El análisis y modificación de caminos metabólicos para mejorar las propiedades de las células usando herramientas genéticas actuales es un objetivo central en Ingeniería Metabólica. La idea básica es integrar la información biológica cuantitativa obtenida de diversas fuentes, especialmente de análisis genómicos, a modelos matemáticos para poder efectuar análisis de datos y adquisición de datos asistida por modelos, a la vez que se pretende sugerir con más efectividad modifi-caciones a realizar sobre los microorganismos para lograr sobreproducción de compuestos deseados (por ejemplo, bio-combustibles o antibióticos), intersección de ciertas moléculas en intervenciones terapéuticas, entre otros. En la presente tesis se desarrollan modelos cinéticos de redes metabólicas basados en primeros principios, en el marco de problemas de optimización. El objetivo final de proponer modificaciones en dichas rutas metabólicas para la maximización de la pro-ducción de un producto de interés biotecnológico, como un aminoácido o un biocombustible. En una primera etapa, se lleva a cabo un estudio de sensibilidad para determinar los principales parámetros a identificar, mediante el desarrollo y aplicación de técnicas de sensibilidad global. Dichas técnicas están basadas en el estudio de varianzas condicionales e incondicionales de las variables de estado. En una segunda etapa, se lleva a cabo el ajuste de los principales parámetros del modelo cinético de rutas metabólicas con datos in vivo, obtenidos en la bibliografía para un cultivo continuo de E. coli, frente a un pulso de glucosa. Las predicciones del modelo se comparan con otros conjuntos de datos de bibliografía, con resultados aceptables. Asimismo, se llevan a cabo experien-cias con dicho microorganismo en cultivos continuos y se obtienen datos experimentales a nivel bio-reactor, que se emplean para ajustar un modelo cinético de quimiostato. La estimación de parámetros se lleva a cabo formulando un problema de optimización con función objetivo de máxima verosimilitud, sujeto a un sistema de ecuaciones diferenciales algebraicas que representan la red metabólica y el bioreactor, respectivamente. En la siguiente etapa, el modelo cinético se formula en el marco de un problema de programación no lineal, para el diseño de redes metabólicas que maximizan un objetivo biotecnológico. Finalmente, se formula un problema de diseño óptimo con restricciones que aseguran la estabilidad de la red obtenida, mediante la aplicación de conceptos de estabilidad de sistemas no lineales de Lyapunov. La metodo-logía presentada en esta tesis, unida a resultados numéricos que concuerdan con datos experimentales intra y extracelu-lares, permite el estudio sistemático de redes metabólicas y a la vez avanzar hacia la integración de modelos metabólicos complejos para el diseño óptimo de cepas. / The main objective in Metabolic Engineering is the analysis and modification of metabolic pathways to improve cell properties, using currently available genetic tools. The basic idea is to couple biological information from different sources, mainly genomic analysis, to mathematical models for computer aided data acquisition and analysis, as well as prediction of modifications on microorganisms to achieve biotechnological products overproduction. In this thesis work, we formulate metabolic network kinetic models, based on first principles, within an optimization framework. The final objective is to propose modifications in metabolic pathways for aminoacid o bioethanol overproduction. As a first step, we perform global sensitivity analysis (GSA) on the developed metabolic network model to determine identifiable parameters. The applied methodology is a variance-based one, most appropriate for highly nonlinear models like the system under study. The second step includes parameter estimation for the kinetic model, based on in vivo collected data from the literature for a glucose pulse inserted in an E. coli continuous culture. Model predictions favorably compare to other sets of experi-mental data from the literature. Fermentations have been carried out under the same conditions for E. coli cultures and collected experimental data has been used for parameter estimation in a simple continuous bioreactor kinetic model. Parameter estimation is performed within an optimization fra-mework with a maximum likelihood objective function, subject to a differential algebraic equations system representing the metabolic network or the bioreactor, alternatively. In the last step, the kinetic model is formulated within a nonlinear programming program for the optimal design of a metabolic network for a desired product overproduction. The model is re-formulated including stability constraints based on Lyapunov stability theory to ensure asymptotic stability of the optimal metabolic network. The methodology proposed in this thesis, together with numerical results that are in agreement with intra and extracellular experimental data, paves the way to the systematic study of metabolic pathways and the inte-gration of complex metabolic network models for the optimal design of strains of biotechnological interest.

Células estomáticas e reações metabólicas de plantas foram modelados por meio da teoria dos grafos neste trabalho; a distância entre estômatos vizinhos na folha foi adotada como parâmetro utilizado para a conectividade em redes onde os estômatos foram definidos como nodos. A direção da formação de produtos e substratos em reações metabólicas determinou a conectividade nas redes metabólicas, onde cada metabólito foi definido como um nodo. As redes de estômatos foram capazes de gerar uma grande quantidade de informação geométrica associada à distância entre os estômatos. Estas medidas se mostraram uma poderosa ferramenta para avaliar a plasticidade fenotípica em folhas de plantas. A adaptação de plantas a condições ambientais extremas, como altas taxas de umidade e grandes variações no tempo de exposição à luz, puderam ser quantificadas por parâmetros de redes. Parâmetros topológicos globais das redes metabólicas mostraram que elas possuem propriedades estatísticas e topológicas de redes livre escala, como nos seres vivos em geral. Entretanto, alguns parâmetros topológicos locais das redes como a medida hub-score, geram vetores de características que, se comparados entre plantas, geram informação filogenética. Além disso, nós comprovamos que é possível construir modelos que sugerem uma organização geral para o metabolismo, por meio de algorítmos de conectividade hierárquica. O algorítmo de k-cores foi usado para gerar camadas de conectividade nas redes metabólicas. A atribuição química dos metabólitos ao longo das camadas k-core, mostra que a hierarquia de conexões está associada a especialização do metabolismo. Isto sugere que o algorítimo também gera informação sobre a evolução da maquinaria metabólica. Portanto, o modelo para conectar elementos de uma rede metabólica adotado neste trabalho, traz informações naturais sobre as plantas, o que sugere que exista parâmetros físicos das reações metabólicas representados pelo modelo. / Stomatic cells and metabolic reactions were modeled by graph theory in this work. The distance between stomata was adopted as connectivity parameter in the networks where stomata were defined as nodes. The direction of formation from products and substrates in the metabolic reactions, determined the connectivity from the metabolic networks, where each metabolite was defined as a node. The networks of stomata were able to generate a large amount of geometric information based at distance between the stomata. These measures represented a powerful tool to evaluate the phenotypic plasticity in leaves of plants. Global topological parameters from plant the metabolic networks revealed that plant metabolic networks has the topology of free scale networks, as in living beings in general. However, some local topological parameters of the networks such as the hub-score, can be organized as characteristic vectors with differential phylogenetic information. In addition, we have shown that it is possible to construct models that suggest a general organization for the metabolism through algorithms with iterative percolation from network connectivity. The k-cores algorithm was used to generate layers of connectivity in the metabolic networks. The chemical assignment of the metabolites along the k-core layers shows that the hierarchy of connections is associated with specialization of metabolism. This suggests that the algorithm also generates information about the evolution of the metabolic machinery. Therefore, the model used to connect elements of the metabolic networks adopted in this work, brings natural information about the plants, which suggests that there are physical parameters of the metabolic reactions represented by the model.

Células estomáticas e reações metabólicas de plantas foram modelados por meio da teoria dos grafos neste trabalho; a distância entre estômatos vizinhos na folha foi adotada como parâmetro utilizado para a conectividade em redes onde os estômatos foram definidos como nodos. A direção da formação de produtos e substratos em reações metabólicas determinou a conectividade nas redes metabólicas, onde cada metabólito foi definido como um nodo. As redes de estômatos foram capazes de gerar uma grande quantidade de informação geométrica associada à distância entre os estômatos. Estas medidas se mostraram uma poderosa ferramenta para avaliar a plasticidade fenotípica em folhas de plantas. A adaptação de plantas a condições ambientais extremas, como altas taxas de umidade e grandes variações no tempo de exposição à luz, puderam ser quantificadas por parâmetros de redes. Parâmetros topológicos globais das redes metabólicas mostraram que elas possuem propriedades estatísticas e topológicas de redes livre escala, como nos seres vivos em geral. Entretanto, alguns parâmetros topológicos locais das redes como a medida hub-score, geram vetores de características que, se comparados entre plantas, geram informação filogenética. Além disso, nós comprovamos que é possível construir modelos que sugerem uma organização geral para o metabolismo, por meio de algorítmos de conectividade hierárquica. O algorítmo de k-cores foi usado para gerar camadas de conectividade nas redes metabólicas. A atribuição química dos metabólitos ao longo das camadas k-core, mostra que a hierarquia de conexões está associada a especialização do metabolismo. Isto sugere que o algorítimo também gera informação sobre a evolução da maquinaria metabólica. Portanto, o modelo para conectar elementos de uma rede metabólica adotado neste trabalho, traz informações naturais sobre as plantas, o que sugere que exista parâmetros físicos das reações metabólicas representados pelo modelo. / Stomatic cells and metabolic reactions were modeled by graph theory in this work. The distance between stomata was adopted as connectivity parameter in the networks where stomata were defined as nodes. The direction of formation from products and substrates in the metabolic reactions, determined the connectivity from the metabolic networks, where each metabolite was defined as a node. The networks of stomata were able to generate a large amount of geometric information based at distance between the stomata. These measures represented a powerful tool to evaluate the phenotypic plasticity in leaves of plants. Global topological parameters from plant the metabolic networks revealed that plant metabolic networks has the topology of free scale networks, as in living beings in general. However, some local topological parameters of the networks such as the hub-score, can be organized as characteristic vectors with differential phylogenetic information. In addition, we have shown that it is possible to construct models that suggest a general organization for the metabolism through algorithms with iterative percolation from network connectivity. The k-cores algorithm was used to generate layers of connectivity in the metabolic networks. The chemical assignment of the metabolites along the k-core layers shows that the hierarchy of connections is associated with specialization of metabolism. This suggests that the algorithm also generates information about the evolution of the metabolic machinery. Therefore, the model used to connect elements of the metabolic networks adopted in this work, brings natural information about the plants, which suggests that there are physical parameters of the metabolic reactions represented by the model.

Análise de Redes Metabólicas foi aplicada à cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D, e a alguns mutantes interrompidos em genes que codificam para proteínas regulatórias envolvidas no fenômeno de repressão por glicose. Todas as cepas foram cultivadas em aerobiose, em meio mínimo contendo [1-13C]glicose como substrato limitante. As células eram recolhidas em situação de crescimento balanceado e submetidas à hidrólise, seguida de derivação e posterior injeção da amostra resultante num cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa, para análise da marcação em alguns fragmentos de metabólitos intracelulares. Estes dados serviram como base para a identificação da atividade de algumas vias metabólicas no metabolismo central de S. cerevisiae. Além disto, utilizando-os juntamente com um modelo estequiométrico, foi possível obter uma estimativa para os fluxos no metabolismo central na cepa referência e nos mutantes estudados. Num primeiro momento, a metodologia foi validada para cultivos contínuos e descontínuos. Calculou-se um desvio padrão para a medida da marcação em cada fragmento de metabólito detectado pela metodologia empregada. Na cepa referência, observou-se que o ciclo de Krebs opera de forma cíclica em células que respiram e de forma não cíclica em células que apresentam metabolismo respiratório-fermentativo. Verificou-se que uma maior parte da glicose consumida é desviada para a via das pentoses fosfato no primeiro caso, em relação ao segundo. Foram encontradas evidências para a biossíntese de glicina através da enzima treonina aldolase e para a atividade da enzima málica. A ausência das proteínas Mig1 e Mig2 não altera os padrões de crescimento, produção de etanol e de marcação em metabólitos intracelulares de S. cerevisiae. Já a ausência de Hxk2, Reg1 ou Grr1 provoca alívio na repressão por glicose, observado pelo aumento das atividades respiratórias. / Metabolic Network Analysis was applied to the reference strain CEN.PK113-7D of Saccharomyces cerevisiae, as well as to some mutants disrupted in genes which code for regulatory proteins involved in the glucose repression cascade. All strains were cultivated under aerobic conditions, using minimal medium with [1-13C]glucose as the limiting substrate. Cells were harvested under balanced growth conditions and submitted to hydrolysis, derivatization and injection of the sample into a gas chromatograph coupled to a mass spectrometer for analysis of the labeling pattern in some fragments of intracellular metabolites. These data were used for identifying the activity of some pathways in the central metabolism of S. cerevisiae. Furthermore, using the data together with a stoichiometric model, it was possible to estimate the fluxes in the central metabolism of the reference strain and in the mutant strains. First, the methodology was validated for batch and continuous cultivations. Standard deviations were calculated for the measurement of the fractional labeling in each of the detected fragments. In the reference strain, it was observed that the Krebs cycle operates in a cyclic manner in respiratory cells, whereas it operates in a non cyclic manner under respiro-fermentative metabolism. It was also seen that a greater part of the glucose consumed by the cells enters the pentose phosphate pathway in the former than in the later case. Evidence for the activity of the threonine aldolase and the malic enzyme catalyzed reactions was also found. The absence of the Mig1 and Mig2 proteins does not alter the growth, ethanol formation and labeling pattern of intracellular metabolites in S. cerevisiae. In contrast, the absence of Hxk2, Reg1, or Grr1 provoques a relief in glucose repression, which was observed by an increased respiratory activity.

Análise de Redes Metabólicas foi aplicada à cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D, e a alguns mutantes interrompidos em genes que codificam para proteínas regulatórias envolvidas no fenômeno de repressão por glicose. Todas as cepas foram cultivadas em aerobiose, em meio mínimo contendo [1-13C]glicose como substrato limitante. As células eram recolhidas em situação de crescimento balanceado e submetidas à hidrólise, seguida de derivação e posterior injeção da amostra resultante num cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa, para análise da marcação em alguns fragmentos de metabólitos intracelulares. Estes dados serviram como base para a identificação da atividade de algumas vias metabólicas no metabolismo central de S. cerevisiae. Além disto, utilizando-os juntamente com um modelo estequiométrico, foi possível obter uma estimativa para os fluxos no metabolismo central na cepa referência e nos mutantes estudados. Num primeiro momento, a metodologia foi validada para cultivos contínuos e descontínuos. Calculou-se um desvio padrão para a medida da marcação em cada fragmento de metabólito detectado pela metodologia empregada. Na cepa referência, observou-se que o ciclo de Krebs opera de forma cíclica em células que respiram e de forma não cíclica em células que apresentam metabolismo respiratório-fermentativo. Verificou-se que uma maior parte da glicose consumida é desviada para a via das pentoses fosfato no primeiro caso, em relação ao segundo. Foram encontradas evidências para a biossíntese de glicina através da enzima treonina aldolase e para a atividade da enzima málica. A ausência das proteínas Mig1 e Mig2 não altera os padrões de crescimento, produção de etanol e de marcação em metabólitos intracelulares de S. cerevisiae. Já a ausência de Hxk2, Reg1 ou Grr1 provoca alívio na repressão por glicose, observado pelo aumento das atividades respiratórias. / Metabolic Network Analysis was applied to the reference strain CEN.PK113-7D of Saccharomyces cerevisiae, as well as to some mutants disrupted in genes which code for regulatory proteins involved in the glucose repression cascade. All strains were cultivated under aerobic conditions, using minimal medium with [1-13C]glucose as the limiting substrate. Cells were harvested under balanced growth conditions and submitted to hydrolysis, derivatization and injection of the sample into a gas chromatograph coupled to a mass spectrometer for analysis of the labeling pattern in some fragments of intracellular metabolites. These data were used for identifying the activity of some pathways in the central metabolism of S. cerevisiae. Furthermore, using the data together with a stoichiometric model, it was possible to estimate the fluxes in the central metabolism of the reference strain and in the mutant strains. First, the methodology was validated for batch and continuous cultivations. Standard deviations were calculated for the measurement of the fractional labeling in each of the detected fragments. In the reference strain, it was observed that the Krebs cycle operates in a cyclic manner in respiratory cells, whereas it operates in a non cyclic manner under respiro-fermentative metabolism. It was also seen that a greater part of the glucose consumed by the cells enters the pentose phosphate pathway in the former than in the later case. Evidence for the activity of the threonine aldolase and the malic enzyme catalyzed reactions was also found. The absence of the Mig1 and Mig2 proteins does not alter the growth, ethanol formation and labeling pattern of intracellular metabolites in S. cerevisiae. In contrast, the absence of Hxk2, Reg1, or Grr1 provoques a relief in glucose repression, which was observed by an increased respiratory activity.

En esta tesis se abordan diferentes problemas de optimización dinámica de gran tamaño, desde una planta de tratamiento de gas natural como para un sistema biológico capaz de producir de etanol. En todos los casos resueltos durante esta tesis se transformaron los problemas diferenciales-algebraicos en problemas no lineales mediante la aplicación de estrategias de discretización ortogonal en un enfoque simultáneo. Se desarrolla un modelo dinámico basado en primeros principios que representa el sector criogénico de una planta de tratamiento de gas natural, se obtuvieron resultados satisfactorios de la comparación con datos experimentales aportados por una empresa actualmente en operación (TGS S.A.). Además, se resolvieron problemas de optimización dinámica que abordan problemas de controlabilidad y mejoras en la eficiencia del sector criogénico de la planta. En este problema de gran tamaño se explotaron las propiedades de los códigos, solvers, plataformas y terceras dependencias utilizados en la búsqueda de la solución óptima en el menor tiempo computacional posible, arrojando resultados que abren la posibilidad de expandir esta aplicación hacia problemas de Control Predictivo No Lineal o Control en Línea. En el caso del modelo dinámico que representa un sistema biológico para la producción de etanol, se obtuvieron resultados que concuerdan con los datos experimentales disponibles. Se resuelve un problema de estimación de parámetros que contribuye con nueva información de parámetros a la bibliografía. Además, se resolvió un problema de optimización dinámica que maximiza la producción de etanol mediante el control de grados de libertad propuestos en la tesis, consiguiendo un aumento considerable en la producción de etanol. En ambos problemas de optimización se desarrolla un modelodiferencial-algebraico que representa el medio extracelular y un modelo lineal que representa el modelado de las redes metabólicas para la cepa Synechocystis sp. PCC 6803. / This dissertation addresses different large-scale dynamic optimization problems, from a natural gas treatment plant to a biological system able of producing ethanol. During this thesis, all formulated differential-algebraic problems were transformed into non-linear problems by the application of orthogonal discretization strategies in a simultaneous approach. A dynamic model based on first principles that represents the cryogenic sector of a natural gas treatment plant was developed, obtaining satisfactory results from the comparison with experimental data contributed by a company currently under operation (TGS S.A.). In addition, dynamic optimization problems, which faced off controllability issues and improvements in the efficiency of cryogenic sector of the plant were solved. In this large-scale problem, codes, solvers, platforms and third parties dependencies properties were exploited looking for optimal solutions in the shortest time, getting results that open the possibility of expanding this application to Non-Linear Model Predictive Control or Online Control problems. In the case of the dynamic model that represents a biological system for ethanol productions, the results obtained have good agreement with experimental data available. A parameter estimation problem that contributes with new information to the bibliography was solved. Besides, in this thesis a dynamic optimization problem was solved which maximize ethanol production through controlling degrees of freedom proposed, achieving a considerable increment in the ethanol production. In both large-scale optimization problems, a differential-algebraic model was developed that represents the extracellular medium and a linear model that characterizes the metabolic networks model for the Synechocystis sp. PCC 6803 strain.