Níveis elevados de RNAm da gingipaína e P3, expressão reduzida do RNAm da dentilisina (P < 0,05), bem como redução significativa (P < 0,05) dos níveis de inibidores de protease secretados por leucócitos e elafina (avaliados por ELISA), também foram associados à superexpressão do PAR2. Sítios periodontalmente saudáveis de indivíduos com periodontite crônica apresentaram uma menor expressão do RNAm e proteica do PAR2 (P < 0,05). O tratamento periodontal resultou na diminuição significativa da expressão de PAR2 (P < 0,05), correlacionada com a diminuição da expressão de mediadores inflamatórios (P < 0,05), bem como com suas proteases ativadoras (P < 0,05). Além disso, o uso do antagonista do PAR2 suprimiu significativamente (P < 0,05) a produção de superóxido em neutrófilos do sangue periférico humano, denotando o papel do PAR2 nessa importante função celular. Dessa forma, concluímos que o tratamento periodontal, o qual resulta na diminuição dos níveis de proteases e mediadores pró-inflamatórios, está associado com uma diminuição da expressão do PAR2, portanto, sugerindo que a expressão de PAR2 é influenciada pela presença da infecção periodontal, e não uma característica constitutiva favorecendo a inflamação periodontal. / Protease-activated receptor-2 (PAR2) is implicated in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases including periodontitis; it can be activated by gingipain, produced by Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), and by neutrophil-protease 3 (P3). PAR2 activation plays a relevant role in inflammatory processes by inducing the release of important inflammatory mediators associated with periodontal breakdown. In the present study, the effect of non-surgical periodontal treatment on PAR2 expression and its association with levels of pro-inflammatory mediators, and activating proteases were investigated in chronic periodontitis patients. Moreover it was evaluated in vitro the role of MAPK-p38 signaling pathway during PAR2 activation and its influence on superoxide production and phagocytosis capacity in peripheral human neutrophils infected with P. gingivalis. A significant mRNA and protein over-expression of PAR2 (P < 0.05) in gingival crevicular fluid cells was positively associated to inflammatory clinical parameters, and to the levels of interleukin (IL)-6, IL-8, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteases (MMP)-2, MMP-8, hepatocyte growth factor, and vascular endothelial growth factor (evaluated by Bioplex). Elevated levels of gingipain and P3 (P < 0.05), and decreased levels of dentilisin mRNA, and protease inhibitors, secretory leucocyte protease inhibitor and elafina (P < 0.05) (evaluated by ELISA), were also associated to PAR2 overexpression. Periodontally healthy sites from chronic periodontitis individuals showed a diminished expression of PAR2 mRNA and PAR2 protein level (P < 0.05). Furthermore, periodontal treatment resulted in decreased PAR2 expression (P < 0.05), correlated with decreased expression of inflammatory mediators (P < 0.05) and activating proteases (P < 0.05). Moreover, PAR2 antagonist reduced significantly superoxide production in human neutrophils (P < 0.05) showing the role of PAR2 on this important cellular function. We concluded that periodontal treatment resulted on decreased levels of proteases, and pro-inflammatory mediators is associated to decreased PAR2 expression, therefore suggesting that PAR2 expression is influenced by the presence of periodontal infection, and not a constitutive characteristic favoring periodontal inflammation.

Orientador: Marcos Hikary Toyama / Resumo: A giroxina é a principal serino protease encontrada no veneno total de Crotalus durissus terrificus. As serino proteases de veneno de serpentes são proteínas que apresentam uma grande similaridade estrutural com a trombina humana incluindo a alta conservação do sitio catalítico. Os resμltados já obtidos pelo nosso grupo revelaram a capacidade dos flavonoides glicosilados de Laguncularia racemosa em reduzir de forma significativa a atividade enzimática das trombinas humanas. A identificação destas molécμlas revelou que dois flavonoides glicosilados (quercetina-3-O-arabinosidio (QAra) e quercetina-3-O-ramnosidio (QRham)) respondem pela inibição da trombina (Rodrigues et al., 2015). Sabe-se que a soroterapia antiveneno não consegue neutralizar de forma eficiente a ação farmacológica das serino proteases e consequentemente não é capaz de neutralizar os danos homeostáticos e teciduais. Neste trabalho, uma nova serino protease foi isolada do veneno total de Crotalus durissus terrificus (cdtsp-2) através de quatro estapas de separação, usando a superdex 75 com uma fase móvel de bicarbonato de amônia pH 8, a cdtsp-2 Estas duas frações foram então fracionadas em coluna de troca iônica em DEAE para separação das principais frações e posteriormente fracionadas em CLAE de fase reversa para confirmar o grau de homologia molecular e em todas as etapas cromatográfica foram acompanhadas pelos ensaios enzimáticos em BApNA. A nova serino protease denominada como Cdtsp-2 (Crotalus durissus terr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gyroxin is the major serine protease present in Crotalusdurissusterrificus venom. Serine proteases from snake venom are proteins, which exhibit a great structural similarity to hμMan thrombin including the catalytic site conservation. The resμlts already obtained by our group revealed the glycosylated flavonoidsability of Laguncμlariaracemosato significantly reduce the enzymatic activity of hμMan thrombins. The molecμles identification reveals two glycosylated flavonoids (quercetin-3-O-arabinosidiμM (QAra) and quercetin-3-O-rhamnosidiμM(QRham)), which inhibit thrombin (Rodrigues et al., 2015). Antivenomserotherapycan not efficiently neutralize the serine proteases pharmacological action and is not able to neutralize homeostatic and tissue damage. In this work, a new serine protease was isolated from Crotalusdurissusterrificusvenom (cdtsp-2) by throμgh four separation stages , using superdex 75 with a mobile phase of ammoniμM bicarbonate pH 8. These two fractions were fractionated on ion exchange colμMn in DEAE for separation of the major fractions and subsequently fractionated in reverse phase CLAE to confirm the degree of molecμlar homology.All chromatographic steps were monitored by the enzymatic assays in BApNA. The new serine protease called cdtsp-2 (Crotalusdurissusterrificus serine protease 2) is an unpublished protein, with a molecμlar mass of 27 kDa and its N-terminal sequence showed structural differences when compared to the gyroxin of Crotalusdurissusterrificus. Re... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre