Irradiamos amostras de DNA com luz UVA em diferentes condições para estudar os possíveis mecanismos envolvidos na indução de lesões de DNA por essa radiação. As lesões de DNA formadas após as irradiações foram quantificadas com enzimas de reparo de DNA que reconhecem e clivam os sítios contendo bases oxidadas e dímeros de pirimidina (CPDs). Complementando essas análises, foram realizados ensaios com anticorpos e HPLC-ED. NaCl e uma maior concentração de DNA são capazes de diminuir a indução de CPDs. Danos gerados por estresse oxidativo são inibidos na presença de azida de sódio e quelantes de metais, indicando o envolvimento de oxigênio singlete e reações de Fenton, na geração dessas lesões. Água deuterada e DNA mais concentrado aumentaram a indução de bases oxidadas. Quanto maior a quantidade de DNA irradiado, mais oxigênio singlete é formado, o que indica um possível mecanismo de fotossensibilização endógeno. / DNA samples were irradiated with UVA light in different conditions for studying the possible mechanisms involved in the induction of DNA lesions by this radiation. DNA lesions formed after irradiation were quantified with DNA repair enzymes, which recognize and cleave the sites containing oxidized bases and pyrimidine dimers (CPDs). Complementing these analyses, tests were performed with antibodies and HPLC-ED. NaCl and more concentrated DNA are capable of reducing the induction of CPDs. Damage caused by oxidative stress is inhibited in the presence of sodium azide and metal chelators, indicating the involvement of singlet oxygen and Fenton reactions, in the generation of these lesions. Deuterated water and more concentrated DNA increased the induction of oxidized bases. The bigger the amount of irradiated DNA, the more singlet oxygen is formed, which indicates a possible endogenous photosensitization mechanism.

Irradiamos amostras de DNA com luz UVA em diferentes condições para estudar os possíveis mecanismos envolvidos na indução de lesões de DNA por essa radiação. As lesões de DNA formadas após as irradiações foram quantificadas com enzimas de reparo de DNA que reconhecem e clivam os sítios contendo bases oxidadas e dímeros de pirimidina (CPDs). Complementando essas análises, foram realizados ensaios com anticorpos e HPLC-ED. NaCl e uma maior concentração de DNA são capazes de diminuir a indução de CPDs. Danos gerados por estresse oxidativo são inibidos na presença de azida de sódio e quelantes de metais, indicando o envolvimento de oxigênio singlete e reações de Fenton, na geração dessas lesões. Água deuterada e DNA mais concentrado aumentaram a indução de bases oxidadas. Quanto maior a quantidade de DNA irradiado, mais oxigênio singlete é formado, o que indica um possível mecanismo de fotossensibilização endógeno. / DNA samples were irradiated with UVA light in different conditions for studying the possible mechanisms involved in the induction of DNA lesions by this radiation. DNA lesions formed after irradiation were quantified with DNA repair enzymes, which recognize and cleave the sites containing oxidized bases and pyrimidine dimers (CPDs). Complementing these analyses, tests were performed with antibodies and HPLC-ED. NaCl and more concentrated DNA are capable of reducing the induction of CPDs. Damage caused by oxidative stress is inhibited in the presence of sodium azide and metal chelators, indicating the involvement of singlet oxygen and Fenton reactions, in the generation of these lesions. Deuterated water and more concentrated DNA increased the induction of oxidized bases. The bigger the amount of irradiated DNA, the more singlet oxygen is formed, which indicates a possible endogenous photosensitization mechanism.

Evidências experimentais e epidemiológicas sugerem que o Iicopeno e o β-caroteno, presentes em tomates, produtos de tomates, muitas frutas e vegetais, podem prevenir certos tipos de câncer em seres humanos. Entretanto, para estabelecer firmemente as relações do licopeno com a prevenção de doenças, maiores informações sobre os possíveis mecanismos bioquímicas associados a esses processos são necessárias. Com este intuito, investigamos o efeito do licopeno em células de mamífero e em ratos submetidos a excesso de ferro, sistema conhecido por promover o estresse oxidativo gerando lesões em biomoléculas. Inicialmente investigamos o efeito protetor do licopeno em lipoperoxidação e danos oxidativos em DNA de células de rim de macaco verde africano (linhagem CV1-P) expostas ao tratamento com nitrilotriacetato de ferro (Fe-NTA)/ascorbato. Constatamos que as células pré-tratadas com licopeno e· submetidas ao tratamento com Fe-NTA/ascorbato mostram uma redução de 86% na lipoperoxidação e redução em 77% na formação de 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo), quando comparadas com as células tratadas apenas com Fe-NTA/ascorbato. Considerando esses resultados, resolvemos seguir nossos estudos, in vivo, verificando se o pré-tratamento com licopeno e β-caroteno protegeria ratos Wistar, submetidos a tratamento com injeção intraperitonial de Fe-NTA, da lipoperoxidação, de danos oxidativos em DNA e de mudanças histopatológicas em fígado, rim, próstata e linfócitos. Comparados com os tecidos de ratos do grupo controle, o fígado, o rim, o pulmão, a próstata e os linfócitos de ratos tratados com Fe-NTA mostraram um aumento de 2-5 vezes na concentração de 8-oxodGuo e um aumento de 40-75% na concentração de malonaldeído (MOA). Concomitantes mudanças histopatológicas no rim e no fígado (necrose e esteatose) foram.também observadas. Com o pré-tratamento por cinco dias consecutivos com Iicopeno ou β-caroteno (10 mg/kg de massa corpórea, í.p), observamos completa prevenção dos danos oxidativos em DNA, da lipoperoxidação e das alterações histológicas nos tecidos estudados. Diversos estudos in vitro têm demonstrado a habilidade desses carotenóides em seqüestrar radicais peroxila e suprimir oxigênio singlete. O presente trabalho indica que essa ação antioxidante ocorre também em células e in vivo, através da proteção de lesões oxidativas em biomoléculas e danos em tecidos induzidos por ferro. Os dados apresentados contribuem para o esclarecimento da ação biológica dos carotenóides em organismos submetidos a sistemas que induzem o estresse oxidativo e suportam um dos possíveis mecanismos responsáveis pelo potencial anticâncer de carotenóides observados em estudos epidemiológicos. / Experimental and epidemiological evidences suggest that lycopene and β-carotene, carotenoids present in tomatoes, tomato products and several fruits and vegetables may play a role in preventing certain cancers in humans. However, to establish their role in health, more information is required to identify the biochemical mechanisms associated with these processes. With the aim of producing such information, we have first investigated the effect of lycopene on lipid peroxidation and on the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) in CV1-P monkey cells exposed to ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA) plus ascorbate. Cells supplemented with lycopene (20 fmol/106 cells) showed an approximate reduction of 80% in Fe-NTA/ascorbate-induced lipid peroxidation (TBARS). Levels of 8-oxodGuo in the cells increased over tenfold after treatment with Fe-NTA/ascorbate as compared to the control group. Lycopene supplementation decreased 8-oxodGuo in Fe-NTA/ascorbate-treated cells to approximately 70%. In arder to verify if these effects are also operative in vivo, we have investigated the effect of lycopene and β-carotene pre-treatment on lipid peroxidation, oxidative damage to DNA and histopathological changes in liver, kidney, lung, prostate and Iymphocytes of animais subjected to i.p. ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA) administration. Compared with control rats, liver of Fe-NTA treated animais showed a 2-5 fold increase in 8-oxodGuo level and 40-75 % increase in malodialdehyde (MDA) accumulation concomitant with tissue histopathological changes. Five days of lycopene and β-carotene pre-treatment (10 mg/kg body weight, i.p.) almost completely prevented liver biomolecule oxidative damage and protected the tissue against the observed histological alterations. In conclusion, it is shown that lycopene and β-carotene prevented oxidative damage to DNA, membranes and markedly reduced the histological changes induced by Fe-NTA. Inhibition of these oxidative processes by carotenoids is likely due to their ability to trap peroxyl radical and to quench singlet oxygen. The results described herein may contribute toward a better understanding of the biological mechanisms associated with the potential cancer-preventing property of carotenoids observed in epidemiological studies.

Evidências experimentais e epidemiológicas sugerem que o Iicopeno e o β-caroteno, presentes em tomates, produtos de tomates, muitas frutas e vegetais, podem prevenir certos tipos de câncer em seres humanos. Entretanto, para estabelecer firmemente as relações do licopeno com a prevenção de doenças, maiores informações sobre os possíveis mecanismos bioquímicas associados a esses processos são necessárias. Com este intuito, investigamos o efeito do licopeno em células de mamífero e em ratos submetidos a excesso de ferro, sistema conhecido por promover o estresse oxidativo gerando lesões em biomoléculas. Inicialmente investigamos o efeito protetor do licopeno em lipoperoxidação e danos oxidativos em DNA de células de rim de macaco verde africano (linhagem CV1-P) expostas ao tratamento com nitrilotriacetato de ferro (Fe-NTA)/ascorbato. Constatamos que as células pré-tratadas com licopeno e· submetidas ao tratamento com Fe-NTA/ascorbato mostram uma redução de 86% na lipoperoxidação e redução em 77% na formação de 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo), quando comparadas com as células tratadas apenas com Fe-NTA/ascorbato. Considerando esses resultados, resolvemos seguir nossos estudos, in vivo, verificando se o pré-tratamento com licopeno e β-caroteno protegeria ratos Wistar, submetidos a tratamento com injeção intraperitonial de Fe-NTA, da lipoperoxidação, de danos oxidativos em DNA e de mudanças histopatológicas em fígado, rim, próstata e linfócitos. Comparados com os tecidos de ratos do grupo controle, o fígado, o rim, o pulmão, a próstata e os linfócitos de ratos tratados com Fe-NTA mostraram um aumento de 2-5 vezes na concentração de 8-oxodGuo e um aumento de 40-75% na concentração de malonaldeído (MOA). Concomitantes mudanças histopatológicas no rim e no fígado (necrose e esteatose) foram.também observadas. Com o pré-tratamento por cinco dias consecutivos com Iicopeno ou β-caroteno (10 mg/kg de massa corpórea, í.p), observamos completa prevenção dos danos oxidativos em DNA, da lipoperoxidação e das alterações histológicas nos tecidos estudados. Diversos estudos in vitro têm demonstrado a habilidade desses carotenóides em seqüestrar radicais peroxila e suprimir oxigênio singlete. O presente trabalho indica que essa ação antioxidante ocorre também em células e in vivo, através da proteção de lesões oxidativas em biomoléculas e danos em tecidos induzidos por ferro. Os dados apresentados contribuem para o esclarecimento da ação biológica dos carotenóides em organismos submetidos a sistemas que induzem o estresse oxidativo e suportam um dos possíveis mecanismos responsáveis pelo potencial anticâncer de carotenóides observados em estudos epidemiológicos. / Experimental and epidemiological evidences suggest that lycopene and β-carotene, carotenoids present in tomatoes, tomato products and several fruits and vegetables may play a role in preventing certain cancers in humans. However, to establish their role in health, more information is required to identify the biochemical mechanisms associated with these processes. With the aim of producing such information, we have first investigated the effect of lycopene on lipid peroxidation and on the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) in CV1-P monkey cells exposed to ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA) plus ascorbate. Cells supplemented with lycopene (20 fmol/106 cells) showed an approximate reduction of 80% in Fe-NTA/ascorbate-induced lipid peroxidation (TBARS). Levels of 8-oxodGuo in the cells increased over tenfold after treatment with Fe-NTA/ascorbate as compared to the control group. Lycopene supplementation decreased 8-oxodGuo in Fe-NTA/ascorbate-treated cells to approximately 70%. In arder to verify if these effects are also operative in vivo, we have investigated the effect of lycopene and β-carotene pre-treatment on lipid peroxidation, oxidative damage to DNA and histopathological changes in liver, kidney, lung, prostate and Iymphocytes of animais subjected to i.p. ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA) administration. Compared with control rats, liver of Fe-NTA treated animais showed a 2-5 fold increase in 8-oxodGuo level and 40-75 % increase in malodialdehyde (MDA) accumulation concomitant with tissue histopathological changes. Five days of lycopene and β-carotene pre-treatment (10 mg/kg body weight, i.p.) almost completely prevented liver biomolecule oxidative damage and protected the tissue against the observed histological alterations. In conclusion, it is shown that lycopene and β-carotene prevented oxidative damage to DNA, membranes and markedly reduced the histological changes induced by Fe-NTA. Inhibition of these oxidative processes by carotenoids is likely due to their ability to trap peroxyl radical and to quench singlet oxygen. The results described herein may contribute toward a better understanding of the biological mechanisms associated with the potential cancer-preventing property of carotenoids observed in epidemiological studies.

Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-05-12T14:40:49Z No. of bitstreams: 1 GRAZZIELA ALVES FERREIRA DE OLIVEIRA.pdf: 1311794 bytes, checksum: 8d908f8c9a7e871fb05893c28b9e4771 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T14:40:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GRAZZIELA ALVES FERREIRA DE OLIVEIRA.pdf: 1311794 bytes, checksum: 8d908f8c9a7e871fb05893c28b9e4771 (MD5) Previous issue date: 2016-06-23 / Ionizing radiation, when interacting with matter, removes an electron from its orbital and generates ions or ionized particles. When an individual is exposed to ionizing radiation, reversible or irreversible harms to the body may arise, depending basically on the exposure time, level of injury, and absorbed dose. This study aimed to characterize the scientific literature on genetic damage caused by ionizing radiation, from 1970 to 2014, in order to verify trends and prospects of scientific development through scientometric analysis. This was accomplished through a literature search on the site Scopus® using the keywords "ionizing radiation” AND mutation AND effects AND human. Different approaches of paper assessment were carried out: type of publication, number of articles/year, number of publications per journal, organisms and conditions discussed in the studies. As a result, there was an increase in the number of publications related to DNA (Deoxyribonuclei acid) damage and ionizing radiation over the years. Most of the work was developed by authors from the US. Most papers correlated their findings to cancer development. It was also observed that there was an increase in the number of publications over the years, leading to the conclusion that there is interest in the study of DNA damage caused by ionizing radiation, since this damage may be responsible for numerous adverse biological effects on human health. / A radiação ionizante quando interage com a matéria remove um elétron de seu orbital, formando íons ou partículas ionizadas. Quando um indivíduo é exposto a radiações ionizantes, existe a possibilidade de se produzir danos para o organismo, danos reversíveis ou não, dependendo basicamente do tempo de exposição, do nível de dano e da dose absorvida. Esse trabalho teve como objetivo caracterizar a produção científica sobre danos genéticos causados por radiações ionizantes, desde o ano de 1970 até o ano de 2014 a fim de verificar as tendências e perspectivas do desenvolvimento científico por meio da análise cienciométrica. Para isso foi realizado um levantamento bibliográfico no sítio Scopus®, utilizando as palavras-chave "ionizing radiation” AND mutation AND effects AND human. Foram realizadas diferentes abordagens de avaliação sobre os artigos: tipo de publicação, número de artigos/ano, periódicos que mais publicaram, organismos e patologias abordados nos estudos. Como resultado, constatou-se um aumento no número de publicações relacionadas aos danos no DNA (Ácido Desoxirribonucleico) e radiação ionizante no decorrer dos anos. A maior parte dos trabalhos foi desenvolvida por autores de origem dos Estados Unidos da América. A maioria dos artigos relacionou seus achados ao desenvolvimento do câncer. Observou-se ainda que houve aumento no número de publicações ao longo dos anos, concluindo que há interesse em relação ao estudo de danos no DNA causados por radiação ionizante, uma vez que estes danos podem ser responsáveis por inúmeros efeitos biológicos desfavoráveis à saúde humana.

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e o fator limitante na terapia antitumoral é a resistência a processos terapêuticos. Diversos são os mecanismos de resistência à drogas antitumorais e é fundamental desvendar os mecanismos envolvidos na quimiorresistência para eliminá-lo e ter-se uma melhor eficácia terapêutica. Nesse trabalho investigamos os mecanismos que determinam resistência a cisplatina em células de glioma. Primeiramente, mostramos que a resistência celular a cisplatina era independente de p53, capacidade de reparo de DNA. Utilizando modelo in vitro e in vivo foi demonstrado que os níveis de glutationa (GSH) tinha papel fundamental na resistência a cisplatina e temozolamida (TMZ). A linhagem de glioma resistente a TMZ tinha maior proteção antioxidante, maior expressão do fator de transcrição NRF2, GCLM e GST (envolvidos na geração e utilização de GSH). Utilizando modelo in vitro e in vivo mostramos que BSO (inibidor da síntese de GSH) potencializava o efeito tóxico do TMZ. Assim, a combinação de BSO com cisplatina e TMZ é uma abordagem poderosa para otimizar a citotoxicidade em tumores, sendo uma alternativa excitante para o tratamento de pacientes com glioma ou melanoma. / Cancer is one of main cause of death worldwide and the limiting factor is antitumoral therapy resistance. Several mechanisms command drug resistance and fundamental question is how is to unveil the mechanisms involved in it to get a better therapeutic efficacy. We investigated the mechanisms of cisplatin resistance in glioma cells. We demonstrated that cisplatin resistance was p53 independent and DNA repair capacity. It was demonstrated in a in vitro a in vivo model that gluthatione (GSH) is the major resistant factor for cisplatin and temozolomide (TMZ). We observed that the TMZ resistant glioma cell line counted with a high expression of the antioxidant transcription factor NFR2, GCLM and GST. We observed that NFR2 silencing greatly enhanced cell death, high levels of DNA damage upon TMZ treatment. In addition, BSO potentiated TMZ killing in human and murine melanoma using in vitro and in vivo models. Thus, combination of BSO, cisplatin and TMZ is a powerful strategy to optimize tumor killing, thus providing an exciting alternative therapeutic protocol to glioma and melanoma patients.

Orientador: Ilda de Godoy / Resumo: O tabagismo é responsável pelo maior número de mortes evitáveis ​​no mundo e está relacionado ao desenvolvimento de várias doenças, principalmente a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Assim, a busca por biomarcadores precoces torna-se relevante para sua identificação e para o sucesso terapêutico. Os objetivos do nosso estudo foram avaliar a concentração da proteína de choque térmico 70 (HSP70), expressão do gene HSP70, anticorpos anti-HSP70 auto, marcador inflamatório sistêmico através da citocina interleucina-8 (IL-8) e proteína C reativa (PCR), alterações imunológicas e danos no DNA no sangue periférico de fumantes crônicos assintomáticos e não fumantes. Nossos resultados mostraram concentrações séricas aumentadas de HSP70, anti-HSP70, IL-8, PCR e neutrófilos, e danos no DNA de células sanguíneas de fumantes em comparação ao não-fumantes. Portanto, o tabagismo foi responsável por levar a alteração nos parâmetros fisiológicos e moleculares associados ao risco de desenvolver DPOC e outras doenças pulmonares. Com base nos dados, sugerimos que a HSP70 pode ser responsável pelo aumento dos níveis de citocinas inflamatórias e, consequentemente, o aumento do influxo de neutrófilos para os pulmões e aumento dos danos ao DNA e auto-anticorpos anti-HSP70. / Abstract: Smoking is responsible for the largest number of preventable deaths in the world, and is related to the development of several diseases, mainly chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Thus, the search for early biomarkers of such diseases becomes relevant for their identification and for successful therapy. The objectives of our study were to evaluate the concentration of heat shock protein 70 (HSP70), expression of the HSP70 gene, anti-HSP70 auto antibodies, the systemic inflammatory marker through cytokine interleukin-8 (IL-8) and CPR, immunological changes and DNA damage in peripheral blood of chronic asymptomatic smokers and non-smokers. Our results showed increased serum concentrations of HSP70, anti-HSP70, IL-8, CPR and neutrophils, and DNA damage in blood cells of smokers than in non-smokers. Therefore, cigarette smoking was confirmed as a noxious agent on physiological and molecular parameters associated with the risk for developing COPD and other lung diseases. Based on the data we suggest that HSP70 can be responsible for the increased levels of inflammatory cytokines, and consequently, the increased influx of neutrophils into the lungs and increased DNA damages e anti-HSP70 auto antibodies. / Doutor

Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e o fator limitante na terapia antitumoral é a resistência a processos terapêuticos. Diversos são os mecanismos de resistência à drogas antitumorais e é fundamental desvendar os mecanismos envolvidos na quimiorresistência para eliminá-lo e ter-se uma melhor eficácia terapêutica. Nesse trabalho investigamos os mecanismos que determinam resistência a cisplatina em células de glioma. Primeiramente, mostramos que a resistência celular a cisplatina era independente de p53, capacidade de reparo de DNA. Utilizando modelo in vitro e in vivo foi demonstrado que os níveis de glutationa (GSH) tinha papel fundamental na resistência a cisplatina e temozolamida (TMZ). A linhagem de glioma resistente a TMZ tinha maior proteção antioxidante, maior expressão do fator de transcrição NRF2, GCLM e GST (envolvidos na geração e utilização de GSH). Utilizando modelo in vitro e in vivo mostramos que BSO (inibidor da síntese de GSH) potencializava o efeito tóxico do TMZ. Assim, a combinação de BSO com cisplatina e TMZ é uma abordagem poderosa para otimizar a citotoxicidade em tumores, sendo uma alternativa excitante para o tratamento de pacientes com glioma ou melanoma. / Cancer is one of main cause of death worldwide and the limiting factor is antitumoral therapy resistance. Several mechanisms command drug resistance and fundamental question is how is to unveil the mechanisms involved in it to get a better therapeutic efficacy. We investigated the mechanisms of cisplatin resistance in glioma cells. We demonstrated that cisplatin resistance was p53 independent and DNA repair capacity. It was demonstrated in a in vitro a in vivo model that gluthatione (GSH) is the major resistant factor for cisplatin and temozolomide (TMZ). We observed that the TMZ resistant glioma cell line counted with a high expression of the antioxidant transcription factor NFR2, GCLM and GST. We observed that NFR2 silencing greatly enhanced cell death, high levels of DNA damage upon TMZ treatment. In addition, BSO potentiated TMZ killing in human and murine melanoma using in vitro and in vivo models. Thus, combination of BSO, cisplatin and TMZ is a powerful strategy to optimize tumor killing, thus providing an exciting alternative therapeutic protocol to glioma and melanoma patients.