Os fibroblastos são atualmente considerados componentes ativos da resposta imune porque estas células expressam receptores do tipo Toll (TLRs), são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e mediar a produção de citocinas e quimiocinas durante a inflamação. A resposta imune inata do hospedeiro a lipopolissacarídeos (LPS) de Porphyromonas gingivalis é incomum, já que diferentes estudos relataram que este LPS pode ser um agonista para TLR2 e um antagonista ou agonista para TLR4. A sinalização por TLRs envolve proteínas adaptadoras, como MyD88 e TRAM, que são necessárias para a transdução do sinal até o núcleo para que ocorra a transcrição de RNAm para os mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar se a sinalização por meio de TLR2 ou TLR4 poderia afetar a produção de Interleucina (IL)-6, IL-8 e CXCL12 em fibroblastos humanos gengivais (HGF) e fibroblastos humanos de ligamento periodontal (HPLF). Objetivamos também comparar a participação das moléculas adaptadoras MyD88 e TRAM na expressão do RNAm dos mesmos alvos. Material e Métodos: Após silenciamento mediado por RNA de interferência de TLR2, TLR4, MyD88 ou TRAM, confirmado por RT-qPCR, HGF e HPLF, provenientes de três dadores voluntários, foram estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis ou com dois agonistas sintéticos de TLR2, Pam2CSK4 e Pam3CSK4, por 6 horas. A expressão do RNAm e das proteínas IL-6, IL-8, e CXCL12 foram avaliados por qRT-PCR e ELISA, respectivamente. Resultados: A expressão do RNAm de TLR2 foi regulada em HGF, mas não em HPLF por todos os estímulos. O silenciamento de TLR2 diminuiu IL-6 e IL-8 em resposta ao LPS de P. gingivalis, Pam2CSK4 e Pam3CSK4 de maneira semelhante, em ambas as subpopulações de fibroblastos (p<0,05). Por outro lado, a produção de CXCL12 permaneceu inalterada pelo silenciamento de TLR2 ou TLR4. No caso do silenciamento de MyD88 e TRAM, em ambos os subtipos de fibroblastos, o RNAm para os mesmos alvos também teve sua expressão diminuída (p<0,05). Já a expressão constitutiva de CXCL12 foi aumentada com o silenciamento de MyD88 ou TRAM (p<0,05). Conclusão: Estes resultados sugerem que a sinalização por meio de TLR2, por fibroblastos, as células residentes mais numerosas em gengiva e ligamento periodontal, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal, mas não interfere nos níveis de CXCL12, uma quimiocina importante no processo de reparação. Concluímos também que o silenciamento de MyD88 ou TRAM é capaz de diminuir o aumento da transcrição gênica de IL-6 e IL-8 provocado por LPS de P. gingivalis, embora a expressão constitutiva de CXCL12 seja regulada positivamente. / Fibroblasts are now seen as active components of the immune response because these cells express Toll-like receptors (TLRs), recognize pathogen associated molecular patterns and mediate the production of cytokines and chemokines during inflammation. The innate host response to lipopolysaccharide (LPS) from Porphyromonas gingivalis is unusual in that different studies have reported that it can be an agonist for TLR2 and an antagonist or agonist for TLR4. TLRs signaling pathway involves adaptor proteins, like MyD88 and TRAM, which are crucial for signal transduction to the nucleus and mRNA expression of inflammatory mediators. This study investigated and compared whether signaling through TLR2 or TLR4 could affect the production of IL-6, IL-8 and CXCL12 in both human gingival fibroblasts (HGF) and human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The role of MyD88 and TRAM on the mRNA expression of the same targets were also evaluated. Methods: After small interfering RNA-mediated silencing of TLR2, TLR4, MyD88 or TRAM, confirmed by RT-qPCR, HGF and HPLF from three volunteer donors were stimulated with P. gingivalis LPS or with two synthetic ligands of TLR2, Pam2CSK4 and Pam3CSK4, for 6 hours. IL-6, IL-8, and CXCL12 mRNA expression and protein production were evaluated by RT-qPCR and ELISA, respectively. Results: TLR2 mRNA expression was upregulated in HGF but not in HPLF by all the stimuli applied. Knockdown of TLR2 decreased IL-6 and IL-8 in response to P. gingivalis LPS, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 in a similar manner in both fibroblasts subpopulations. Conversely, CXCL12 remained unchanged by TLR2 or TLR4 silencing. For MyD88 or TRAM silencing, IL-6 and IL-8 mRNA were also decreased, in both fibroblasts subtypes. However CXCL12 mRNA constitutive expression was increased by siMyD88 or siTRAM. Conclusion: These results suggest that signaling through TLR2 by fibroblasts, the most numerous resident cells in gingiva and periodontal ligament, may control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to periodontal pathogenesis, but does not interfere with CXCL12 levels, an important chemokine in the repair process. Also, MyD88 or TRAM knockdown may decrease the IL-6 and IL-8 LPS-induced upregulation and increase the constitutive CXCL12 mRNA.

Introdução: Um dos primeiros sistemas de defesa contra os microrganismos é a via dos receptores Toll-like (TLRs). A ativação destes receptores leva à síntese de citocinas, dando início à resposta imune inata. Em modelos animais, o TLR2, TLR4 e TLR9 parecem estar relacionados com o reconhecimento de antígenos de Leishmania. A relação entre TLRs e leishmânia pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento da doença ou no controle da mesma. Até o momento não existem estudos de TLRs na leishmaniose cutânea humana. Objetivo: Determinar o padrão de expressão e as células associadas com o TLR2, TLR4 e TLR9 na leishmaniose cutânea. O objetivo secundário é correlacionar a quantidade de TLRs com a quantidade de citocinas e células inflamatórias na pele. Métodos: Cem biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea causadas por Leishmania (V.) braziliensis foram selecionadas inicialmente. Apenas os casos confirmados (presença de amastigotas no raspado, teste de Montenegro positivo, imunoistoquímica com presença de antígenos de Leishmania e reação em cadeia da polimerase com DNA de Leishmania (V.) braziliensis foram incluídos. Um grupo controle de pele normal foi incluído para comparação (quatro casos). A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 foi determinada por técnica imunoistoquímica, da mesma forma que os fenótipos celulares (células NK, macrófagos, células dendríticas, células CD4 e CD8) e citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama). Dupla-marcação foi realizada para identificar as células que expressaram os TLRs analisados. Análise semi-quantitativa foi utilizada para avaliação da expressão de TLRs na epiderme, enquanto na derme foi realizada análise quantitativa. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Doze casos preencheram os critérios de inclusão. Os pacientes eram todos masculinos, com lesões apenas em membros inferiores e mediana de idade de 23 anos [16-47]. A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 na epiderme da pele normal foi alta. Quando comparados com pele normal, tanto TLR4 quanto TLR2 mostraram menor expressão no epitélio dos pacientes com leishmaniose e não houve expressão de TLR9. A média de células expressando TLR2 na derme foi de 136,36±82,46 células/mm2, ao passo que a média de células expressando TLR4 foi de 3,21±4,11 células/mm2. A contagem de TLR9 foi de 86,15±88,36 células/mm2 predominando em áreas de formação de granulomas. A regressão linear não demonstrou relação entre a contagem de células marcadas ou citocinas com TLR2 ou TLR4. O aumento proporcional da expressão de TLR9 relacionou-se com maior expressão de IL-12 e IL-4 (p < 0,05). A dupla marcação demonstrou que os macrófagos expressaram TLR2. A dupla marcação não mostrou expressão de TLR2 nas células dendríticas e nas células NK. Conclusão: A leishmaniose cutânea localizada associa-se com a presença de TLR2, TLR4 e TLR9. No epitélio a expressão de TLR2 e TLR4 em pacientes com leishmaniose está diminuída em relação aos pacientes controles. A expressão do TLR2 na derme é estatisticamente maior que a de TLR4 e TLR9, a qual é expressa pelos macrófagos. A expressão de TLR9 ocorre principalmente nas áreas de granulomas havendo relação com a expressão de IL-12 e IL-4 / Introduction: One of the first systems of defense against microorganisms is the Toll-like receptors (TLRs) pathway. The activation of these receptors promotes the cytokine synthesis, initiating the innate immune response. In animal models, TLR2, TLR4 and TLR9 appear to be related to the recognition of antigens of Leishmania. The relationship between TLRs and Leishmania can be a key mechanism in the development of the disease or it control. Until now, there are not studies about TLRs in human cutaneous leishmaniasis. Objective: To determine the expression pattern and the cells associated with TLR2, TLR4 and TLR9 in cutaneous leishmaniasis. The secondary objective is to correlate the amount of TLRs with the amount of cytokines and inflammatory cells. Methods: One hundred biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (V.) braziliensis were initially selected. Only confirmed cases of cutaneous leishmaniasis were included in the analysis (presence of amastigotes in the scraping, positive Montenegro test, immunohistochemistry with the presence of Leishmania antigens and polymerase chain reaction with DNA from Leishmania (V.) braziliensis. A control group (4 cases) of normal skin was included for comparison. The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 was determined by immunohistochemistry, as well as cell phenotypes (NK cells, macrophages, dendritic cells, CD4 and CD8) and cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma). Double-staining was used to determine the cells expressing TLRs. Semi-quantitative analysis was used for evaluation of the expression of TLRs in the epidermis. Quantitative analysis was performed to evaluate the expression in the dermis. The level of significance was defined as p <0.05. Results: 12 cases fulfilled inclusion criteria. The patients were all male, with lesions in lower limbs and median age of 23 years [16-47]. The expression of TLR2 and TLR4 in the epidermis of normal skin was high. When compared with normal skin, TLR2 and TLR4 showed lower expression in the epidermis. There was no expression of TLR9 in the epidermis in cases of cutaneous leishmaniasis and normal skin. The mean number of cells expressing TLR2 in the dermis was 136.36±82.46 cells/mm2, while the average of cells expressing TLR4 was 3.21±4.11 cells/mm2. The count of TLR9 was 86.15±88.36 cells/mm2, and it was found mainly in the areas of granuloma formation. Linear regression showed no relationship between the number of labeled cells or cytokines with TLR2 or TLR4. There was an association between TLR9 and two cytokines (IL-12 and IL-4). This correlation suggested that the proportional increase in the expression of TLR9 was related to greater expression of IL-12 and IL-4 (p<0.05). The double staining showed that macrophages and endothelial cells expressed TLR2. The double staining showed no expression of TLR2 in dendritic cells and NK cells. Conclusion: The localized cutaneous leishmaniasis associated with the presence of TLR2, TLR4 and TLR9. The expression of TLR2 in the dermis was statistically greater than that of TLR4 and TLR9, which is expressed by macrophages. The expression of TLR9 occurs primarily in the areas of granulomas was associated with the expression of IL-12 and IL-4

Orientador: Vânia Nieto Brito de Souza / Coorientador: Alessandra Pontillo / Banca: Alexandrina Sartori / Banca: Fátima Regina Vilani Moreno / Resumo: Os macrófagos desempenham um papel importante na eliminação do M. Leprae (ML). Estas células participam do reconhecimento de patógenos e ativação do sistema imune, no entanto na hanseníase virchowiana elas se tornam alvos, servindo de habitat para o bacilo, que ali se protege da ação do sistema imune. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar a função macrofágica de pacientes com hanseníase virchowiana (LLP) em termos de expressão de marcadores de superfície e produção de mediadores inflamatórios. Além disso, considerando o possível envolvimento dos inflamassomas na resposta dos macrófagos ao ML, foi avaliada a expressão de genes do complexo do inflamassoma. Para tanto, macrófagos diferenciados a partir de monócitos sanguíneos de LLP e indivíduos saudáveis (HC) foram cultivados com ML. A expressão dos marcadores de ativação CD40 e ICAM, e dos receptores do tipo Toll envolvidos no reconhecimento do ML, TLR1 e TLR2, foi avaliada por citometria de fluxo. A produção de citocinas pró (TNF e IL-1β) e anti-inflamatórias (IL-10 e IL-1RA) foi determinada por ELISA e a produção de H2O2 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A expressão relativa dos genes NLRP1, NLRP3, NLRC4, CASP1, IL1B e IL18 foi avaliada por PCR em tempo real. ML induziu expressão semelhante de CD40 e ICAM em HC e LLP, assim como dos TLR1 e TLR2. TNF e IL-1β mostraram comportamento diferente, sendo que o ML estimulou uma produção significativa de TNF em HC e LLP, mas não induziu a secreção de IL-1β. H2O2 não foi significativamente induzida pelo ML em LLP. Nenhuma diferença foi encontrada para as citocinas anti-inflamatórias entre HC e LLP. A análise da expressão de genes relacionados aos inflamassomas mostrou que ML é capaz de induzir o gene da IL-1β, mas não dos receptores analisados. Os dados aqui reportados mostrando deficiência na secreção de IL-1β em macrófagos estimulados com ML e a baixa quantidade de H2O2 produzida ... / Abstract: Macrophages play a major role in the elimination of M. leprae (ML). These cells participate in pathogen recognition and activation of the immune system. However in the lepromatous leprosy macrophages become targets, serving as habitat for the bacillus that protects itself from the action of the immune system. This study aimed to evaluate the macrophage function in lepromatous leprosy patients (LLP) in term of surface molecules expression and cytokine and H2O2 production. Moreover, considering the possible involvement of inflammasome complex in macrophage response against ML, inflammasome genes expression was evaluated. ML induced surface expression of activation markers CD40 and ICAM in healthy controls (HC) and LLP macrophages in a similar way, as well as TLRs involved in ML recognition (TLR1 and TLR2). Pro-inflammatory cytokines TNF and IL-1β showed a different behavior. ML was able to induce TNF in HC and LLP, but not IL-1β. Similarly, ML induced significant production of H2O2 in HC but not in LLP macrophages. No difference was found in the production of anti-inflammatory molecules IL-10 and IL1RA in HC and LLP macrophages stimulated with ML. When inflammasome genes expression was analyzed an up-regulation of IL1B gene was observed in both HC and LLP macrophages stimulated with ML. Together, our data indicate that the deficiency in the production of IL-1β and H2O2 in lepromatous leprosy patients combined with IL1B gene expression induction by M. leprae suggested that even if surface recognition of ML and general activation of macrophages are apparently normal, the bacteria is able to inhibits the pathways leading to I IL-1β and H2O2 production, possibly affecting inflammasome activation / Mestre

Orientador: Luis Fernando Barbisan / Resumo: O câncer de mama apresenta história natural diversa, histologia complexa e com incidência crescente nas últimas décadas. Atualmente, existem poucos tratamentos para o câncer de mama hormônio-dependente e as drogas comumente utilizadas estão intimamente associadas a graves efeitos colaterais que limitam sua utilização. A imunoterapia apresenta-se como uma vertente para o tratamento do câncer e cresce cada vez mais o número de pesquisas voltadas ao papel de receptores toll-like no processo de carcinogênese. O P-MAPA é considerado um imunomodulador e através de estudos experimentais e ensaios clínicos, este composto tem demonstrado exercer atividade antiviral e antitumoral, aumentando a expressão de citocinas, ativando linfócitos e receptores toll-like. Assim, os objetivos do presente estudo foram caracterizar e comparar os efeitos histopatológicos e moleculares da imunoterapia com P-MAPA associada ao Tamoxifeno no tratamento do câncer de mama induzido quimicamente em ratas Sprague-Dawley (SD). Para o desenvolvimento deste trabalho, fêmeas SD foram divididas em sete grupos experimentais: os grupos 1-4 receberam dose única do carcinógeno 7,12- dimetil-benzoantraceno (DMBA) (80 mg/kg, i.g) durante a primeira semana do experimento, enquanto os grupos 5-7 receberam dose única do veículo da DMBA. A seguir, grupos 2 e 5 receberam doses do P-MAPA (5,0 mg/kg, 3x/semana, i.p) e do veículo do Tamoxifeno (5x/semana). Os grupos 3 e 6 receberam doses do P-MAPA e do Tamoxifeno (100ug/kg, 5x/s... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-22T12:52:26Z No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-22T12:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz (PAPES IV / PAPES V) CPqRR – Centro de Pesquisa René Rachou CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais INCTV – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas / Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados. Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1). O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção, o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immune inato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões moleculares associados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus. Quando ativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genes relacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudos do grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam alta mortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO, que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dos TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1 e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. No presente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados via intranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animais foi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico da infecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. A expressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WT infectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados com seus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressão dos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto nos cérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOS em C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu para gp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagos intraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagos WT, comparados aos grupos TLR KOs. Ensaios de histopatologia e imunofluorescência demonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8, macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreu com os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, uma vez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo real para verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF-_ no 5º dpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra o HSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto os iNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicou que IFN_ produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 e Natural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contra a infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenada de TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produção equilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produção de NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção por HSV-1. / This work was carried out in the Immunopathology laboratory of the Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) and Virus laboratory (Labvirus) of the Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Herpes viruses have DNA genome and are enveloped. Approximately 70% of adult people have had contact with the Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1). After infection, HSV-1 cause cold sores, or more serious injuries such as encephalitis, and after infection, the virus usually become latent and may be reactivated or not. Cells of innate immune system recognize the “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) through “Toll Like Receptors” (TLRs), orchestrating the immune response against the virus. When activated, TLRs start a signalization cascade that culminates in the activation of genes related to the innate immune defense (NO, cytokines and chemokines). Previous research from our group demonstrated that knockout (KO) mice to TLR9 and TLR2/9 showed high mortality after HSV-1 infection, unlike C57BL/6 wild type (WT) and TLR2KO, which were able to control the virus. Research aimed in interrelation of the expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 in TLR2 KO, TLR9 KO and TLR2 / 9 KO mice infected with HSV-1 and the main cytokines, cells and cellular immune mechanisms against infection by HSV-1. In this work, TLR2KO, TLR9KO, TLR2/9KO and C57BL/6 WT mice were intranasally infected with 106 p.f.u. of HSV-1, and their respective controls received PBS. Mice euthanasia was at the 5th day post infection (dpi), previously showed to be the viral multiplication peak in our model, and then trigeminal ganglia (TG) and brain were collected. The expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 were measured by Real Time PCR. Infected WT mice showed significant increase in the expression of these TLRs compared to respective controls in TG, but not in brain.KOs mice had increased expression of TLRs in TG (but in more moderated levels compared to WT) and in the brains. The expression of gp91phox, p22phox and iNOS were also measured. iNOS expression in infected C57BL/6 WT was higher than in other groups, that not occurs to gp91phox, p22phox. In addition, NO production by intraperitoneal macrophages was measured through Griess reaction, that demonstrated a more pronounced production by WT macrophages, compared to TLR KOs groups. Histopathology and immunofluorescence assays demonstrated higher cellularity in infected TG, and besides confirmed the CD8 and macrophages presence and increase of iNOS production in infected C57BL/6 WT, what did not occurred with TLR KO mice. In survival assay with C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO and iNOS KO, we showed the importance of the T cells and iNOS, because CD8 KO, RAG KO and iNOS KO had 0% of survival. C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO and iNOS KO mice had their TG analyzed by Real Time PCR, to verify the expression of viral gene VP-16 and MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes and TNF-_ in 5th dpi. These data show us that iNOS and T cells are important in innate responses against HSV-1, once RAG KO were irresponsive to cytokines expression, while iNOS KO showed an excessive response to cytokines expression. The cytometry assay indicated that IFN_ produced by T CD8 cells, in the TG, and by T CD4 and Natural Killer cells (NK), in region lymph nodes, are a possible mechanism to control HSV-1 infection of WT infected mice. We hypothesize that coordinated expression of TLRs leads to an efficient orchestration of the innate immunity system, through cytokines and chemokines stable production and proper cellular immune activity, with NO production by macrophages and T CD8, T CD4 e NK cells action controlling HSV-1 infection.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_dias_ioc_dout_2015.pdf: 3243109 bytes, checksum: d7bd8cfe053e4a7e858a6c96fc09cceb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, expressa em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. O reconhecimento do DNA bacteriano, rico em motivos CpG não metilados, pelo receptor TLR-9 representa uma importante via para a ativação da resposta imune inata, a qual pode levar à eliminação do agente infeccioso ou mediar manifestações patológicas. Foi mostrado ainda que complexos DNA-histona são mais potentes agonistas de TLR-9 que DNA sozinho. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento do receptor TLR-9 na ativação da resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo M. leprae. Inicialmente foi analisada a participação do TLR-9 na ativação da resposta imune inata em células epiteliais alveolares da linhagem A549 após estímulo com M. leprae. M. leprae foi capaz de induzir aumento das quimiocinas IL-8 e MCP-1 e a transcrição gênica do peptídeo antimicrobiano H\F062D-2 nas células epiteliais. O aumento da expressão de CD80 na superfície celular também foi observada após estímulo com o bacilo. O complexo CpG-Hlp micobacteriano solúvel também induziu aumento na produção de IL-8 nas células A549. Foi observado que o aumento de IL-8 induzido pelo M. leprae ocorre de forma dependente da translocação nuclear do NF-\F06BB e que o antagonista sintético de TLR-9 afetou a secreção de IL-8 induzida pelo M. leprae. A adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 pelas células epiteliais Em conjunto, esses dados sugerem que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer M. leprae via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sítio inicial da infecção. Uma vez que o aparecimento do eritema nodoso hansênico (ENH) está associado a liberação massiva de antígenos micobacterianos, foi investigado o envolvimento do TLR-9 na patogênese do ENH. Neste sentido, foi verificado o aumento da expressão de TLR-9, tanto em lesões de pele como em células mononucleares periféricas de pacientes reacionais, quando comparados com pacientes não reacionais. Posteriormente foram quantificados os níveis de ligantes de TLR-9 na circulação dos pacientes. Além de DNA de M. leprae, altos níveis de Hlp foram detectados no soro de pacientes reacionais. Como o TLR-9 também reconhece DNA endógeno, os níveis circulantes do complexo DNA-histona humano foram quantificados e observou-se um aumento destes complexos no soro de pacientes reacionais. Demonstramos que PBMCs de pacientes reacionais secretam níveis aumentados das citocinas TNF-\F061, IL-6 e IL-1\F062 em resposta ao complexo CpG-Hlp em comparação a pacientes não reacionais e indivíduos sadios. Finalmente, o antagonista sintético de TLR-9 inibiu a secreção das citocinas pelas PBMCs em resposta ao lisado de M. leprae. Em conjunto, esses resultados sugerem um importante envolvimento do receptor TLR-9 no processo inflamatório desencadeado no ENH abrindo perspectivas para novas abordagens imunoprofiláticas e terapêuticas / Mycobacterium leprae , etiological agent of leprosy, expresses in abundance a cationic protein similar to histones, called histone - like protein ( Hlp ) , present in the envelope as well as in bacterial nucleoid. The r ecognitio n of bacterial DNA rich in unmethylated CpG motifs by TLR - 9 is an important pathway for activation of the innate immune response, which can lead to the elimination of the infectious agent or mediate pathological manifestations. Moreover, studies showed tha t DNA - histone complexes are mor e potent agonists of TLR - 9 than DNA alone . This study aimed to investigate th e involvement of TLR - 9 in the activation of the host immune response d urin g the course of M. leprae infection. Initially, we analyzed the participat ion of TLR - 9 activation on the innate immune response in A549 alveolar epithelial cells after stimulation with M. leprae . It was shown that M. leprae was able to induce the chemokines I L - 8 and MCP - 1 , and gene transcription of antimicrobial peptide H  D - 2 in epithelial cells. T he increase of CD80 expression on the cell surface was also observed after stimulation with bacillus. Soluble mycobacterial CpG - Hlp complex also induced an increase in IL - 8 in A549 cells. It was observed that the increase of IL - 8 , induc ed by M. leprae , occurs dependently nuclear translocation of NF -  B and synthetic TLR - 9 antagonist affected IL - 8 secretion induced by M. leprae . T he addition of CpG to wild type M. smegmatis , but not to the mutant gene hlp , increased IL - 8 production by epit helial cells. A s a whole , t he se results suggest that respiratory epithelial cells can recognize M. leprae via TLR - 9 and thus participate in the innate immune response in the initial infection site. Since the appearance of erythema nodosum leprosum (ENL) is associated with the massive release of mycobacterial antigens , it was investigated the involvement of TLR - 9 in the pathogenesis of ENL. In this sense, we observed an increase in expression of TLR - 9, both in skin lesions and peripher al mononuclear cells of ENL patients, when compa red with non reactional patients. Subsequently, we measured the levels of TLR - 9 ligands in the circulation of patients. In addition to M. leprae DNA , high levels of Hlp were detected i n the seru m of ENL patients . As TLR - 9 also recog nize s endogenous DNA, circulating levels of the human DNA - histone complex were quantified , and we also observed an increase of these complexes in the serum of ENL patients. Furthermor e, PBMCs from ENL pa tients secreted elevated levels of TNF -  , IL - 6 and IL - 1  cytokines in response to CpG - Hlp complex , when compared to nonreactional patients and healthy individuals. F inally, synthetic antagonist of TLR - 9 inhibited the secretion of cytokines by P BMCs in respo nse to M. leprae lysates . The results described in t he second part of the study suggest a major involvement of TLR - 9 receptor in the inflammatory process triggered in ENL , opening up prospects for new immunoprophylactic and therapeutic approaches.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-25T15:21:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ludmila Porto Mendes Polari.pdf: 1622619 bytes, checksum: 95b9c669923025a1b43b0a5623e3ab64 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T15:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ludmila Porto Mendes Polari.pdf: 1622619 bytes, checksum: 95b9c669923025a1b43b0a5623e3ab64 (MD5) / Introdução. A leishmaniose cutânea (LC) causada por Leishmania braziliensis é caracterizada por forte resposta imune do tipo Th1, importante para a eliminação do parasito, mas associada com o desenvolvimento das lesões. Apesar dos vários estudos sobre a imunologia da LC, vários aspectos sobre os estágios iniciais da infecção permanecem desconhecidos. Os receptores toll-like (TLR) são expressos em diversos tipos celulares, como monócitos, e a ativação desses receptores está associada à síntese de citocinas pró-inflamatórias, que iniciam a resposta imune inata. Entretanto, ainda não se tem certeza do papel dos TLRs na LC humana. Objetivo: Caracterizar a expressão dos TLRs 2 e 4 nas subpopulações de monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea. Materiais e métodos: As expressões dos TLRs 2 e 4 e de TNF e de IL-10 foram avaliadas por citometria de fluxo nas subpopulações de monócitos de 37 pacientes com LC e 21 indivíduos sadios (CS), ex-vivo e após infecção in vitro com L. braziliensis marcados com CFSE. Resultados: A expressão dos TLRs 2 e 4, ex-vivo e após infecção com L. braziliensis, foi maior nos pacientes com LC quando comparada com CS. A expressão desses receptores é maior nos monócitos infectados com L. braziliensis em relação aos não infectados, e também é maior nas células CD14highCD16+ (monócitos intermediários) quando comparado com células CD14highCD16- (monócitos clássicos) e CD14lowCD16+ (monócitos não-clássicos). A expressão intracelular de TNF e de IL-10 foi maior nos monócitos CD14high (clássicos e intermediários) infectados com L. braziliensis que expressam os TLRs 2 e 4. Conclusão: O aumento na expressão dos TLRs 2 e 4 em monócitos de pacientes com LC, após infecção com L. braziliensis, está associado ao aumento intracelular de TNF, sugerindo que a ativação desses receptores pode contribuir para a forte resposta inflamatória observada na leishmaniose tegumentar.

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-01. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:47Z : No. of bitstreams: 1 000831284_20160801.pdf: 1343666 bytes, checksum: 5d02a6789e1700359130909ce0a0f47d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-01T11:29:59Z: 000831284_20160801.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-01T11:30:56Z : No. of bitstreams: 1 000831284.pdf: 2801997 bytes, checksum: d2537b2f5a3345b1d52a7b0955c6b084 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em doses supra fisiológicas o Decanoato de Nandrolona (DN), associado ao exercício físico pode alterar os níveis androgênicos, afetando órgãos dependentes de andrógenos, incluindo a próstata. Estas alterações podem afetar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), favorecer o surgimento de lesões patológicas e ativar a via inflamatória. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar possíveis alterações na morfofisiologia da próstata ventral, de ratos adultos e envelhecidos, decorrentes do uso de DN associado ou não ao treinamento físico resistido (TFR). 56 ratos da linhagem Sprague-dawley foram divididos em oito grupos (n=7). Em seguida tratados por oito semanas e divididos em sedentários e treinados com ou sem uso de DN. Após este período o tratamento foi interrompido. Os animais adultos foram eutanasiados 48 horas após o período experimental, e os envelhecidos com 300 dias de idade. A próstata ventral foi processada para análises morfométrica, histopatológicas, imunoistoquímica e de Western blotting. A altura do epitélio da próstata mostrou-se alterada imediatamente após interrupção do TFR e/ou a administração de DN. As alterações observadas nos níveis de testosterona e estradiol plasmáticos, em animais adultos expostos ao DN e ao TFR, foram persistentes durante o processo de envelhecimento. A expressão dos receptores de estrógeno α e β (ERα e ERβ) aumentou com uso de DN, na fase adulta e a expressão do ER β reduziu em todos os grupos envelhecidos tratados. O TFR foi determinante na redução do AR nos animais envelhecidos. Os animais que receberam DN e fizeram o TFR na fase adulta apresentaram maior ocorrência de lesões patológicas na próstata ventral, que levaram à ativação do TLR4. Também a expressão de TLR2, NOX1 e Nrf2 aumentou em grupos expostos ao DN. As lesões patológicas favoreceram o aumento da expressão de NFκB, IRF3 e MAPK, com a produção de TNFα e ... / Anabolic-androgenic steroids are used by professional and recreational athletes who want to increase muscle mass. The Nandrolone Decanoate (ND) is the most widely used steroid among athletes. Together, ND and physical resistance training (PRT) may alter the androgen levels and lead disturbances in the prostate homeostasis. The present study aimed to investigate the effects of the ND abusive use and PRT on adult and older rats prostate. We evaluated whether ND at doses of 5mg/kg (twice a week, via i.m.), with or without physical exercises, is able to alter the prostate morphophysiology. Materials and Methods: 56 male Sprague-Dawley rats were divided into four groups (n=7): sedentary and trained groups, with or without ND. The animals were treated for eight weeks and then sacrificed 48h after the last injection (adults) or sacrificed with 300 days old. The prostate was removed and processed to morphometric and histopathological analyses and according to Western blotting techniques for NOX1, NrF2, TLR2 and 4, NFκB, IRF3, MAPK, IL-6 and TNFα expressions. The results showed that both ND and PRT altered the testosterone levels and estradiol level just in DN groups. ERα and ERβ increased in animals that used DN in adulthood and ER β expression decreased in treated groups aged. The PRT was involved in AR reducing in aged animals. DN and PRT during adulthood lead to pathological lesions of medium to high grade and activated TLR4. TLR2, Nox1 and Nrf2 expression were increased DN groups. The pathological lesions induced NFκB, IRF3 and MAPK expression, with TNF and IL-6 production. Despite no alterations were observed in the expression of TLR2 and TLR4 in SD2 and EV2 groups, NFκB and cytokine expressions were increased. Thus, we conclude that ND, associated or not to PRT alter hormone levels, triggers an inflammatory pathway and interferes with the prostate morphophysiology during adulthood and aging

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:56Z : No. of bitstreams: 1 000840998_20151016.pdf: 568585 bytes, checksum: e8f035e4f942fd75fc6ad38083a8fd0d (MD5) Bitstreams deleted on 2015-10-16T13:54:07Z: 000840998_20151016.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-16T13:54:48Z : No. of bitstreams: 1 000840998.pdf: 3047380 bytes, checksum: 4f011bacf1f109d530d0cddd6178474e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Agonistas dos receptores Toll-like (TLRs) podem representar candidatos promissores a serem desenvolvidos como medicamentos contra o câncer. Atualmente, a terapia mais eficaz para o câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo (CBNMI) é a imunoterapia com BCG (Bacillus Calmette-Guerin), embora sua utilização esteja limitada a efeitos colaterais de intensidades variadas. Diante deste cenário destaca-se o P-MAPA, que por sua grande versatilidade e mínima citoxicidade, abre uma nova perspectiva para o combate de alguns tipos de cânceres, incluindo o CBNMI. Assim, os objetivos principais deste estudo foram caracterizar os efeitos histopatológicos e moleculares da imunoterapia intravesical com P-MAPA envolvendo as vias de sinalização dos TLRs 2 e 4 no tratamento do CBNMI induzido quimicamente em camundongos selvagens (wild type - WT) e knockouts (-/-) para TLR4 e MyD88. Os efeitos da imunoterapia com P-MAPA foram comparados com o tratamento com BCG. Foram utilizados 20 camundongos fêmeas de cada linhagem (WT, TLR4-/- e MyD88-/-), todos com 60 dias de idade e mantidos no Centro de Medicina Nuclear da Faculdade de Medicina/USP - São Paulo. Os animais foram divididos em 4 grupos de 5 animais, para cada linhagem: Grupo Controle (CTL): recebeu uma dose intravesical de solução fisiológica por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU: recebeu uma dose intravesical de N-metil-N-nitrosouréia (MNU) a cada 15 dias, totalizando 3 doses; Grupo MNU+BCG: recebeu uma dose intravesical de BCG por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU+P-MAPA: recebeu uma dose intravesical de P-MAPA por 3 semanas consecutivas. Após 09 semanas de experimento, as bexigas urinárias foram coletadas e submetidas às análises histopatológicas e Western Blotting. O presente trabalho demonstrou que a imunoterapia com P-MAPA promoveu distinta ativação do sistema imune inato mediada por TLRs 2 e 4 em relação ao BCG, resultando no aumento da via de sinalização para... / Compounds that are able to act as Toll-like receptors (TLRs) agonists may represent promising candidates to be developed as drugs against cancer. Currently, the most effective therapy for non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) is immunotherapy with BCG (Bacillus Calmette-Guerin) associated with transurethral resection. However, the use of BCG is associated with side effects of varying strengths and in this scenario highlights the P-MAPA, which in great versatility and minimal cytotoxicity, opens a new perspective for fighting certain types of cancers, including NMIBC. Thus, the main objectives of this study were to characterize the histopathological and molecular effects of intravesical immunotherapy with P-MAPA involving the signaling pathways of TLRs 2 and TLR4 in the NMIBC treatment chemically induced in Wild Type mice (Wild Type - WT) and knockouts (-/-) for TLR4 and MyD88. The effects of P-MAPA immunotherapy were compared with BCG treatment. It were utilized 20 female mice of each strain (WT, TLR4 -/- and MyD88 -/-), all with 60 days of age and kept in the Nuclear Medicine Center, School of Medicine / USP - São Paulo. The animals were divided into 4 groups of 5 animals for each strain: Control Group (CTL): received intravesical dose of saline for 3 consecutive weeks; MNU Group: received a intravesical dose of N-methyl-N-Nitrosourea (MNU) every 15 days, a total of 3 doses; MNU+BCG Group: received received intravesical dose of BCG for 3 consecutive weeks; MNU+P-MAPA Group: received intravesical dose of P-MAPA for 3 consecutive weeks. After 09 weeks of experiment, urinary bladders were collected and submitted to histopathological and Western blotting analysis. The present study showed that P-MAPA immunotherapy led to distinct activation of the innate immune system TLR2 and 4-mediated when compared to BCG, resulting in increased signaling pathway for interferon (TRIF, IRF3, IFN-α and IFN-γ ) and restoration of the p53 protein ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2014-11-10T11:58:27Z : No. of bitstreams: 1 000783227.pdf: 2954053 bytes, checksum: fb43c78666f39a00da3699d364cbca74 (MD5) / A leishmaniose visceral (LV) é um problema emergente de saúde pública, sendo uma das principais doenças negligenciadas no Brasil e no mundo. É causada por L. donovanie L.chagasi/infantum. A resistência à infecção está associada à produção de citocinas de perfil Th1 e a suscetibilidade às citocinas do perfil Th2. Os receptores Toll-like (TLRs) da imunidade inata têm importante papel no reconhecimento microbiano e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Além disso, o estado nutricional possui grande impacto na resposta imune. Desse modo, nosso objetivo foi avaliar o perfil bioquímico-nutricional, o envolvimento dos TLR2 e TLR4 na produção de citocinas e NO e relacionar as lipoproteínas com a resposta imune em pacientes com LV antes e após o tratamento. Foram estudados 13 pacientes com LV antes e após o tratamento e 16 indivíduos controles.A avaliação bioquímica-nutricional foi realizada através da impedância biolétrica e testes bioquímicos de colesterol total (CT), HDL, LDL, triglicerídeos (TG), glicose e proteínas totais e frações. A expressão de TLR2 e TLR4 em linfócitose monócitosfoi realizada através da citometria de fluxo. A produção das citocinas e NO em sobrenadantes de cultura de PBMCs estimuladas ou não com agonistas dos receptores TLR2 (PGN) e do TLR4 (LPS), foi avaliada através da técnica de CBA Flex e de kits comerciais. Pacientes prétratamento apresentaram menor ângulo de fase em relação aos controles, níveis diminuídos de CT, HDL, LDL e albumina e níveis aumentados de triglicerídeos em relação ao póstratamento e controles. Além disso, mostraram maior porcentagem de linfócitos expressando TLR2 e TLR4 e aumento da expressão destes receptores em monócitos. Quanto às citocinas, foi verificado aumento da produção de TNF-α, IL-10 e TGF-β enquanto os níveis de IFN-γ, IL-17 e NO foram menores. Os resultados também mostraram o envolvimento dos receptores TLR2 e TLR4 na ... / Visceral leishmaniasis (VL) is an emerging public health problem, being of the major neglected diseases in Brazil and worldwide. It is caused by L. chagasi and L. donovani/infantum. Resistance to infection is associated to production of Th1 cytokines and susceptibility to Th2 cytokine profile. The toll-like receptors (TLRs) of the innate immunity plays an important role in microbial recognition and development of the adaptive immune response. In addition, nutritional status has a great impact on the immune response. Our objective was to evaluate the biochemical and nutritional profile, the involvement of TLR2 and TLR4 in the production of cytokines and NO and relate the lipoproteins to the immune response in VL patients, before and after the treatment. Were studied 13 patients with LV before and after the treatment and 16 control subjects. Biochemical and nutritional evaluation was performed by bioelectrical impedance and biochemical assays of total cholesterol (TC), HDL, LDL, triglycerides (TG), glucose, and total protein and fractions. Expression of TLR2 and TLR4 in lymphocytes and monocytes was performed by flowcytometry. The production of cytokines and NO in culture supernatants of PBMCs stimulated or not with agonists of TLR2 (PGN) and TLR4 (LPS) receptors was evaluated by CBA Flex technique and commercial kits. Patients on pre-treatment had lower phase angle compared to controls, reduced levels of TC, HDL, LDL and albumin and increased triglycerid elevels in relation to post-treatment and controls. In addition, pre-treatment patients presented a higher percentage of lymphocytes expressing TLR2 and TLR4 and increased expression of these receptors on monocytes. Regarding the cytokines, was observed increased of the production of TNF-α, IL-10 and TGF-β, while production of IFN- γ, IL-17 and NO were lower. The results also demonstrated the involvement of TLR2 and TLR4 receptors on TNF-α, IL-10 and NO production. With treatment ...