Orientador: Pedro Ribas Werner / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Agrarias / Estudou-se a histologia e a ultraestrutura do tentáculo e da região anterior do pé de B. occidentalis, espécie de planorbídeo não suscetível ao S. mansoni. Os dois órgãos possuem os mesmos elementos celulares variando apenas a predominância de um e outro. A epiderme é composta por uma camada única de células prismáticas ciliadas, não ciliadas e glandulares globosas. As células não ciliadas compõem quase a totalidade da epiderme do tentáculo; sua superfície externa é recoberta por microvilos e numerosas mitocôndrias e vesículas de aspecto lisossomal concentram-se na porção apical da célula. As células ciliadas, características do pé, diferenciam-se das demais pela presença de cílios, cujas raízes longas e estriadas mantêm-se em contato através de pés basais. O tentáculo possui uma artéria central envolta por tecido conjuntivo denso e fibras musculares lisas circulares e longitudinais. Na porção sub-epidermal do tentáculo é característica a presença de tecido conjuntivo frouxo, formado pelas projeções citoplasmáticas de fibroblastos. O número de células secretárias sub-epidermais e de células sensoriais nervosas é reduzido. No pé, encontra-se tecido conjuntivo denso, com grande número de células com pigmento que parecem estar repletas de grânulos de melanina. Há uma grande concentração de células secretórias sub-epidermais, freqüentemente dispostas em grupos, com reações distintas ao P.A.S. As fibras musculares lisas são de espessura variada e não possuem orientação determinada / The normal histology and ultrastructure of the tentacle and anterior region of the foot of Biomphalaria occidentalis were studied. This species of planorbid is not susceptible to the infection of Schistosoma mansoni. Both organs were shown to have the same celular elements in variable proportions. The epidermis, in general, is composed by a single layer of tall columnar ciliated cells, non-ciliated cells and glandular goblet cells. The epidermis of the tentacle is almost entirely composed by non ciliated cells. These cells have their surface covered by microvilli and have numerous mitochondria and lysossomal-like vesicles in their apical regions. The ciliated cells, which are more numerous in the foot differenciate from the others by cilia whose roots are long and interconnected by basal feet. The tentacle has a single central artery surrounded by dense connective tissue and smooth muscle fibers disposed circular and longitudinally. The subepidermal portions of the tentacle characteristically has loose connective tissue, formed by the cytoplasmic projections of fibroblasts. Dense connective tissue is found in the foot and in the deep part of the tentacle. In In these regions, there are numerous pigment cells, which appear to be melanine laden. Subepidermal secretory cells and sensory cells are present in small numbers. In the foot there is a great concentration of subepidermal secretory cells, often in groups which react differently to the PAS staining technic. The smooth muscle fibers show variable thickness and do not have any orientation

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-13T16:56:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T16:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Translationally controlled tumor protein (TCTP) é uma proteína amplamente distribuída em eucariotos. Ela está envolvida na regulação de processos básicos como progressão do ciclo celular, crescimento celular, proteção contra estresses e apoptose. Durante a infecção de tomateiro (Solanum lycopersicum) e Nicotiana benthamiana pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus ocorre aumento dos níveis de seu mRNA. Plantas silenciadas para TCTP acumulam menos vírus do que plantas selvagens, mostrando que esta proteína é importante para a infecção por potyvírus. Neste trabalho, o envolvimento da TCTP na infecção por potyvírus foi analisado detalhadamente utilizando-se o potyvírus Turnip mosaic virus (TuMV). Em plantas de N. benthamiana silenciadas para TCTP também ocorre uma diminuição no acúmulo do TuMV quando comparado com plantas não silenciadas. Além disso, plantas superexpressando TCTP de maneira transiente acumularam mais vírus do que plantas controle, confirmando o efeito positivo desta proteína na infecção por diferentes espécies de potyvírus. Para analisar a localização subcelular de TCTP no contexto da infecção, TCTP fusionada a GFP foi co-expressa com TuMV/6K2:mCherry. TCTP co-localiza-se com as vesículas replicativas e com estrutura a globular perinuclear tipicamente observada em células infectadas. O fracionamento de proteínas celulares demonstrou que TCTP está predominantemente na fração solúvel e uma pequena porção se associa com membranas, tanto em plantas sadias quanto em plantas infectadas. A co- localização com vesículas marcadas por 6K2 e a presença de TCTP em frações membranosas da célula sugerem um possível envolvimento desta proteína na replicação viral. Para verificar esta hipótese, protoplastos obtidos a partir de plantas silenciadas para TCTP foram infectados com TuMV e com o mutante TuMV VNN , o qual não é capaz de replicar-se. Os resultados demonstraram que o acúmulo de TuMV é reduzido em protoplastos silenciados, indicando que TCTP é necessária para a replicação. O acúmulo da proteína TCTP durante a infecção também foi avaliado. A infecção viral induz o aumento dos níveis de mRNA mas não de proteína, sugerindo que o mRNA que codifica TCTP atue na replicação. Desta forma, foi analisado se expressão de um RNA não traduzível de TCTP possui efeito sobre a infecção viral. Os resultados mostraram que apenas a expressão de um RNA traduzível é capaz de aumentar a infecção viral, indicando que a proteína TCTP, ou que a tradução se seu mRNA, é importante para a replicação viral. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is widely distributed among eukaryotes. It is involved in the regulation of basic processes such as cell cycle progression, cell growth, stress protection and apoptosis. During tomato (Solanum lycopersicum) and Nicotiana benthamiana infection by the potyvirus Pepper yellow mosaic virus, an increase of TCTP mRNA levels was observed. Plants silenced for TCTP accumulate fewer viruses than control plants, showing the importance of that gene for potyvirus infection. In this work, TCTP involvement in potyvirus infection was analyzed in details using the potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV). N. benthamiana plants silenced for TCTP accumulated fewer viruses than non-silenced plants. In addition, plants overexpressing TCTP transiently accumulated more viruses than control plants, confirming that TCTP has a positive effect on infection by different potyviruses. To study TCTP subcellular localization in potyvirus infected plants, TCTP fused to GFP was co- expressed with TuMV/6K2:mCherry. Confocal analysis has shown that TCTP co- localizes with 6K2-tagged structures such as replicative vesicles and the perinuclear globular structure that is typically observed in potyvirus-infected cells. Cellular fractioning demonstrated that TCTP is mainly present in the soluble fraction but is also associated with membranes. The co-localization of TCTP with 6K2-tagged vesicles and its presence in cellular membranous fractions suggests a possible involvement of TCTP in virus replication. To test this hypothesis, protoplasts obtained from TCTP silenced plants were infected with TuMV and its mutant TuMV VNN , which is defective for replication. The results showed that TuMV accumulation is reduced in silenced protoplasts, indicating that TCTP is necessary for replication. TCTP accumulation during infection was also analyzed. Viral infection induces TCTP mRNA expression, but not protein accumulation, suggesting that the TCTP mRNA and not the protein has a role in viral infection. To check this, we expressed a non-translatable form of TCTP RNA in plants and analyzed its effect in virus accumulation. The results showed that only the expression of a translatable RNA resulting in protein production is able to increase virus infection, indicating that the protein and/or the translation of TCTP is important for potyvirus replication.

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Shigella sp causam disenteria bacilar que é caracterizada pela invasão e destruição da mucosa do cólon humano. Amostras de EIEC possuem características bioquímicas, genéticas patogênicas semelhantes às espécies de Shigella, porém a doença causada por EIEC se apresenta numa forma mais branda e autolimitante. As células do epitélio intestinal participam ativamente da imunidade da mucosa, expressando e secretando uma série de mediad ores inflamatórios como citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e óxido nítrico. Para melhor entendimento da patogênese de EIEC, estudamos a resposta inflamatória modulada por este microrganismo em células epiteliais intestinais da linhagem Caco-2, comparando-a com Shigella flexneri. Células Caco-2 foram infectadas com EIEC ou S. flexneri por diferentes intervalos de tempo, para posterior analise da capacidade de invasão e disseminação bacterianas (UFC, PLAQUE ASSA Y), indução de morte celular (FACS), analise relativa de genes envolvidos no reconhecimento bacteriano e na resposta inflamatória (RT-PCR, RPA), dosagem de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (ELISA) e óxido nítrico (GRIESS). Neste trabalho foi possível observar que: (i) a capacidade de disseminação e (ii) a indução da morte celular em células Caco-2 foi significativamente maior na infecção por S. flexneri do que EIEC; (iii) há diferenças em relação à expressão relativa de genes das células Caco-2 envolvidos no reconhecimento das duas cepas bacterianas. Foi evidenciado o papel essencial dos receptores intracelulares no reconhecimento bacteriano das células Caco-2, sendo a expressão relativa do mRNA do receptor intracelular Nod1 foi maior para EIEC quando comparado com S. flexneri; (iv) há diferenças significativas na cinética de produção de NO pelas células Caco¬2 infectadas, em que EIEC induziu mais precocemente a produção de NO quando comparado com S. flexneri. Estes dados sinalizam que as células epiteliais intestinais reconhecem e respondem de forma diferente frente a essas duas espécies bacterianas, apresentando uma resposta inflamatória mais eficiente no controle da infecção induzida por EIEC. / Escherichia coli enteroinvasive (EIEC) and Shigella sp cause bacillary dysentery which is characterized by the invasion and destruction of the human colon mucosa. Samples of EIEC have characteristics biochemical, genetic and pathogenic similar to those of Shigella species, however the disease caused by EIEC is more lenient. The cells of the intestinal epithelium actively participate in the mucosal immunity by expression and production of several inflammatory mediators such as cytokines, chemokines, adhesion molecules and nitric oxide. For better understanding of the EIEC pathogenesis, we studied the inflammatory response modulated by this microorganism in intestinal epithelial cells Caco-2, comparing it with Shigella flexneri. Caco-2 cells were infected with EIEC or S. flexneri during different intervals of time and analyzed the invasiveness and spread bacteria capacity (CFU, PLAQUE ASSAY), induction of cell death (FACS), analysis of genes involved in the recognition of bacterial and inflammatory response (RT-PCR, RPA), production of pro-inflammatory cytokines and chemokines (ELISA) and nitric oxide (NO) (GRIESS). In this work was possible to observe that: (i) the ability to spread and (ii) the induction of cell death in Caco-2 cells was significantly higher in S. flexneri infection than EIEC, (iii) there are differences regarding the relative expression of genes of Caco-2 cells involved in the recognition of two bacterial strains. It was highlighted the essential role of intracellular receptors in recognition of bacterial by Caco-2 cells, and the expression of mRNA of the intracellular receptor Nod 1 was higher for EIEC when compared with S. flexneri, (iv) there are significant differences in the kinetics of NO production by Caco-2 infected cells, EIEC induced a early NO production when compared with S. flexneri. These data indicate that the intestinal epithelial cells recognize and respond in a different way to these bacterial species and induce an inflammatory response more efficient in control of the infection induced by EIEC.

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Shigella sp causam disenteria bacilar que é caracterizada pela invasão e destruição da mucosa do cólon humano. Amostras de EIEC possuem características bioquímicas, genéticas patogênicas semelhantes às espécies de Shigella, porém a doença causada por EIEC se apresenta numa forma mais branda e autolimitante. As células do epitélio intestinal participam ativamente da imunidade da mucosa, expressando e secretando uma série de mediad ores inflamatórios como citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e óxido nítrico. Para melhor entendimento da patogênese de EIEC, estudamos a resposta inflamatória modulada por este microrganismo em células epiteliais intestinais da linhagem Caco-2, comparando-a com Shigella flexneri. Células Caco-2 foram infectadas com EIEC ou S. flexneri por diferentes intervalos de tempo, para posterior analise da capacidade de invasão e disseminação bacterianas (UFC, PLAQUE ASSA Y), indução de morte celular (FACS), analise relativa de genes envolvidos no reconhecimento bacteriano e na resposta inflamatória (RT-PCR, RPA), dosagem de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (ELISA) e óxido nítrico (GRIESS). Neste trabalho foi possível observar que: (i) a capacidade de disseminação e (ii) a indução da morte celular em células Caco-2 foi significativamente maior na infecção por S. flexneri do que EIEC; (iii) há diferenças em relação à expressão relativa de genes das células Caco-2 envolvidos no reconhecimento das duas cepas bacterianas. Foi evidenciado o papel essencial dos receptores intracelulares no reconhecimento bacteriano das células Caco-2, sendo a expressão relativa do mRNA do receptor intracelular Nod1 foi maior para EIEC quando comparado com S. flexneri; (iv) há diferenças significativas na cinética de produção de NO pelas células Caco¬2 infectadas, em que EIEC induziu mais precocemente a produção de NO quando comparado com S. flexneri. Estes dados sinalizam que as células epiteliais intestinais reconhecem e respondem de forma diferente frente a essas duas espécies bacterianas, apresentando uma resposta inflamatória mais eficiente no controle da infecção induzida por EIEC. / Escherichia coli enteroinvasive (EIEC) and Shigella sp cause bacillary dysentery which is characterized by the invasion and destruction of the human colon mucosa. Samples of EIEC have characteristics biochemical, genetic and pathogenic similar to those of Shigella species, however the disease caused by EIEC is more lenient. The cells of the intestinal epithelium actively participate in the mucosal immunity by expression and production of several inflammatory mediators such as cytokines, chemokines, adhesion molecules and nitric oxide. For better understanding of the EIEC pathogenesis, we studied the inflammatory response modulated by this microorganism in intestinal epithelial cells Caco-2, comparing it with Shigella flexneri. Caco-2 cells were infected with EIEC or S. flexneri during different intervals of time and analyzed the invasiveness and spread bacteria capacity (CFU, PLAQUE ASSAY), induction of cell death (FACS), analysis of genes involved in the recognition of bacterial and inflammatory response (RT-PCR, RPA), production of pro-inflammatory cytokines and chemokines (ELISA) and nitric oxide (NO) (GRIESS). In this work was possible to observe that: (i) the ability to spread and (ii) the induction of cell death in Caco-2 cells was significantly higher in S. flexneri infection than EIEC, (iii) there are differences regarding the relative expression of genes of Caco-2 cells involved in the recognition of two bacterial strains. It was highlighted the essential role of intracellular receptors in recognition of bacterial by Caco-2 cells, and the expression of mRNA of the intracellular receptor Nod 1 was higher for EIEC when compared with S. flexneri, (iv) there are significant differences in the kinetics of NO production by Caco-2 infected cells, EIEC induced a early NO production when compared with S. flexneri. These data indicate that the intestinal epithelial cells recognize and respond in a different way to these bacterial species and induce an inflammatory response more efficient in control of the infection induced by EIEC.