A luz ultravioleta (UV) bloqueia a replicação e transcrição devido à formação de lesões que distorcem o DNA. Descobrimos que a depleção da quinase ATR promove a indução precoce de apoptose após irradiação com luz UVB em fibroblastos humanos imortalizados com SV40 e que mesmo células proficientes em reparo de DNA e síntese translesão foram incapazes de alcançar a mitose após depleção de ATR. Essa quinase também representa um alvo promissor para sensibilizar tumores com mutações em p53 ao quimioterápico cisplatina e ao indutor de estresse oxidativo cloroquina. Além do bloqueio da replicação, danos no DNA bloqueiam a síntese de RNA. Utilizamos sequenciamento para mapear RNA nascentes e analisar a recuperação da transcrição em escala genômica. Genes mais longos são mais inibidos por luz UV, mas o nível de expressão gênica não contribui para a recuperação da transcrição. Além disso, o reparo de DNA é similar entre genes com recuperação da transcrição distinta e outras regulações, além da remoção de lesões no DNA, devem existir para que a síntese de RNA recomece. / Ultraviolet (UV) light stalls replication and transcription due to the formation of lesions that distort DNA. We found that ATR silencing promotes early induction of apoptosis after UVB light in human fibroblasts immortalized with SV40 and even cells proficient in DNA repair and translesion synthesis were unable to reach mitosis after ATR depletion. This kinase is also a promising target for sensitizing tumors with p53 mutations to chemotherapeutic that block replication, such as cisplatin, and the oxidative stress inducer chloroquine. In addition to blocking the replication, DNA damage arrest the synthesis of RNA. We used next-generation sequencing to map and analyze the nascent RNA transcription recovery genome-wide. We confirmed that longer genes are more inhibited following UV light, however, the level of gene expression does not contribute to the recovery of transcription. Moreover, DNA repair is similar among genes with different recovery of transcription and further regulation, besides DNA damage removal, must exist to promote resumption of RNA synthesis.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma demência senil neurodegenerativa crônica, que causa um grande impacto na saúde pública. Apesar de o estresse oxidativo ter sido largamente associado ao processo de envelhecimento e à patogênese das doenças neurodegenerativas (incluindo DA), a literatura sobre o papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da DA ainda é escassa assim como para seus fatores de risco. O presente trabalho teve o objetivo avaliar se os linfócitos de pacientes com DA apresentam alterações nos níveis de expressão de alguns genes associados à respostas ao estresse, tais como SOD1, TP53, ATM, ATR, FEN1, FANCG, CDKN1A e MTH1; além de ADAM10 e ADAM17, associados diretamente a patologia. Além disso, foi proposto também avaliar os níveis de danos no DNA e a cinética de reparo dos linfócitos desses indivíduos quando tratados com peróxido de hidrogênio (H2O2), um agente indutor de danos no DNA. As amostras de sangue foram coletadas de pacientes com DA (idade entre 65 a 80 anos) e indivíduos idosos de mesma idade para analisar a expressão gênica protéica por Western blot (n=6) e a expressão transcricional por PCR quantitativa em tempo real (n=7). O ensaio cometa foi realizado para analisar os danos no DNA e a cinética de reparo em linfócitos de pacientes com DA (n=8), indivíduos idosos de mesma idade (n=8) e jovens sadios (n=5; faixa etária entre 18 e 28 anos), cultivados por 48h e tratados com H2O2 por 1h, e analisados em diferentes tempos de recuperação: 0; 0,5; 2 e 6 horas. A análise da expressão gênica por PCR em tempo real mostrou que o gene FANCG, cuja função está relacionada ao controle do ciclo celular e ao reparo do DNA, estava induzido em portadores de DA; o gene CDKN1A, envolvido na resposta a danos no DNA, também se apresentou induzido em portadores de DA. No entanto, não foram observadas alterações com diferenças significativas nos perfis transcricionais dos genes ATM, ATR, FEN1 e MTH1 entre portadores de DA e controles. Em relação às proteínas analisadas, foi observada uma sutil diminuição nos níveis da SOD1 em DA, mas não houve diferenças para ADAM10 e ADAM17. Além disso, observou-se um aumento da expressão da proteína TP53, enquanto a análise da forma fosforilada (serina 15) apresentou baixos níveis de indução. Esses resultados são compatíveis com a ausência de diferença nos níveis de expressão dos genes ATM e ATR. Em relação à análise de indução de danos no DNA e à cinética de reparo, os resultados mostraram diferenças significativas entre os portadores de DA e os controles, o que pode sugerir que os mecanismos envolvidos no processamento do dano oxidativo são diferentes na patologia de Alzheimer quando comparados ao processo de envelhecimento per se. Finalmente, os resultados obtidos sustentam a hipótese de que as vias de reparo do DNA podem estar comprometidas na DA. Além disso, foi mostrado que linfócitos do sangue periférico humano podem refletir pelo menos algumas das alterações associadas à doença, o que incentiva maiores investigações nessas células que possam fornecer biomarcadores com potencial para contribuir na caracterização da DA. / Alzheimers disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes a high impact on public health. Although oxidative stress has been associated with the aging process and the pathogenesis of neurodegenerative diseases (including AD), the literature is still scarce regarding the risk factors for the disease and the role of oxidative damage in the development of AD. The purpose of the present work was to study whether lymphocytes of AD patients display alterations in the expression levels of several genes related to stress responses, such as SOD1, TP53, ATM, ATR, FEN1, FANCG, CDKN1A, MTH1; and the genes ADAM10 and ADAM17 directly associated with the pathology. In addition, our objective was to evaluate the levels of DNA damage and repair kinetics in lymphocytes treated with hydrogen peroxide (H2O2). Blood samples were collected from AD patients (age between 65 and 80 years) and elderly individuals in order to analyze protein expression by Western blot (n=6) and transcript expression by quantitative real time PCR (n=7). The comet assay was used to investigate DNA damage and repair kinetics in lymphocytes of AD patients (n=8), elderly age-matched individuals (n=8), and young healthy individuals (n=5; age between 18 and 28 years). In order to accomplish that, lymphocytes were cultured for 47h, treated with H2O2 for 1h, and analyzed at different recovery times: 0, 0.5, 2, and 6h. The analysis of gene expression by real time qPCR showed that FANCG (implicated in cell cycle control and DNA repair) and CDKN1A (involved in the response to DNA damage stimulus) were both up-regulated in AD patients when compared to controls. In contrast, alteration in transcript profiles of ATM, ATR, FEN1, and MTH1 genes were not significantly different between groups of patients and controls. A small decrease in SOD1 protein levels was detected in AD patients; but, the proteins ADAM10 and ADAM17 expression levels was not different. Moreover, the expression of TP53 was increased in AD patients, while only low levels of TP53-phospho-Ser15 could be found; the latter is consistent with the fact that alterations in the expression levels of ATM and ATR were not observed. Regarding the analysis of DNA damage and repair kinetics, results showed significant differences between AD patients and controls, suggesting that the mechanisms involved in the oxidative DNA damage processing are different in the pathology of Alzheimers disease compared to the process of aging itself. Therefore, the results of the present study support our hypothesis that repair pathways may be compromised in AD. In addition, we showed that peripheral lymphocytes may reflect at least some alterations associated to the disease, encouraging further investigation to search for biomarkers present in these cells that might characterize AD.

Mutações na enzima Cu,Zn-superóxido dismutase (SOD1) estão associadas a casos familiares de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), uma doença neurodegenerativa motora fatal. Entretanto, a toxicidade das SOD1s mutantes não está totalmente compreendida. Sabe-se que o desenvolvimento da doença está associado ao acúmulo de lesões oxidativas em biomoléculas, mas o papel da SOD1 neste processo não está claro. Estudos com sistemas modelo são, ainda, necessários para desvendar os mecanismos envolvidos. Para contribuir na compreensão dos mecanismos de danos em DNA promovidos pela SOD1, foram realizados estudos in vitro com SOD1/H2O2/HCO3-, e estudos com neuroblastomas em cultura transfectados com SOD1 mutante G93A, característica de ELA. Através da quantificação de quebras em DNA plasmidial e dos níveis de 8-oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo) e 1,N2-eteno-2\'-desoxiguanosina (1,N2-εdGuo) em DNA de timo de bezerro, concluiu-se que o cobre liberado da SOD1 tem um papel central na formação de lesões no DNA promovidas pela SOD1 na presença de H2O2, e que o bicarbonato pode modular a reatividade do cobre liberado. Níveis aumentados de quebras no DNA, 8-oxodGuo e 1,N2-εdGuo foram encontrados nos neuroblastomas transfectados com SOD1 G93A. Maior atividade de p53 foi também observada nestas células, indicando que o acúmulo de lesões no DNA pode desencadear o processo de apoptose neste modelo celular de ELA. Observou-se que a SOD1 pode estar associada à cromatina, e que a SOD1 G93A possui maior afinidade pelo DNA e maior atividade peroxidásica no núcleo. Estes resultados indicam que as lesões no DNA observadas no modelo celular de ELA podem ser diretamente promovidas pela SOD1 mutante. / Mutations in the gene encoding Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) have been linked to familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), a fatal motor neuron disease. However, the toxicity of mutant SOD1s was not completely understood. It is known that the development of the disease is associated with oxidative damage to biomolecules, but the role of SOD1 in this process is not clear. Model studies are still necessary to reveal the mechanisms involved. To understand the mechanism of DNA damage promoted by SOD1, in vitro studies with SOD1/H2O2/HCO3-, and studies with neuroblastoma cells transfected with the G93A ALS-mutant SOD1, were performed. Through the quantification of strand breaks in plasmid DNA and the quantification of 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodGuo) and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine (1,N2-εdGuo) levels in calf thymus DNA, it was concluded that copper liberated from SOD1 has a central role in DNA damage promoted by SOD1 in the presence of H2O2, and that bicarbonate can modulate the reactivity of released copper. Increased levels of DNA strand breaks, 8-oxodGuo and 1,N2-εdGuo were found in neuroblastoma cells transfected with G93A SOD1. Increased p53 activity was also observed in these cells, indicating that accumulation of DNA damage can lead to apoptosis in this ALS cellular model. Western blot analysis showed that G93A SOD1 is present in the nucleus, being associated to the DNA. Nuclear G93A SOD1 has identical superoxide dismutase-activity but displays increased peroxidase activity, when compared to wild-type. These results indicate that DNA damage observed in this ALS cellular model may be directly promoted by mutant SOD1.

A geração de lesões ao DNA possui diversos efeitos biológicos em células de mamíferos, como inibição da replicação do DNA, ativação de vias de reparo de DNA, mutagênese e indução de apoptose. Este último pode ter conseqüências deletérias para o organismo, mas também pode trazer benefícios, como impedir que uma célula com mutações seja perpetuada, possivelmente dando origem a um tumor. Há ainda muito por se descobrir sobre os mecanismos responsáveis pela indução de morte celular por apoptose após a geração de danos ao DNA. Neste trabalho iremos demonstrar que a replicação do DNA lesado é um evento necessário para indução de apoptose por luz UV, e que a inibição dessa replicação é capaz de evitar a morte celular mesmo em células deficientes em reparo de DNA. Será mostrado também que os agentes quimioterápicos Temozolomida, ACNU e BCNU são capazes de induzir apoptose em células de glioma, em um processo controlado por p53, que dependendo do agente utilizado determina a resposta a ser adotada pelas células, seja reparo de DNA ou indução de apoptose. / Induction of DNA lesions leads to several different endpoints in mammalian cells, such as replication blockage, activation of DNA repair pathways, mutagenesis and induction of apoptosis. Although apoptosis induction might be involved in deleterious conditions, it can also bring benefit, as for instance to avoid the uncontrolled propagation of a mutated cell. The molecular mechanisms leading to apoptosis induction by DNA damage still remain largely under covered. This work provides evidence that the replication of damaged -DNA works as a trigger for UV-induced apoptosis. Surprisingly, even in DNA repair-deficient cells the inhibition of damaged-DNA replication is able to protect from apoptosis induction. This work also indicates that the chemotherapeutical agents Temozolomide, ACNU and BCNU are able to trigger apoptosis in human glioma cells, in a manner that is tightly controlled by the tumor suppressor gene p53, which depending upon the agent used will determine if the lesion will be removed by DNA repair or if cells will trigger apoptosis.

O melanoma é responsável por menos de 5% dos cânceres de pele, porém, 95% das mortes ocorrem devido a ocorrência de metástases. O melanoma metastático é refratário às terapias convencionais e rapidamente adquire resistência às terapias como as oncogene-dirigidas, como o inibidor de BRAF, da via de MAPK. Estudos prévios de screening in silico do nosso grupo, onde se utilizou as bases de dados TCGA e GEO, identificaram o gene adenosina quinase (ADK) como sendo diferencialmente expresso entre o melanoma invasivo e os nevus. A 5-iodotubercidina (5-ITu) é um potente inibidor farmacológico da ADK que dentre os diversos efeitos relatados na literatura destaca-se pelo potencial genotóxico. Os danos no DNA são os principais ativadores de checkpoint do ciclo celular, que levam a parada do ciclo celular transitória ou permanente, além de induzir morte celular, levando a hipótese de que ADK possa ser potencial agente anti-melanoma. Este trabalho objetivou avaliar a expressão do gene ADK em melanomas humanos e quimiorresistentes ao inibidor de BRAF (iBRAF), avaliou os impactos de 5-ITu sobre a proliferação, progressão do ciclo celular e morte celular e por fim avaliamos sua capacidade de aumentar a sensibilidade das células. Foi realizado PCR em tempo real para avaliar os níveis de expressão de mRNA de ADK em linhagens de melanoma e na cultura primária de melanócitos; a fim de avaliar a citotoxicidade de 5-ITu foram realizados os ensaios de exclusão por azul de tripan e de apoptose - Anexina V e PI e em modelo de esferoide, usando live/dead; também foi avaliada a influência de 5-ITu sobre a capacidade clonogênica e seus efeitos sobre a proliferação celular, a partir dos ensaios de ciclo celular e avaliação de marcadores de proliferação por imunofluorescência; as linhagens foram submetidas a diferentes regimes de tratamento com 5-ITu e o iBRAF, a fim de avaliar a curva de crescimento e a sensibilidade ao iBRAF por MTT níveis de expressão de mRNA de ADK maiores nas linhagens tumorais em relação aos melanócitos. 5-ITu mostrou-se capaz de inibir a proliferação (IC50) das linhagens de melanoma em concentrações de 1,9 a 3,5 µM. 5-ITu não foi capaz de induzir inviabilidade celular, apesar de reduzir a quantidade de células viáveis em todas as condições de tratamento, também não foi capaz de induzir aumento significativo de células apoptóticas, nem mesmo necróticas. No entanto, o tratamento com 5-ITu reduziu a capacidade clonogênica de linhagens de melanoma e promoveu parada de ciclo celular nas fases G1 e G2/M, levou ao aumento da população subG1. O tratamento com 5-ITu promoveu a redução da expressão de marcadores de proliferação, como ki67, e a combinação de tratamentos 5-ITu e iBraf foi capaz de aumentar o tempo de dobramento das linhagens de melanoma, embora tenha se mostrado incapaz de sensibilizar as células de melanoma ao tratamento com iBRAF. Desse modo, pode-se concluir que 5-ITu induz o efeito citostático e se mostra um potente agente antiproliferativo para melanoma parental e resistente. / Melanoma accounts for less than 5% of skin cancers, but 95% of deaths occur due to metastases. Metastatic melanoma is refractory to conventional therapies and rapidly acquires resistance to therapies such as oncogene-directed, such as the BRAF inhibitor, of the MAPK pathway. Previous studies of screening in silico of our group, using the databases TCGA and GEO, identified the adenosine kinase gene (ADK) as differentially expressed between invasive melanoma and nevus. 5-iodotubercidin (5-ITu) is a potent pharmacological inhibitor of ADK that among the several effects reported in the literature stands out for the genotoxic potential. DNA damage is the main activator of the cell cycle checkpoint, which leads to transient or permanent cell cycle arrest, in addition to inducing cell death, leading to the hypothesis that ADK may be a potential anti-melanoma agent. This work aimed to evaluate the expression of the ADK gene in human melanomas and chemoresistants to the BRAF inhibitor (iBRAF), evaluated the impacts of 5-ITu on proliferation, cell cycle progression and cell death and finally we evaluated its ability to increase the sensitivity of cells. Real-time PCR was performed to assess the levels of ADK mRNA expression in melanoma lines and primary melanocyte culture; in order to evaluate the cytotoxicity of 5-ITu, the trypan blue and apoptosis - Annexin V and PI exclusion and blue spheroid models were performed using live / dead; the influence of 5-ITu on the clonogenic capacity and its effects on cell proliferation, from the cell cycle assays and the evaluation of proliferation markers by immunofluorescence; the cell lines were submitted to different treatment regimens with 5-ITu and iBRAF in order to evaluate the growth curve and the sensitivity to iBRAF by MTT levels of mRNA expression of ADK higher in the tumor lines in relation to the melanocytes. 5-ITu was able to inhibit the proliferation (IC 50) of melanoma lines at concentrations of 1.9 to 3.5 181;M. 5-ITu was not able to induce cell non-viability, although it reduced the amount of viable cells in all treatment conditions, nor was it able to induce a significant increase in apoptotic or even necrotic cells. However, treatment with 5-ITu reduced the clonogenic capacity of melanoma cells and promoted cell cycle arrest in the G1 and G2 / M phases, leading to an increase in the subG1 population. Treatment with 5-ITu promotes the reduction of expression of proliferation markers, such as ki67, and the combination of 5-ITu and iBRAF treatments was able to increase the doubling time of melanoma cells, although it has been shown to be unable to sensitize melanoma cells to treatment with iBRAF. Thus, it can be concluded that 5-ITu induces the cytostatic effect and shows a potent antiproliferative agent for parental and resistant melanoma.

O melanoma é responsável por menos de 5% dos cânceres de pele, porém, 95% das mortes ocorrem devido a ocorrência de metástases. O melanoma metastático é refratário às terapias convencionais e rapidamente adquire resistência às terapias como as oncogene-dirigidas, como o inibidor de BRAF, da via de MAPK. Estudos prévios de screening in silico do nosso grupo, onde se utilizou as bases de dados TCGA e GEO, identificaram o gene adenosina quinase (ADK) como sendo diferencialmente expresso entre o melanoma invasivo e os nevus. A 5-iodotubercidina (5-ITu) é um potente inibidor farmacológico da ADK que dentre os diversos efeitos relatados na literatura destaca-se pelo potencial genotóxico. Os danos no DNA são os principais ativadores de checkpoint do ciclo celular, que levam a parada do ciclo celular transitória ou permanente, além de induzir morte celular, levando a hipótese de que ADK possa ser potencial agente anti-melanoma. Este trabalho objetivou avaliar a expressão do gene ADK em melanomas humanos e quimiorresistentes ao inibidor de BRAF (iBRAF), avaliou os impactos de 5-ITu sobre a proliferação, progressão do ciclo celular e morte celular e por fim avaliamos sua capacidade de aumentar a sensibilidade das células. Foi realizado PCR em tempo real para avaliar os níveis de expressão de mRNA de ADK em linhagens de melanoma e na cultura primária de melanócitos; a fim de avaliar a citotoxicidade de 5-ITu foram realizados os ensaios de exclusão por azul de tripan e de apoptose - Anexina V e PI e em modelo de esferoide, usando live/dead; também foi avaliada a influência de 5-ITu sobre a capacidade clonogênica e seus efeitos sobre a proliferação celular, a partir dos ensaios de ciclo celular e avaliação de marcadores de proliferação por imunofluorescência; as linhagens foram submetidas a diferentes regimes de tratamento com 5-ITu e o iBRAF, a fim de avaliar a curva de crescimento e a sensibilidade ao iBRAF por MTT níveis de expressão de mRNA de ADK maiores nas linhagens tumorais em relação aos melanócitos. 5-ITu mostrou-se capaz de inibir a proliferação (IC50) das linhagens de melanoma em concentrações de 1,9 a 3,5 µM. 5-ITu não foi capaz de induzir inviabilidade celular, apesar de reduzir a quantidade de células viáveis em todas as condições de tratamento, também não foi capaz de induzir aumento significativo de células apoptóticas, nem mesmo necróticas. No entanto, o tratamento com 5-ITu reduziu a capacidade clonogênica de linhagens de melanoma e promoveu parada de ciclo celular nas fases G1 e G2/M, levou ao aumento da população subG1. O tratamento com 5-ITu promoveu a redução da expressão de marcadores de proliferação, como ki67, e a combinação de tratamentos 5-ITu e iBraf foi capaz de aumentar o tempo de dobramento das linhagens de melanoma, embora tenha se mostrado incapaz de sensibilizar as células de melanoma ao tratamento com iBRAF. Desse modo, pode-se concluir que 5-ITu induz o efeito citostático e se mostra um potente agente antiproliferativo para melanoma parental e resistente. / Melanoma accounts for less than 5% of skin cancers, but 95% of deaths occur due to metastases. Metastatic melanoma is refractory to conventional therapies and rapidly acquires resistance to therapies such as oncogene-directed, such as the BRAF inhibitor, of the MAPK pathway. Previous studies of screening in silico of our group, using the databases TCGA and GEO, identified the adenosine kinase gene (ADK) as differentially expressed between invasive melanoma and nevus. 5-iodotubercidin (5-ITu) is a potent pharmacological inhibitor of ADK that among the several effects reported in the literature stands out for the genotoxic potential. DNA damage is the main activator of the cell cycle checkpoint, which leads to transient or permanent cell cycle arrest, in addition to inducing cell death, leading to the hypothesis that ADK may be a potential anti-melanoma agent. This work aimed to evaluate the expression of the ADK gene in human melanomas and chemoresistants to the BRAF inhibitor (iBRAF), evaluated the impacts of 5-ITu on proliferation, cell cycle progression and cell death and finally we evaluated its ability to increase the sensitivity of cells. Real-time PCR was performed to assess the levels of ADK mRNA expression in melanoma lines and primary melanocyte culture; in order to evaluate the cytotoxicity of 5-ITu, the trypan blue and apoptosis - Annexin V and PI exclusion and blue spheroid models were performed using live / dead; the influence of 5-ITu on the clonogenic capacity and its effects on cell proliferation, from the cell cycle assays and the evaluation of proliferation markers by immunofluorescence; the cell lines were submitted to different treatment regimens with 5-ITu and iBRAF in order to evaluate the growth curve and the sensitivity to iBRAF by MTT levels of mRNA expression of ADK higher in the tumor lines in relation to the melanocytes. 5-ITu was able to inhibit the proliferation (IC 50) of melanoma lines at concentrations of 1.9 to 3.5 181;M. 5-ITu was not able to induce cell non-viability, although it reduced the amount of viable cells in all treatment conditions, nor was it able to induce a significant increase in apoptotic or even necrotic cells. However, treatment with 5-ITu reduced the clonogenic capacity of melanoma cells and promoted cell cycle arrest in the G1 and G2 / M phases, leading to an increase in the subG1 population. Treatment with 5-ITu promotes the reduction of expression of proliferation markers, such as ki67, and the combination of 5-ITu and iBRAF treatments was able to increase the doubling time of melanoma cells, although it has been shown to be unable to sensitize melanoma cells to treatment with iBRAF. Thus, it can be concluded that 5-ITu induces the cytostatic effect and shows a potent antiproliferative agent for parental and resistant melanoma.

Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema biológico que denominamos Dosímetro de DNA, com o objetivo de avaliar a ação genotóxica da radiação UV solar a partir da produção de lesões na molécula de DNA. Para determinar os diferentes tipos de danos, utilizamos enzimas de reparo de DNA e anticorpos específicos. Complementando estas análises, foram ainda realizados ensaios de frequência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA. Através da utilização dessa tecnologia foi possível confirmar a produção de lesões CPDs e 6-4PPs após a irradiação em lâmpadas de UVB e UVA. Outro fator importante foi a maior indução de danos oxidativos que a banda de UVA apresentou em relação à de UVB. Exposições ambientais demonstram claramente que a luz solar possui diferentes perfís de indução de lesões de DNA, que variam de acordo com a localidade da irradiação, e que fenômenos biológicos como inativação de DNA e mutagênese são diretamente dependentes da presença de fotoprodutos na molécula de DNA e não estão associados aos danos oxidativos. Portanto, o sistema Dosímetro de DNA é capaz de fornecer uma ampla compreensão da ação genotóxica da luz solar e informações inovadoras que poderão ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias fotoprotetoras mais eficientes. / To better understand the impact of solar UV radiation upon DNA molecule, we developed a biological system based on the exposure of plasmid DNA to artificial and natural UV sources. The quantification of DNA lesions was performed through the use of specific DNA repair enzymes and antibodies. The biological effects of sunlight, as well as artificial UV-radiation, were evaluated through the determination of the DNA inactivation rate and mutagenesis frequency. Through the application of this technology, we could detect the induction of CPDs and 6-4PPs after exposures to UVB and UVA lamps. Interestingly, the induction of oxidative damages was significantly higher after UVA than UVB radiation. Surprisingly, the profiles of induction of DNA damages observed after sunlight exposures have presented variations especially according to the latitude. In addition, our data clearly indicate that the induction of these biological effects is directly related to the presence of photoproducts in UV-exposed DNA samples, and suggest that oxidative damages are not related to these biological processes. Therefore, a very suitable system was developed capable of providing a wide comprehension of the biological effects of solar-UV radiation upon the DNA molecule.

Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema biológico que denominamos Dosímetro de DNA, com o objetivo de avaliar a ação genotóxica da radiação UV solar a partir da produção de lesões na molécula de DNA. Para determinar os diferentes tipos de danos, utilizamos enzimas de reparo de DNA e anticorpos específicos. Complementando estas análises, foram ainda realizados ensaios de frequência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA. Através da utilização dessa tecnologia foi possível confirmar a produção de lesões CPDs e 6-4PPs após a irradiação em lâmpadas de UVB e UVA. Outro fator importante foi a maior indução de danos oxidativos que a banda de UVA apresentou em relação à de UVB. Exposições ambientais demonstram claramente que a luz solar possui diferentes perfís de indução de lesões de DNA, que variam de acordo com a localidade da irradiação, e que fenômenos biológicos como inativação de DNA e mutagênese são diretamente dependentes da presença de fotoprodutos na molécula de DNA e não estão associados aos danos oxidativos. Portanto, o sistema Dosímetro de DNA é capaz de fornecer uma ampla compreensão da ação genotóxica da luz solar e informações inovadoras que poderão ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias fotoprotetoras mais eficientes. / To better understand the impact of solar UV radiation upon DNA molecule, we developed a biological system based on the exposure of plasmid DNA to artificial and natural UV sources. The quantification of DNA lesions was performed through the use of specific DNA repair enzymes and antibodies. The biological effects of sunlight, as well as artificial UV-radiation, were evaluated through the determination of the DNA inactivation rate and mutagenesis frequency. Through the application of this technology, we could detect the induction of CPDs and 6-4PPs after exposures to UVB and UVA lamps. Interestingly, the induction of oxidative damages was significantly higher after UVA than UVB radiation. Surprisingly, the profiles of induction of DNA damages observed after sunlight exposures have presented variations especially according to the latitude. In addition, our data clearly indicate that the induction of these biological effects is directly related to the presence of photoproducts in UV-exposed DNA samples, and suggest that oxidative damages are not related to these biological processes. Therefore, a very suitable system was developed capable of providing a wide comprehension of the biological effects of solar-UV radiation upon the DNA molecule.

A proteína APE1 (do inglêsApurinic/Apyrimidinicendonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) é uma enzima multifuncional, cuja expressão encontra-se frequentemente aumentada em gliomas. Além de apresentar atividade no reparo por excisão de base (BER), o gene APE1 também atua como fator de redução, mantendo fatores de transcrição (FTs) em um estado reduzido ativo. A via BER de reparo do DNA tem sido apontada como um possível fator de resistência a terapias baseadas no uso de agentes alquilantes, tais como temozolomida (TMZ). No presente trabalho, utilizou-se a estratégia de inibição da transcrição do gene APE1 pelo método de RNA interferente(siRNA) e tratamento com a droga TMZ nas células de glioblastoma (GBM), T98G (resistente à TMZ) e U87MG (sensível à TMZ), a fim de verificar a influência do silenciamento do gene APE1 sobre as respostas celulares à droga avaliadas por vários ensaios, bem como os efeitos sobre a expressão transcricional dos genes alvos dos FTs regulados por APE1. O silenciamento de APE1 e o tratamento das células T98G com a TMZ foram eficazes no sentido de reduzir a proliferação e a capacidade clonogênica, além de intervir na progressão do ciclo celular com bloqueio na fase S. Tais efeitos foram acompanhados pelo aumento da indução de danos no DNA e da expressão de H2AX fosforilada (H2AX), o que justifica a queda na sobrevivência celular. O mesmo efeito não foi observado nas células U87MG silenciadas para APE1 e tratadas com a TMZ, havendo o predomínio dos efeitos causados pela TMZ, exceto por uma leve indução de danos no DNA e de H2AX. Adicionalmente, nas células T98G silenciadas e tratadas, verificou-se uma moderada indução de apoptose, que foi observada ao longo dos tempos avaliados (1 a 10 dias), com uma leve indução de caspase-3 (5 dias); nessas células, observou-se também a indução (3,8 vezes) de morte celular autofágica (5 dias). Entretanto, nas células U87MG,a indução de apoptose foi baixa e não houve indução de morte por autofagia, sugerindo outros mecanismos de morte envolvidos na eliminação dessas células em resposta ao tratamento com a TMZ. O silenciamento de APE1 causou uma redução acentuada na invasão das células T98G, de forma similar à observada nas células somente tratadas com a TMZ, sendo que a combinação (silenciamento de APE1 e tratamento com a droga) resultou em um efeito aditivo, enquanto que nas células U87MG a combinação foi eficaz no sentido de reduzir a proporção de células invasivas, fato não observado nas condições isoladas. Os genes COX2 e VEGF, alvos dos FT NFB e HIF-1 (regulados por APE1) foram reprimidos nas células T98G enquanto que o gene VEGF foi induzido nas células U87MG, entretanto, tais alterações no padrão de expressão transcricional foram observadas somente em resposta ao tratamento com a TMZ, independentemente do silenciamento de APE1, indicando nenhuma mudança na atividade redox de APE1, possivelmente pela existência de proteínas APE1 remanescentes na célula. Além disso, a expressão proteica de NFBp65(ser563) foi aumentada em ambas as linhagens silenciadas e tratadas com a TMZ, provavelmente devido à inibição da proliferação celular. Em geral, os resultados do presente trabalho demonstraram que a estratégia de inibição do gene APE1 (participante da via BER) mostrou-se potencialmente viável, suportando a contribuição do BER na resistência à TMZ, visto que nas condições testadas, observou-se uma sensibilização das células de GBM, com efeito restrito às células de GBM resistentes (linhagem T98G), sendo pouco eficaz no sentido de sensibilizar as células sensíveis (linhagem U87MG) a esse agente. Assim, há que considerar as características genéticas de cada linhagem de GBM, visto que estas são cruciais para as respostas apresentadas pelas células aos tratamentos empregados. / APE1 (Apurinic/Apyrimidinic endonuclease 1/ Redox Factor-1 - APE1/REF-1) protein is a multifunctional enzyme whose expression is often increased in gliomas. Besides presenting activity in base excision repair (BER), APE1 also acts as a reduction factor, maintaining transcription factors (TFs) in an active reduced state. The BER pathway has been implicated as a possible factor of resistance to therapies based on the use of alkylating agents such as temozolomide (TMZ). In the present study, we have been using a strategy of small interference RNA (siRNA) to down-regulate the APE1 gene under conditions of treatment with TMZ in T98G (resistant to TMZ) and U87MG (sensitive to TMZ), glioblastoma (GBM), in order to determine the effects of APE1 gene silencing on cellular responses to this drug, evaluated by several assays, as well as the effects on the transcriptional expression of target genes of TFs regulated by APE1. APE1 silencing and TMZ treatment was effective to reduce the cell proliferation and clonogenic capacity of T98G cells, in addition to interfering in the cell cycle progression (S-phase arrest). These effects were accompanied by induction of DNA damage and phosphorylation of H2AX (H2AX), which may explain the decrease in cell survival. The same effect was not observed in silenced U87MG and TMZ-treated cells, being observed a predominance of the effects caused by TMZ itself, except for a slight induction of DNA damage and H2AX. Additionally, in silenced T98G and TMZ-treated cells, there was a moderate induction of apoptosis, as observed over time (1 to 10 days), with a slight induction of caspase-3 (on day 5); for those cells, we also observed autophagic induction (3.8 fold) at day 5. However, the induction of apoptosis and autophagy in U87MG cells was very low, suggesting that other mechanisms of cell death might be involved in the elimination of GBM cells under TMZ treatment. APE1 silencing caused a marked reduction on the invasiveness of T98G cells, similarly to that observed in TMZ treated cells, while the combination (APE1 silencing and drug treatment) led to an additive effect. For U87MG, the treatment combination was effective in reducing the proportion of invasive cells, in spite of an absence of any effect produced by each isolated condition tested. Regarding to the expression profile of target genes of TFs regulated by the APE1 redox activity, it was observed that COX2 and VEGF genes, targets of FTs NFB and HIF-1, were down-regulated in T98G while VEGF gene showed induced in U87MG cells; however, such alterations in the transcriptional expression pattern were observed only in response to TMZ treatment, independently of APE1 gene silencing, indicating no change in the APE1 redox activity, possibly due to the presence of APE1 remaining proteins inside cells. In addition, NFBp65(ser563) protein expression was increased in both cell lines (silenced and treated with TMZ), probably due to the reduced cell proliferation rates. In general, the present results show that the strategy of APE1 gene knockdown was potentially viable, supporting the BER contribution of the mechanism of TMZ resistance, since under the conditions tested, there was a sensitization of GBM cells. However, this effect was restricted to the resistant cell line (T98G cells). Thus, it should be considered the genetic characteristics of each GBM cell line, since these are crucial to the cellular responses to the conditions tested in the present work.

A luz ultravioleta (UV) bloqueia a replicação e transcrição devido à formação de lesões que distorcem o DNA. Descobrimos que a depleção da quinase ATR promove a indução precoce de apoptose após irradiação com luz UVB em fibroblastos humanos imortalizados com SV40 e que mesmo células proficientes em reparo de DNA e síntese translesão foram incapazes de alcançar a mitose após depleção de ATR. Essa quinase também representa um alvo promissor para sensibilizar tumores com mutações em p53 ao quimioterápico cisplatina e ao indutor de estresse oxidativo cloroquina. Além do bloqueio da replicação, danos no DNA bloqueiam a síntese de RNA. Utilizamos sequenciamento para mapear RNA nascentes e analisar a recuperação da transcrição em escala genômica. Genes mais longos são mais inibidos por luz UV, mas o nível de expressão gênica não contribui para a recuperação da transcrição. Além disso, o reparo de DNA é similar entre genes com recuperação da transcrição distinta e outras regulações, além da remoção de lesões no DNA, devem existir para que a síntese de RNA recomece. / Ultraviolet (UV) light stalls replication and transcription due to the formation of lesions that distort DNA. We found that ATR silencing promotes early induction of apoptosis after UVB light in human fibroblasts immortalized with SV40 and even cells proficient in DNA repair and translesion synthesis were unable to reach mitosis after ATR depletion. This kinase is also a promising target for sensitizing tumors with p53 mutations to chemotherapeutic that block replication, such as cisplatin, and the oxidative stress inducer chloroquine. In addition to blocking the replication, DNA damage arrest the synthesis of RNA. We used next-generation sequencing to map and analyze the nascent RNA transcription recovery genome-wide. We confirmed that longer genes are more inhibited following UV light, however, the level of gene expression does not contribute to the recovery of transcription. Moreover, DNA repair is similar among genes with different recovery of transcription and further regulation, besides DNA damage removal, must exist to promote resumption of RNA synthesis.