A replicação do DNA tem início nas origens de replicação que são licenciadas na transição das fases M/G1, pelo complexo de pré-replicação (CPR), e ativadas apenas na fase S. Existem diversas origens de replicação no genoma, mas apenas parte destas origens é disparada em diferentes momentos de S, havendo assim origens early (disparadas no início de S) e late (disparadas mais tardiamente). Em trypanosomas as origens de replicação são reconhecidas por um CPR formado por Orc1/Cdc6 e pelo complexo MCM2-7. Em T. cruzi observamos que existem dois mecanismos diferentes para controlar a replicação do DNA. Durante o ciclo celular da forma epimastigota, as proteínas do CPR são sempre expressas e ligadas ao DNA, mas durante o ciclo de vida Orc1/Cdc6 se liga ao DNA apenas nas formas que replicam, e Mcm7 não é expressa nas que não replicam. Também foi analisado o perfil das forquilhas de replicação em T. brucei utilizando a técnica de SMARD onde vimos que a velocidade da forquilha é semelhante a dos demais eucariontes, além de encontrarmos a primeira origem de replicação late. / The DNA replication starts at the origins of replication, which are licensed at M/G1 transition, by the pre replication complex (PRC), and are activated just at S phase. There are many origins of replication along genome, but some of them are fired at different moments of S phase. So there are early and late origins fired at the beginning or later in S phase, respectively. The PRC of trypanosomes is composed of Orc1/Cdc6 and Mcm2-7. We could observe that in T. cruzi there are two distinct ways to control DNA replication. Whereas in epimastigote cell cycle the PRC are expressed and bound to DNA in all phases, during T. cruzi life cycle Orc1/Cdc6 is bound to DNA only in replicative forms and Mcm7 is absent in the non-replicative forms. We also analyzed the fork profile in T. brucei through SMARD technique. We found that the speed of replication fork is similar from other eukaryotes and that different replication origins are fired every cell cycle. Finally, we found a new origin of replication that is the first late origin described in this organism.

O presente trabalho busca revisar o conceito de interação gene-ambiente na etiologia da depressão maior em jovens e apresentar os resultados de uma tentativa de replicação dos resultados do estudo que originalmente identificou uma interação gene-ambiente (GxE) mensurável no desenvolvimento de quadros depressivos. Na busca pelas origens dos quadros depressivos, em um estudo com modelo inovador, Caspi et al. (2003) identificaram uma interrelação de variáveis genéticas e ambientais no mecanismo causal da depressão maior. O conceito de GxE foi alvo de intenso debate após sua primeira identificação, mantendo-se contraditório mesmo após a realização de três meta-análises. O artigo aqui apresentado buscou avaliar se a associação entre maus tratos na infância e episódio depressivo em jovens era moderada por um polimorfismo da região promotora do gene do transportador da serotonina (5-HTTLPR), assim como identificado no estudo original, desta vez em um contexto sociocultural distinto. Em uma coorte representativa da cidade de Pelotas/RS, seguida prospectivamente desde o nascimento, 5.249 indivíduos foram acompanhados até a idade de 18 anos (com uma taxa de retenção de 81,3%). As associações foram investigadas com análises de regressão logística e controle dos potenciais fatores de confusão. Os resultados replicaram integralmente as principais conclusões do estudo pioneiro, apesar das diferenças socioculturais. Houve uma modificação na relação dose-resposta entre maus tratos na infância e depressão maior de acordo com o genótipo 5-HTTLPR. Utilizando a estratégia de investigação mais semelhante possível, os principais resultados do estudo original puderam ser replicados em uma grande amostra de um contexto sociocultural totalmente diferente, reforçando a relevância da GxE na etiologia da depressão maior. / This study aims to review the concept of gene-environment interaction in the etiology of major depression among youth and present the results of an attempt to replicate the study that originally identified a measurable gene-environment interaction (GxE) in the development of depressive disorders. Searching the origins of depressive disorders, in an innovative framework, Caspi et al. (2003) identified an interplay of genetic and environmental variables in the causal mechanism of major depression. The concept of GxE was focus of intense debate after its first identification, keeping contradictory, even after completion of three metaanalyses. The article presented here sought to evaluate whether the association between childhood maltreatment and youth depressive episodes was moderated by a polymorphism in the promoter region of the serotonin transporter gene (5-HTTLPR), as identified in the original study, this time in a distinct socio-cultural context. In a representative cohort from the city of Pelotas/RS, followed prospectively from birth, 5,249 individuals were followed until the age of 18 years (with a retention rate of 81.3%). Associations were investigated with logistic regression analyses and control for potential confounders. The results fully replicated the main findings of the original study, despite socio-cultural differences. There was a modification in the dose-response relationship between childhood maltreatment and major depression according to the 5-HTTLPR genotype. Using the most similar research strategy possible, all the main results of the original study could be replicated in a large sample of a totally different sociocultural context, reinforcing the importance of GxE in the etiology of major depression.

O presente trabalho busca revisar o conceito de interação gene-ambiente na etiologia da depressão maior em jovens e apresentar os resultados de uma tentativa de replicação dos resultados do estudo que originalmente identificou uma interação gene-ambiente (GxE) mensurável no desenvolvimento de quadros depressivos. Na busca pelas origens dos quadros depressivos, em um estudo com modelo inovador, Caspi et al. (2003) identificaram uma interrelação de variáveis genéticas e ambientais no mecanismo causal da depressão maior. O conceito de GxE foi alvo de intenso debate após sua primeira identificação, mantendo-se contraditório mesmo após a realização de três meta-análises. O artigo aqui apresentado buscou avaliar se a associação entre maus tratos na infância e episódio depressivo em jovens era moderada por um polimorfismo da região promotora do gene do transportador da serotonina (5-HTTLPR), assim como identificado no estudo original, desta vez em um contexto sociocultural distinto. Em uma coorte representativa da cidade de Pelotas/RS, seguida prospectivamente desde o nascimento, 5.249 indivíduos foram acompanhados até a idade de 18 anos (com uma taxa de retenção de 81,3%). As associações foram investigadas com análises de regressão logística e controle dos potenciais fatores de confusão. Os resultados replicaram integralmente as principais conclusões do estudo pioneiro, apesar das diferenças socioculturais. Houve uma modificação na relação dose-resposta entre maus tratos na infância e depressão maior de acordo com o genótipo 5-HTTLPR. Utilizando a estratégia de investigação mais semelhante possível, os principais resultados do estudo original puderam ser replicados em uma grande amostra de um contexto sociocultural totalmente diferente, reforçando a relevância da GxE na etiologia da depressão maior. / This study aims to review the concept of gene-environment interaction in the etiology of major depression among youth and present the results of an attempt to replicate the study that originally identified a measurable gene-environment interaction (GxE) in the development of depressive disorders. Searching the origins of depressive disorders, in an innovative framework, Caspi et al. (2003) identified an interplay of genetic and environmental variables in the causal mechanism of major depression. The concept of GxE was focus of intense debate after its first identification, keeping contradictory, even after completion of three metaanalyses. The article presented here sought to evaluate whether the association between childhood maltreatment and youth depressive episodes was moderated by a polymorphism in the promoter region of the serotonin transporter gene (5-HTTLPR), as identified in the original study, this time in a distinct socio-cultural context. In a representative cohort from the city of Pelotas/RS, followed prospectively from birth, 5,249 individuals were followed until the age of 18 years (with a retention rate of 81.3%). Associations were investigated with logistic regression analyses and control for potential confounders. The results fully replicated the main findings of the original study, despite socio-cultural differences. There was a modification in the dose-response relationship between childhood maltreatment and major depression according to the 5-HTTLPR genotype. Using the most similar research strategy possible, all the main results of the original study could be replicated in a large sample of a totally different sociocultural context, reinforcing the importance of GxE in the etiology of major depression.

O presente trabalho busca revisar o conceito de interação gene-ambiente na etiologia da depressão maior em jovens e apresentar os resultados de uma tentativa de replicação dos resultados do estudo que originalmente identificou uma interação gene-ambiente (GxE) mensurável no desenvolvimento de quadros depressivos. Na busca pelas origens dos quadros depressivos, em um estudo com modelo inovador, Caspi et al. (2003) identificaram uma interrelação de variáveis genéticas e ambientais no mecanismo causal da depressão maior. O conceito de GxE foi alvo de intenso debate após sua primeira identificação, mantendo-se contraditório mesmo após a realização de três meta-análises. O artigo aqui apresentado buscou avaliar se a associação entre maus tratos na infância e episódio depressivo em jovens era moderada por um polimorfismo da região promotora do gene do transportador da serotonina (5-HTTLPR), assim como identificado no estudo original, desta vez em um contexto sociocultural distinto. Em uma coorte representativa da cidade de Pelotas/RS, seguida prospectivamente desde o nascimento, 5.249 indivíduos foram acompanhados até a idade de 18 anos (com uma taxa de retenção de 81,3%). As associações foram investigadas com análises de regressão logística e controle dos potenciais fatores de confusão. Os resultados replicaram integralmente as principais conclusões do estudo pioneiro, apesar das diferenças socioculturais. Houve uma modificação na relação dose-resposta entre maus tratos na infância e depressão maior de acordo com o genótipo 5-HTTLPR. Utilizando a estratégia de investigação mais semelhante possível, os principais resultados do estudo original puderam ser replicados em uma grande amostra de um contexto sociocultural totalmente diferente, reforçando a relevância da GxE na etiologia da depressão maior. / This study aims to review the concept of gene-environment interaction in the etiology of major depression among youth and present the results of an attempt to replicate the study that originally identified a measurable gene-environment interaction (GxE) in the development of depressive disorders. Searching the origins of depressive disorders, in an innovative framework, Caspi et al. (2003) identified an interplay of genetic and environmental variables in the causal mechanism of major depression. The concept of GxE was focus of intense debate after its first identification, keeping contradictory, even after completion of three metaanalyses. The article presented here sought to evaluate whether the association between childhood maltreatment and youth depressive episodes was moderated by a polymorphism in the promoter region of the serotonin transporter gene (5-HTTLPR), as identified in the original study, this time in a distinct socio-cultural context. In a representative cohort from the city of Pelotas/RS, followed prospectively from birth, 5,249 individuals were followed until the age of 18 years (with a retention rate of 81.3%). Associations were investigated with logistic regression analyses and control for potential confounders. The results fully replicated the main findings of the original study, despite socio-cultural differences. There was a modification in the dose-response relationship between childhood maltreatment and major depression according to the 5-HTTLPR genotype. Using the most similar research strategy possible, all the main results of the original study could be replicated in a large sample of a totally different sociocultural context, reinforcing the importance of GxE in the etiology of major depression.

A replicação do DNA tem início nas origens de replicação que são licenciadas na transição das fases M/G1, pelo complexo de pré-replicação (CPR), e ativadas apenas na fase S. Existem diversas origens de replicação no genoma, mas apenas parte destas origens é disparada em diferentes momentos de S, havendo assim origens early (disparadas no início de S) e late (disparadas mais tardiamente). Em trypanosomas as origens de replicação são reconhecidas por um CPR formado por Orc1/Cdc6 e pelo complexo MCM2-7. Em T. cruzi observamos que existem dois mecanismos diferentes para controlar a replicação do DNA. Durante o ciclo celular da forma epimastigota, as proteínas do CPR são sempre expressas e ligadas ao DNA, mas durante o ciclo de vida Orc1/Cdc6 se liga ao DNA apenas nas formas que replicam, e Mcm7 não é expressa nas que não replicam. Também foi analisado o perfil das forquilhas de replicação em T. brucei utilizando a técnica de SMARD onde vimos que a velocidade da forquilha é semelhante a dos demais eucariontes, além de encontrarmos a primeira origem de replicação late. / The DNA replication starts at the origins of replication, which are licensed at M/G1 transition, by the pre replication complex (PRC), and are activated just at S phase. There are many origins of replication along genome, but some of them are fired at different moments of S phase. So there are early and late origins fired at the beginning or later in S phase, respectively. The PRC of trypanosomes is composed of Orc1/Cdc6 and Mcm2-7. We could observe that in T. cruzi there are two distinct ways to control DNA replication. Whereas in epimastigote cell cycle the PRC are expressed and bound to DNA in all phases, during T. cruzi life cycle Orc1/Cdc6 is bound to DNA only in replicative forms and Mcm7 is absent in the non-replicative forms. We also analyzed the fork profile in T. brucei through SMARD technique. We found that the speed of replication fork is similar from other eukaryotes and that different replication origins are fired every cell cycle. Finally, we found a new origin of replication that is the first late origin described in this organism.

Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.

Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.

O Complexo de pré-replicação em T.brucei é composto por Orc1/Cdc6 e as helicases MCMs. Em um trabalho anterior mostramos que TbOrc1/Cdc6 pode ligar e hidrolisar ATP in vitro. Neste sentido, o objetivo deste trabalho é avaliar a importância da hidrólise e ligação de ATP para a formação e estabilidade do complexo pré-replicação de T.brucei. Para tanto, foram geradas proteínas recombinantes Orc1/Cdc6 de T. brucei mutadas nas regiões Walker A (TbOrc1/Cdc6K79T) ou sensor 2 (TbOrc1/Cdc6R251,252E) incapazes de ligar ou hidrolisar ATP, respectivamente. Finalmente, as células expressando TbOrc1/Cdc6K79T ou TbOrc1/Cdc6R251,252E foram avaliadas quanto a (i ) estabilidade da interação Orc1/Cdc6 -DNA, (ii) capacidade de estabilizar MCM no DNA, (iii) capacidade de replicar seu DNA. A mutação na região sensor 2 de T.brucei (TbOrc1/Cdc6R251,252E) reduziu drasticamente a atividade de ATPase em comparação com a proteína selvagem . TbOrc1/Cdc6 mutado no sitio de ligação ao ATP perdeu a capacidade de interagir com o ATP (TbOrc1/Cdc6K79T). A super expressão desses genes inibiu de forma significativa a proliferação celular, causou ineficiência no carregamento de MCM para o DNA e ocasionou falhas na progressão do ciclo celular, atrasando a fase S. / The pre-replication complex in T.brucei is composed of at Orc1/Cdc6 and MCMs helicases. In a previous paper we showed that TbOrc1/Cdc6 can bind and hydrolyze ATP in vitro. Based on that, the objective of this study is to evaluate the importance of ATP binding and hydrolysis to the formation and stability of the pre - replication complex in T.brucei. For this purpose, T. brucei Orc1/Cdc6 recombinant proteins were generated mutated at regions on Walker A (TbOrc1/Cdc6K79T) and sensor 2 (TbOrc1/Cdc6R251 , 252E) in order to unable the ATP binding and hydrolyzation respectively . Finally , cells expressing TbOrc1/Cdc6K79T or TbOrc1/Cdc6R251 , 252E were evaluated for (i) stability of Orc1/Cdc6 - DNA interaction , (ii) ability to stabilize MCM in DNA , (iii) ability to replicate its DNA . The mutation in the sensor 2 region of T.brucei (TbOrc1/Cdc6R251 , 252E) drastically reduced the ATPase activity compared to the wild-type protein. TbOrc1/Cdc6 mutated in the ATP binding site has lost the ability to interact with ATP (TbOrc1/Cdc6K79T). The overexpression of these genes significantly inhibited cell proliferation causing inefficient loading of MCM DNA and led to failure in cell cycle progression by delaying the phase S.

O Complexo de pré-replicação em T.brucei é composto por Orc1/Cdc6 e as helicases MCMs. Em um trabalho anterior mostramos que TbOrc1/Cdc6 pode ligar e hidrolisar ATP in vitro. Neste sentido, o objetivo deste trabalho é avaliar a importância da hidrólise e ligação de ATP para a formação e estabilidade do complexo pré-replicação de T.brucei. Para tanto, foram geradas proteínas recombinantes Orc1/Cdc6 de T. brucei mutadas nas regiões Walker A (TbOrc1/Cdc6K79T) ou sensor 2 (TbOrc1/Cdc6R251,252E) incapazes de ligar ou hidrolisar ATP, respectivamente. Finalmente, as células expressando TbOrc1/Cdc6K79T ou TbOrc1/Cdc6R251,252E foram avaliadas quanto a (i ) estabilidade da interação Orc1/Cdc6 -DNA, (ii) capacidade de estabilizar MCM no DNA, (iii) capacidade de replicar seu DNA. A mutação na região sensor 2 de T.brucei (TbOrc1/Cdc6R251,252E) reduziu drasticamente a atividade de ATPase em comparação com a proteína selvagem . TbOrc1/Cdc6 mutado no sitio de ligação ao ATP perdeu a capacidade de interagir com o ATP (TbOrc1/Cdc6K79T). A super expressão desses genes inibiu de forma significativa a proliferação celular, causou ineficiência no carregamento de MCM para o DNA e ocasionou falhas na progressão do ciclo celular, atrasando a fase S. / The pre-replication complex in T.brucei is composed of at Orc1/Cdc6 and MCMs helicases. In a previous paper we showed that TbOrc1/Cdc6 can bind and hydrolyze ATP in vitro. Based on that, the objective of this study is to evaluate the importance of ATP binding and hydrolysis to the formation and stability of the pre - replication complex in T.brucei. For this purpose, T. brucei Orc1/Cdc6 recombinant proteins were generated mutated at regions on Walker A (TbOrc1/Cdc6K79T) and sensor 2 (TbOrc1/Cdc6R251 , 252E) in order to unable the ATP binding and hydrolyzation respectively . Finally , cells expressing TbOrc1/Cdc6K79T or TbOrc1/Cdc6R251 , 252E were evaluated for (i) stability of Orc1/Cdc6 - DNA interaction , (ii) ability to stabilize MCM in DNA , (iii) ability to replicate its DNA . The mutation in the sensor 2 region of T.brucei (TbOrc1/Cdc6R251 , 252E) drastically reduced the ATPase activity compared to the wild-type protein. TbOrc1/Cdc6 mutated in the ATP binding site has lost the ability to interact with ATP (TbOrc1/Cdc6K79T). The overexpression of these genes significantly inhibited cell proliferation causing inefficient loading of MCM DNA and led to failure in cell cycle progression by delaying the phase S.

O T. cruzi, é o agente causador da doença de Chagas. O estado redox NAD+/NADH intracelular é fundamental na manutenção do metabolismo celular. A GAPDH apresenta a função de proteção do telômero em mamíferos contra degradação, isto por causa de ligar se ao telômero. Aqui, mostramos que a GAPDH recombinante de T. cruzi (rTcGAPDH) interage com o DNA telomérico. A rTcGAPDH liga ao DNA de simples fita. Mostramos que a GAPDH liga ao DNA telomérico in vivo em células epimastigotas, onde a [NADH] é maior que [NAD+], mas a adição de NAD+ exógeno bloqueia esta interação. Corroborando a hipótese de que o equilíbrio NAD+/NADH determina a interação GAPDH-telômero, vimos que o tripomastigota tem maior [NAD+] intracelular que a [NADH] e a GAPDH não é capaz de ligar se ao DNA telomérico. Além disso, o NADH exógeno resgata a interação GAPDH-telómero nesta fase. É importante o equilíbrio NAD+/NADH desta interação em tripanosomas, sugerindo que a proteção do telômero do parasita pode ser regulada pelo estado metabólico das células. / The T. cruzi, is the causative agent of Chagas disease. The redox state of NAD+/NADH intracellular is critical in the maintenance of cellular metabolism. The GAPDH has the protection function of the telomere in mammals against degradation, because it is connecting to the telomere. Here we show the recombinant GAPDH of T. cruzi (rTcGAPDH) interacts with telomeric DNA. The rTcGAPDH binds to single-stranded DNA. We show GAPDH to bind to telomeric DNA in vivo epimastigotes cells, where [NADH] is greater than [NAD+], but the addition of exogenous NAD+ blocks this interaction. Corroborating the hypothesis that the NAD+/NADH balance determines the GAPDH-telomere interaction, we saw that the trypomastigote has higher [NAD+] that intracellular [NADH] and GAPDH is not able to connect to telomeric DNA. In addition, the exogenous NADH recovers the GAPDH-telomere interaction at this stage. It is important the NAD+/NADH balance this interaction in trypanosomes, suggesting that the protection of the telomere of the parasite can be regulated by the metabolic state of the cells.