Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferenciagénica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudioy evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a latransgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistemade regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema deexpresión de genes exógenos.Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficientepara transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen laexpresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estadometabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de estatécnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, lamanera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo queorigina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, ypor tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando elnúmero de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usandouna segunda construcción para normalizar la transfección.La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método devacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica enpeces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado yconstruido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única delubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma.Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un métodoque permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primeravez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para estamisión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y enmúsculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso deltransactivador tTA bajo el control de un promotor estable.Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de peztambién presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclinade una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulaciónóptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de unaestrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, ypermite obtener un alto porcentaje de clones regulables.A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origenviral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genestanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Losresultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil encuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora demantenerse en una línea celular que el promotor CMV.Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar aesta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estascélulas son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo quepodrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. / This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to theuse of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used asmethod of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in seabass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system tocontrol exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the useof the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell linehas proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.

Tesis por compendio / [ES] La criopreservación de semen de peces es una técnica que puede aumentar la eficiencia de la reproducción en cautiverio de especies de peces de agua dulce y marinas. A lo largo de las últimas décadas, se han establecido protocolos para criopreservación de semen de diversas especies de peces. Sin embargo, el foco principal de los pescadores ha sido en tener éxito en el congelamiento y descongelamiento de los espermatozoides, no llevando en cuenta el período en que los gametos se quedan expuestos a la solución crioprotectora en un momento previo a la fertilización. Esta exposición de los espermatozoides a las soluciones crioprotectoras después del descongelamiento puede ser perjudicial a la calidad de los gametos, ya que pueden ser tóxicos. La mayoría de los protocolos establecidos utilizan recipientes de plástico ultrarresistentes para almacenar el semen durante el proceso de criopreservación. Estos recipientes normalmente no se reutilizan, generando residuos altamente contaminantes al medio ambiente. Así, el objetivo principal de la tesis fue crear y probar métodos de bajo costo que potencialicen el uso de los espermatozoides descongelados de peces y torne el proceso de criopreservación de semen menos contaminante al medio ambiente. Los experimentos de los capítulos 1 y 2 se llevaron a cabo en Brasil. Utilizamos el jundiá gris Rhamdia quelen, especie considerada modelo experimental para peces nativos de América del Sur. En el capítulo 1, probamos el uso de la dilución de semen descongelado para disminuir la toxicidad de la solución crioprotectora. La técnica se utiliza comúnmente en protocolos de criopreservación de semen de mamíferos, pero nunca antes se había aplicado al semen descongelado de peces suramericanos. Muestras de semen descongelado de R. quelen se diluyeron en un diluyente salino (NaCl al 1,1% - 325 mOsm kg-1; pH 7,6). Después, observamos que los espermatozoides de muestras diluidas mostraron mayores velocidades, rectitud, progresión y frecuencia de batido flagelar que las muestras no diluidas. La dilución del semen descongelado también proporcionó mayores tasas de fertilización y eclosión que el grupo no diluido. De esta manera, la dilución de semen descongelado de R. quelen resultó ser una metodología sencilla, económica y eficiente que debe incluirse en el protocolo de criopreservación del semen de la especie. En los capítulos 2 y 3 desarrollamos y probamos la metodología para el uso de cápsulas de gelatina biodegradables (colágeno) y cápsulas de hipromelosa biodegradables (HPMC) como recipiente alternativo al uso de pajuelas de plástico en la criopreservación de semen de peces. En el segundo capítulo observamos que las cápsulas biodegradables mantuvieron los parámetros cinéticos y la capacidad reproductiva del esperma de R. quelen así como las pajuelas de plástico.Los procedimientos experimentales del capítulo 3 se llevaron a cabo en España. En este capítulo aplicamos la metodología desarrollada en el capítulo 2 para la criopreservación del semen de anguila europea Anguilla anguilla, dorada Sparus aurata y lubina Dicentrarchus labrax. En estas tres especies, las cápsulas biodegradables conservaron los parámetros cinéticos y la integridad de la membrana de los espermatozoides, así como las pajuelas de plástico. Además, observamos que el daño al ADN en muestras de semen de anguila europea y lubina europea criopreservadas en cápsulas y pajuelas no difirió. Sin embargo, las muestras de semen de dorada mostraron mayor daño en el ADN que las criopreservadas en pajuelas. Aunque, el nivel de daño que observamos en las muestras almacenadas en las cápsulas se considera bajo, por lo que pueden no comprometer el desarrollo embrionario. Evaluamos los resultados y concluimos que las cápsulas de gelatina biodegradables y las cápsulas de HPMC biodegradables pueden utilizarse como recipientes alternativos al uso de pajuelas de plástico para la criopreservación de semen de las cuatro especies de peces. / [CA] La criopreservació de l'esperma de peixos és una tècnica que pot augmentar l'eficiència de la reproducció en captivitat d'espècies de peixos d'aigua dolça i marins. Al llarg de les dècades passades, s'han establert protocols per a la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de peixos. No obstant això, el focus principal dels pescadors ha estat tenir èxit en la congelació i descongelació dels espermatozoides, sense tenir en compte el temps en què els gamets queden exposats a la solució crioprotectora abans de la fecundació. Aquesta exposició dels espermatozoides a les solucions crioprotectores després de la descongelació pot ser perjudicial per a la qualitat dels gàmetes, ja que poden ser tòxics. La majoria dels protocols establerts utilitzen recipients de plàstic ultrarresistents per emmagatzemar l'esperma durant el procés de criopreservació. Aquests recipients normalment no es reutilitzen, generant residus altament contaminants per al medi ambient. Així, l'objectiu principal de la tesi va ser criar i provar mètodes de baix cost que potenciïn l'ús dels espermatozoides descongelats de peixos i facin que el procés de criopreservació de l'esperma sigui menys contaminant per al medi ambient. Els experiments dels capítols 1 i 2 es van dur a terme a Brasil. Vam utilitzar el jundia gris Rhamdia quelen, una espècie considerada com a model experimental per a peixos natius d'Amèrica del Sud. En el capítol 1, vam provar l'ús de la dilució de l'esperma descongelat per reduir la toxicitat de la solució crioprotectora. Aquesta tècnica s'utilitza comúment en protocols de criopreservació de l'esperma de mamífers, però mai abans s'havia aplicat a l'esperma descongelat de peixos sud-americans. Mostres d'esperma descongelat de R. quelen es van diluir en un diluent salí (NaCl al 1,1% - 325 mOsm kg-1; pH 7,6). Després, vam observar que els espermatozoides de mostres diluïdes mostraven majors velocitats, rectitud, progressió i freqüència de batuda flagel·lar que les mostres no diluïdes. La dilució de l'esperma descongelat també va proporcionar majors taxes de fecundació i eclosió que el grup no diluït. D'aquesta manera, la dilució de l'esperma descongelat de R. quelen va resultar ser una metodologia senzilla, econòmica i eficient que ha d'incloure's en el protocol de criopreservació de l'esperma de l'espècie. En els capítols 2 i 3 vam desenvolupar i provar la metodologia per a l'ús de càpsules de gelatina biodegradables (col·lagen) i càpsules d'hipromelosa biodegradables (HPMC) com a recipient alternatiu a l'ús de canuts de plàstic en la criopreservació de l'esperma de peixos. En el segon capítol vam observar que les càpsules biodegradables mantenien els paràmetres cinètics i la capacitat reproductiva de l'esperma de R. quelen així com els canuts de plàstic. Els procediments experimentals del capítol 3 es van dur a terme a Espanya. En aquest capítol vam aplicar la metodologia desenvolupada al capítol 2 per a la criopreservació de l'esperma d'anguila europea Anguilla anguilla, daurada Sparus aurata i llobarro Dicentrarchus labrax. En aquestes tres espècies, les càpsules biodegradables van conservar els paràmetres cinètics i la integritat de la membrana dels espermatozoides, així com els canuts de plàstic. A més, vam observar que el dany a l'ADN en mostres d'esperma d'anguila europea i llobarro europeu criopreservades en càpsules i canuts no es va diferir. No obstant això, les mostres d'esperma de daurada van mostrar més dany a l'ADN que les criopreservades en canuts. Tot i això, el nivell de dany que vam observar a les mostres emmagatzemades en càpsules es considera baix, pel que poden no comprometre el desenvolupament embrionari. Vam avaluar els resultats i vam concloure que les càpsules de gelatina biodegradables i les càpsules d'HPMC biodegradables es poden utilitzar com a recipients alternatius a l'ús de canuts de plàstic per a la criopreservació de l'esperma de les quatre espècies de peixos. / [EN] Fish sperm cryopreservation is a technique that can increase the reproduction in captive efficiency of freshwater and marine fishes.Over the last few decades, protocols for sperm cryopreservation from many fishes have been established. However, the researchers' main focus was successfully freezing and thawing sperm, neglecting the period in which the gametes remain in contact with the cryoprotective solution until fertilization. Exposure of sperm to cryoprotectant solutions after thawing can be harmful to the quality of the gametes since they can be toxic. The majority of the established protocols use ultra-resistant plastic containers to store sperm during the cryopreservation process. These containers usually are not reused, generating highly polluting waste for the environment. Furthermore, in some countries, the containers usually used are sold by a few industries, which makes acquisition difficult and increases the product's price. Thus, the main objective of the thesis was to create and test low-cost methodologies that enhance the use of fish post-thaw sperm and make the sperm cryopreservation process more environmentally friendly. The experiments in the Chapters 1 and 2 were developed in Brazil. We used the South American silver catfish Rhamdia quelen, a species considered an experimental model for native South American fishes. In Chapter 1, we tested the use of post-thawing dilution to reduce the toxicity of the cryoprotectant solution. This technique is commonly used in mammalian sperm cryopreservation protocols but has never before been applied to post-thaw sperm of South American fishes. South American silver catfish post-thaw sperm samples were diluted in a saline extender (1.1% NaCl - 325 mOsm kg-1; pH 7.6). The post-thaw sperm diluted samples showed higher velocities, straightness, progression, and flagellar beat frequency than the cells of undiluted samples (control). The post-thawing dilution also provided higher fertilization and hatching rates than the control group. Thus, the post-thawing sperm dilution proved to be a simple, cheap, and efficient methodology that should be included in the silver catfish sperm cryopreservation protocol. In Chapters 2 and 3, we developed, tested, and described the methodology for using biodegradable gelatin (collagen) and hypromellose (HPMC) capsules as an alternative container to plastic straws in the fish sperm cryopreservation. In the second chapter, we observed that the biodegradable capsules maintained the kinetic parameters and reproductive capacity of South American silver catfish sperm just as effectively as plastic straws. The experimental procedures in Chapter 3 were carried out in Spain. We apply the methodology developed in Chapter 2 to the cryopreservation of sperm from European eel Anguilla anguilla, gilthead seabream Sparus aurata, and European sea bass Dicentrarchus labrax. In these three species, biodegradable capsules preserved the sperm kinetic parameters and membrane integrity just as effectively plastic straws. We observed that DNA damage in European eel and European sea bass sperm samples cryopreserved in capsules and straws did not differ. On the other hand, gilthead seabream sperm samples showed higher DNA damage than those cryopreserved in straws. However, the damage level observed in samples stored in capsules is considered low, thus, may not compromise embryonic development. We observed the results and concluded that biodegradable gelatin and HPMC capsules could be used as alternative containers to plastic straws for sperm cryopreservation from the tfour aquaculture fishes. / This study was supported by MICINN with funding from European Union NextGenerationEU (PRTR-C17.I1) and by Generalitat Valenciana (THINKINAZUL/2021/012;THINKINAZUL/2021/024;THINKINAZUL/2021/042) including the contract of FF-G.WAG-L has a Margarita Salas postdoctoral contract (RD 289/2021. UAB) by the Spanish Ministry of Universities. LF has a PhD contract from Generalitat Valenciana (GRISOLIAP/2020/063). TSF (141717/2019-0 and 200285/2021-1) and MPS (200452/2022-3) have fellowships from Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq). / De Souza França, T. (2024). Development and Application of Low-Cost and Environment-Friendly Techniques for Fish Sperm Cryopreservation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204486 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] Los tiburones y rayas aparecieron hace 420 millones de años, conformando el antiguo y ecológicamente diverso, grupo de vertebrados acuáticos conocido como elasmobranquios. Este variado grupo posee unas estrategias vitales que los hace muy vulnerables a los cambios rápidos del entorno, como los derivados de la acción antrópica. Pese a ser elementos clave en la regulación de los ecosistemas en los que habitan, en la actualidad, se trata de uno de los grupos vertebrados más amenazados del planeta. Paralelamente a la conservación in situ, los programas de conservación ex situ se pueden utilizar para mejorar la situación de algunas especies sensibles. Entre estos programas, los planes de cría en cautividad aumentarían la sostenibilidad de acuarios públicos y centros de investigación, además de permitir el desarrollo de estrategias de conservación en estado salvaje. Sin embargo, para que sean efectivos, estos planes deberían incluir el uso de técnicas de reproducción asistida. Desafortunadamente, estas técnicas apenas se han desarrollado en el pasado, por lo que su utilidad no se ha demostrado adecuadamente. Esta tesis aborda el uso de técnicas de reproducción en elasmobranquios, con énfasis en la obtención y preservación del esperma. Inicialmente, se centró en dos especies modelo, Scyliorhinus canicula y Raja radula, pero luego se incluyeron otras especies. Esto reveló variabilidad en las estructuras reproductivas, lo que puede afectar la eficacia y calidad de las técnicas. Los capítulos 1 y 2 se enfocaron en catalogar y describir estas estructuras en diversas especies, destacando las mejores prácticas de obtención de gametos e inseminación. La conservación a corto, medio y largo plazo del esperma es esencial para planes ex situ, reduciendo el transporte de machos, conflictos durante el cortejo y endogamia. El Capítulo 3 detalla fórmulas para mantener el esperma fresco y un medio para su supervivencia por más de 30 días. Luego, se describe la criopreservación del esperma de varias especies de rayas y tiburones mediante crioprotectores. El Capítulo 4 aborda desafíos en la manipulación de espermatozoides elasmobranquios debido a su morfología helicoidal y la formación de agregaciones llamadas espermatozeugma. Se resalta la importancia de la viscosidad en las técnicas de reproducción asistida. En la Discusión, se compara la eficacia de los métodos y se exploran nuevas oportunidades al tener acceso a diversas especies. Esto incluye descripciones detalladas con análisis de imagen, evaluación de viscosidad y agregados en la preservación, y la consideración de inseminaciones artificiales. / [CA] Els taurons i les ratjades van aparèixer fa 420 milions d'anys, formant el grup conegut com a elasmobranquis. Aquest grup divers posseeix estratègies vitals que els fan molt vulnerables als canvis ràpids de l'entorn. Malgrat ser elements clau en la regulació dels ecosistemes on habiten, actualment són un dels grups més amençats del planeta. Els programes de conservació ex situ es poden utilitzar per millorar la situació d'algunes espècies. Entre aquests programes, els plans de cria en captivitat augmentarien la sostenibilitat dels aquaris públics i els centres de recerca, a més de permetre el desenvolupament d'estratègies de conservació a l'estat salvatge. No obstant això, aquests plans haurien d'incloure l'ús de tècniques de reproducció assistida. Desafortunadament, aquestes tècniques gairebé no s'han desenvolupat en el passat. Davant d'aquesta situació, aquesta tesi pretén omplir certes mancances en el coneixement sobre l'ús d'aquestes tècniques en diverses espècies d'elasmobranquis. La nostra investigació va començar centrant-se especialment en dues espècies model, el tauró gat Scyliorhinus canicula i la ratjada peluda Raja radula, però al llarg de l'estudi es va aconseguir tenir accés a altres espècies. Aquest accés ens va permetre ser conscients de la gran variabilitat en la disposició de les estructures del sistema reproductor. Malgrat que en la literatura hi ha descripcions generals i, en ocasions, detallades dels sistemes reproductors de certes espècies, aquestes descripcions mai s'han centrat en l'aplicació pràctica de les tècniques de reproducció assistida. Per aquest motiu, els capítols 1 i 2 es van centrar en la catalogació i descripció de les diferents estructures d'espècies que abasten un ampli espectre taxonòmic. La conservació de l'esperma juga un paper clau per poder desenvolupar plans de conservació en condicions ex situ. Disposar d'esperma de qualitat permet limitar el transport de mascles entre institucions, minimitzar problemes derivats de la manca de sincronia entre adults reproductors, reduir conflictes durant èpoques d'aparellament i reduir l'endogàmia. El tercer capítol es centra en com es van desenvolupar i provar diferents fórmules per aconseguir el manteniment en fresc de l'esperma, fins a aconseguir un medi on diluir l'esperma capaç de mantenir-lo amb vida durant més de 30 dies. Posteriorment, mitjançant l'addició de diversos crioprotectors (ou, DMSO i metanol) en diverses concentracions, s'explica com es va aconseguir la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de ralles i, per primer cop, la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de taurons. Un dels primers obstacles que es van detectar en treballar amb els espermatozoides es va deure a la morfologia d'aquestes cèl·lules en comparació amb les d'altres espècies. El cap dels espermatozoides presenta una forma helicoidal, amb un nombre variable de voltes en funció de l'espècie. A més, en moltes ocasions les cèl·lules no apareixen lliures en el fluid seminal, sinó que formen agregacions estructurades anomenades espermatotzeugma. Al llarg del capítol 4 s'explora com aquestes dues característiques sorgeixen com a resultat de la fecundació interna i les característiques mecàniques del medi en què han de realitzar la seva funció. Per primer cop, es pot observar com les cèl·lules reaccionen davant mitjans amb diferents propietats, posant de relleu la importància de la viscositat en l'aplicació de tècniques de reproducció assistida. Finalment, a la discussió, es compara l'eficàcia dels mètodes emprats i s'explora nous camins d'acció sorgits de tenir accés a més individus de diferents espècies. Això inclou la possibilitat de fer descripcions detallades mitjançant tècniques d'anàlisi d'imatge, avaluar la importància de la viscositat i els agregats en els processos de preservació i la possibilitat de realitzar inseminacions artificials. / [EN] Sharks and rays emerged 420 million years ago, forming the ancient and ecologically diverse group of aquatic vertebrates known as elasmobranchs. This diverse group possesses vital strategies that make them highly vulnerable to rapid environmental changes, such as those resulting from human activities. Despite being key elements in the regulation of the ecosystems they inhabit, they are currently one of the most threatened vertebrate groups on the planet. In parallel with in-situ conservation efforts, ex-situ conservation programs can be used to improve the status of some sensitive species. Among these programs, captive breeding plans would enhance the sustainability of public aquariums and research centers, as well as enable the development of conservation strategies in the wild. However, for these plans to be effective, they should include the use of assisted reproduction techniques. Unfortunately, these techniques have been scarcely developed in the past, and their utility has not been adequately demonstrated. This thesis addresses the use of reproduction techniques in elasmobranchs, with an emphasis on sperm retrieval and preservation. Initially, it focused on two model species, Scyliorhinus canicula and Raja radula, but later, other species were included. This revealed variability in reproductive structures, which can affect the effectiveness and quality of the techniques. Chapters 1 and 2 focused on cataloging and describing these structures in various species, highlighting best practices for gamete retrieval and insemination. The short, medium, and long-term conservation of sperm is essential for ex-situ plans, reducing the need for transporting males, conflicts during courtship, and inbreeding. Chapter 3 details formulas for maintaining sperm freshness and a medium for its survival for over 30 days. Subsequently, sperm cryopreservation in several species of rays and sharks is described using cryoprotectants. Chapter 4 addresses challenges in handling elasmobranch sperm due to its helical morphology and the formation of aggregates called spermatozeugma. The importance of viscosity in assisted reproduction techniques is emphasized. In the Discussion, the effectiveness of the methods is compared, and new opportunities are explored by having access to various species. This includes detailed descriptions with image analysis, viscosity assessment, and aggregate preservation, as well as the consideration of artificial inseminations. / This research was partially funded by the Fundación Biodiversidad ( ). PGS has a PhD contract from the European Union through the Operational Program of the European Social Fund (ESF) of the Comunitat Valenciana 2014–2020 ACIF 2018 (ACIF/2018/147). VG has a postdoc contract from the MICIU, Programa Juan de la Cierva-Incorporación (IJCI- 2017-34200). / García Salinas, P. (2023). Development and Application of Techniques for the Control of Captive Breeding in Elasmobranchs [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201494 / Compendio

[ES] La selección de gametos de alta calidad es un requisito indispensable a tener en cuenta en los programas de reproduccion asistida. El desarrollo de herramientas biotecnológicas como la criopreservación de gametos, juega un papel importante en la producción acuicola y en la formación de bancos de germoplasma, que contribuiran luego en la mejora genética de las poblaciónes de peces, principalmente aquellas en peligro y que pudieran estar más afectadas ante futuros cambios climáticos. En la primera fase de esta tesis realizada en la Unesp, se trabajó con una especie neotropical de elevada importancia económica para la region Suramericana. La segunda fase realizada en la UPV se trabajó con la Anguila europea (Anguilla anguilla), una especie clasificada en la Lista Roja de la (UICN) como especie "en peligro crítico de extinción". En la primera fase se buscó caracterizar la composición bioquímica del plasma y las características seminales de la especie para evaluar las posibles relaciones entre estos parámetros. El plasma seminal estuvo principalmente compuesto por iones de sodio (Na+) y dentro de los componentes orgánicos sobresalieron las proteínas totales y la glucosa. A través del análisis de componentes principales (PCA) se observó que la motilidad tenía una fuerte correlación positiva con el tiempo de motilidad, la concentración de espermatozoides y las proteínas totales. Estos análisis sirvieron de base para la creación de una solución diluyente utilizada posteriormente en la sustancia crioprotectora. Luego se determinó la influencia del plasma seminal como constituyente de la solución crioprotectora en la criopreservación de semen de P. reticulatum. Se utilizaron tres tratamientos: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a este crioprotector se le agregó 30% de plasma seminal natural (T2) y 30% de plasma seminal artificial en base a los resultados de los componentes bioquímicos del plasma determinados para la especie en el experimento anterior (T3). Se evaluaron parámetros de motilidad espermática, capacidad fecundante del semen criopreservado, así como fragmentación del ADN. El tratamiento T1 resultó con los mejores valores de motilidad seguido del T2, y la capacidad fertilizante de estos dos tratamientos fue similar al control, sin embargo, el tratamiento T2 mostró menos daño en el ADN. Mediante el PCA se demostró que T1 tenía una mejor relación positiva con la fertilidad y la motilidad total y progresiva. Finalmente, evaluamos las estructuras de las subpoblaciones espermáticas en cada uno de los tratamientos utilizados. Mediante análisis multivariado en dos etapas, fue posible determinar tres subpoblaciones espermáticas en el semen crioconservado de la especie, SP1 (rápido-lineal), SP2 (rápido-no lineal) y SP3 (lento-lineal). T1 presentó el mayor porcentaje de SP1, siendo confirmado por la efectividad en la protección de las células de este tratamiento en el proceso de criopreservación de la especie. En la segunda fase que se está llevó a cabo en la UPV, el objetivo general fue determinar el efecto de la temperatura y el pH del agua de mar sobre la motilidad de los espermatozoides en la Anguila europea. Se determinó que el bajo pH del agua de mar (6.5-7.4) disminuyó la motilidad de los espermatozoides de anguila en comparación con el control (pH= 8.2). Cuando estudiamos el efecto combinado del pH del plasma seminal artificial y el pH de ASW (7.8 y 8.2), no encontramos diferencias estadísticas en la motilidad y cinética de los espermatozoides en relación con el pH del plasma seminal artificial, pero sí el pH del agua de mar. Se encontraron valores más altos de motilidad total (MOT), FA(rápidos) y ME (médios) con un pH de 8.2 que con un pH de 7.8. En contraste, la temperatura del agua de mar no afectó los parámetros de motilidad de los espermatozoides o la longevidad de los espermatozoides en el contexto del cambio climático. / [CA] La selecció de gàmetes d'alta qualitat és un requisit indispensable a tenir en compte en els programes de reproducció assistida. El desenvolupament d'eines biotecnològiques com la criopreservació de gàmetes, juga un paper important en la producció aqüicola i en la formació de bancs de germoplasma, que contribuiran després a la millora genètica de les població de peixos, principalment aquelles en perill i que poguessin estar més afectades davant de futurs canvis climàtics. A la primera fase d'aquesta tesi realitzada a la Unesp, es va treballar amb una espècie neotropical d'elevada importància econòmica per a la regió sud-americana. La segona fase realitzada a la UPV es va treballar amb l'Anguilla europea (Anguilla anguilla), una espècie classificada a la Llista Vermella de la (UICN) com a espècie "en perill crític d'extinció". A la primera fase es va buscar caracteritzar la composició bioquímica del plasma i les característiques seminals de l'espècie per avaluar les possibles relacions entre aquests paràmetres. El plasma seminal va estar principalment compost per ions de sodi (Na+) i dins dels components orgànics van sobresortir les proteïnes totals i la glucosa. A través de l'anàlisi de components principals (PCA), es va observar que la motilitat tenia una forta correlació positiva amb el temps de motilitat, la concentració d'espermatozoides i les proteïnes totals. Aquestes anàlisis van servir de base per a la creació d'una solució diluent utilitzada posteriorment a la substància crioprotectora. Després es va determinar la influència del plasma seminal com a constituent de la solució crioprotectora en la criopreservació de semen de P. reticulatum. Es van utilitzar tres tractaments: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a aquest crioprotector se li va afegir 30% de plasma seminal natural (T2) i 30% de plasma seminal artificial sobre la base dels resultats dels components bioquímics del plasma determinats per a l'espècie a l'experiment anterior (T3). S'avaluaren paràmetres de motilitat espermàtica, capacitat fecundant del semen criopreservat, així com fragmentació de l'ADN. El tractament T1 va resultar amb els millors valors de motilitat seguit del T2, i la capacitat fertilitzant d'aquests dos tractaments va ser similar al control, però el tractament T2 va mostrar menys mal a l'ADN. Mitjançant el PCA es va demostrar que T1 tenia una millor relació positiva amb la fertilitat i la motilitat total i progressiva. Finalment, avaluem les estructures de les subpoblacions espermàtiques a cadascun dels tractaments utilitzats. Mitjançant anàlisi multivariada en dues etapes, va ser possible determinar tres subpoblacions espermàtiques en el semen crioconservat de l'espècie, SP1 (ràpid-lineal), SP2 (ràpid-no lineal) i SP3 (lent-lineal). T1 va presentar el percentatge més gran de SP1, i va ser confirmat per l'efectivitat en la protecció de les cèl·lules d'aquest tractament en el procés de criopreservació de l'espècie. A la segona fase que es va dur a terme a la UPV, l'objectiu general va ser determinar l'efecte de la temperatura i el pH de l'aigua de mar sobre la motilitat dels espermatozoides a l'Anguila europea. Es va determinar que el pH baix de l'aigua de mar (6.5-7.4) va disminuir la motilitat dels espermatozoides d'anguila en comparació del control (pH= 8.2). Quan estudiem l'efecte combinat del pH del plasma seminal artificial i el pH d'ASW (7.8 i 8.2), no trobem diferències estadístiques en la motilitat i la cinètica dels espermatozoides en relació amb el pH del plasma seminal artificial, però sí el pH de l'aigua de mar. Es van trobar valors més alts de motilitat total (MOT), FA(ràpids) i ME (metges) amb un pH de 8.2 que amb un pH de 7.8. En contrast, la temperatura de l'aigua de mar no va afectar els paràmetres de motilitat dels espermatozous o la longevitat dels espermatozous en el context del canvi climàtic. / [EN] The selection of high-quality gametes is an essential requirement to take into account in assisted reproduction programs. The development of biotechnological tools such as cryopreservation of gametes plays an important role in aquaculture production and in the formation of germplasm banks, which will later contribute to the genetic improvement of fish populations, mainly those in danger and that could be more affected by future climate changes. In the first phase of this thesis carried out at Unesp, we worked with a neotropical species of high economic importance for the South American region. The second phase carried out at the UPV worked with the European Eel (Anguilla anguilla), a species classified on the (IUCN) Red List as a "critically endangered" species. In the first phase, we sought to characterize the biochemical composition of the plasma and the seminal characteristics of the species to evaluate the possible relationships between these parameters. The seminal plasma was mainly composed of sodium ions (Na+) and within the organic components, total proteins and glucose stood out. Through principal component analysis (PCA) it was observed that motility had a strong positive correlation with motility time, sperm concentration and total proteins. These analyzes served as the basis for the creation of a diluent solution later used in the cryoprotective substance. Then the influence of seminal plasma as a constituent of the cryoprotectant solution in the cryopreservation of P. reticulatum semen was determined. Three treatments were used: 5% glucose + 10% methanol (T1), 30% natural seminal plasma (T2) and 30% artificial seminal plasma were added to this cryoprotectant based on the results of the determined biochemical components of the plasma. for the species in the previous experiment (T3). Parameters of sperm motility, fertilizing capacity of cryopreserved semen, as well as DNA fragmentation were evaluated. Treatment T1 resulted with the best motility values followed by T2, and the fertilizing capacity of these two treatments was similar to the control, however, treatment T2 showed less DNA damage. Using PCA, it was shown that T1 had a better positive relationship with fertility and total and progressive motility. Finally, we evaluated the structures of the sperm subpopulations in each of the treatments used. Through two-stage multivariate analysis, it was possible to determine three sperm subpopulations in the cryopreserved semen of the species, SP1 (fast-linear), SP2 (fast-nonlinear) and SP3 (slow-linear). T1 presented the highest percentage of SP1, being confirmed by the effectiveness in protecting the cells of this treatment in the cryopreservation process of the species. In the second phase that is being carried out at the UPV, the general objective was to determine the effect of temperature and pH of seawater on sperm motility in the European Eel. It was determined that the low pH of seawater (6.5-7.4) decreased the motility of eel sperm compared to the control (pH= 8.2). When we studied the combined effect of the pH of the artificial seminal plasma and the pH of ASW (7.8 and 8.2), we did not find statistical differences in the motility and kinetics of the sperm in relation to the pH of the artificial seminal plasma, but we did find the pH of the water of sea Higher values of total motility (MOT), FA (fast) and ME (medium) were found at a pH of 8.2 than at a pH of 7.8. In contrast, seawater temperature did not affect sperm motility parameters or sperm longevity in the context of climate change. / I also thank the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES/PROEX) (N° 88887.302629/2018-00), National Council for Scientific, Technological Development CNPq (N° 200452/2022-3) and the Brazilian fostering agencies Foundation for Research Support of the State of Sao Paulo FAPESP (N° 2020/15020-0), for its financial support in Brazil. In Spain, the ThinkInAzul programme, supported by the Spanish Ministry of Science and Innovation (MCIN) with funding from the European Union NextGenerationEU (PRTR-C17.I1) and the Generalitat Valenciana (THINKINAZUL/2021/012) to SEASPERM, which has made it possible the preparation of this work. To the AUIP (Ibero-American Postgraduate University Association) for the Academic Mobility scholarship between Institutions Associated with the AUIP 2022 / Padilla Sánchez, M. (2023). Sperm Quality and Cryopreservation in Teleost: Effect of Seminal Plasma Component and Climate Change [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201549