Tesis por compendio / [ES] En las últimas décadas, se ha observado un incremento en la emergencia de nuevas virosis en los cultivos del sudeste español, principal región abastecedora de frutas y hortalizas al resto de Europa. Entre las virosis emergentes más recientes en esta área de cultivo, se encuentra el tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartito transmitido por moscas blancas (Bemisia tabaci). En 2012 se detectó por primera vez en las provincias de Murcia y Almería, y desde entonces se está propagando por otros países de la cuenca del Mediterráneo, generando graves daños en los cultivos de cucurbitáceas, y limitando la producción, principalmente, de calabacín (Cucurbita pepo) y melón (Cucumis melo). En esta tesis doctoral se ha desarrollado un programa de mejora genética enfocado a la obtención de variedades de cucurbitáceas resistentes al aislado español del ToLCNDV(-ES). Por primera vez, hemos identificado fuentes de resistencia al ToLCNDV en el género Cucurbita y en pepino (Cucumis sativus). Todas las accesiones resistentes que describimos pertenecen a tipos silvestres o variedades locales, la mayoría originarias de la India, donde se describió por primera vez el ToLCNDV. Es posible que en esta área se haya producido un fenómeno de co-evolución entre plantas silvestres de cucurbitáceas y este begomovirus. Dos accesiones de Cucurbita moschata han mostrado un elevado nivel de resistencia, y a pesar de su cruzabilidad intermedia con C. pepo, ha sido posible la obtención de descendencia interespecífica y la transferencia parcial de la resistencia. Las accesiones resistentes identificadas se han caracterizado para determinar el tipo de herencia que regula la resistencia al ToLCNDV. Mediante el desarrollo de poblaciones segregantes de mejora y el aprovechamiento de herramientas genéticas de mapeo y cartografía hemos identificado tres QTLs que controlan la resistencia al ToLCNDV en melón, uno de efecto mayor y herencia parcialmente dominante en el cromosoma 11 y dos que modifican su efecto mediante interacciones epistáticas en los cromosomas 2 y 12. Siguiendo esta estrategia, también hemos identificado un locus de resistencia recesiva a ToLCNDV en el cromosoma 8 de C. moschata, aunque la penetración incompleta cuando se intenta transferir a C. pepo pone de manifiesto la influencia del fondo genético en el carácter. Las regiones genómicas involucradas en la resistencia de ambas especies son sinténicas y agrupan un conjunto de genes comunes no descritos previamente en la resistencia a otros virus en cucurbitáceas. Los genotipados mediante colecciones de SNPs han permitido identificar marcadores moleculares ligados a la resistencia al ToLCNDV en melón, calabaza y calabacín. Estos marcadores suponen un valioso recurso en programas de mejora, ya que permiten transferir de manera asistida las resistencias identificadas a fondos genéticos comerciales. Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que dan lugar a la resistencia, hemos realizado un ensayo de RNA-seq, comparando los transcriptomas de un genotipo resistente y otro susceptible de melón durante la infección con ToLCNDV. Los resultados obtenidos al analizar la expresión diferencial son compatibles con el tipo de herencia cuantitativa de la resistencia y reflejan un complejo sistema de regulación transcripcional. La infección sistémica del ToLCNDV en melón se ve influenciado por la desregulación de genes implicados en la ruta de señalización hormonal del ácido jasmónico, transportadores transmembrana, fotosíntesis y factores de transcripción. Además, hemos observado cambios en la expresión de genes implicados en la metilación del DNA, tanto en el genotipo resistente como susceptible, lo que sugiere que el silenciamiento génico mediado por RNA puede estar involucrado en la inhibición de la transcripción del genoma viral, favoreciendo la resistencia. / [EN] Different factors promote the emergence of new viruses in crops of the Southeastern Spain, the main supplier region of vegetables and fruits to the rest of European countries. A new strain of tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) is among the most recent emergent viral diseases in this farming area, a bipartite begomovirus naturally transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci). This strain was first detected in 2012 in the provinces of Murcia and Almeria, from where it propagated to other Mediterranean countries. ToLCNDV generates severe damages in cucurbits, decreasing yields mainly in squash (Cucurbita pepo) and melon (Cucumis melo) crops. In this doctoral thesis, a breeding program has been developed to obtain cucurbit varieties with resistance to the Spanish strain of ToLCNDV(-ES). Although cucurbit germplasm with resistance genes to this virus is poor and localized in few accessions, in this work we have identified for the first-time resistance sources to ToLCNDV in Cucurbita spp. and cucumber (Cucumis sativus). All resistant accessions here described are landraces or wild types not domesticated or with low levels of genetic manipulation. Moreover, most of these genotypes are originals from India, where ToLCNDV was first described. Likely, the occurrence of co-evolution events took place between wild cucurbits plants and this begomovirus. Despite not identifying resistance sources in squash, two Cucurbita moschata accessions have shown high resistance levels. Both species present intermediate crossability, even so the obtention of interspecific offspring and the partial transference of the resistance was possible. The resistant accessions identified in the works of this thesis and those identified by our group in previous assays, have been characterized to determine the heritage controlling ToLCNDV resistance. The development of breeding segregating populations and exploiting getenic tools for mapping and cartography, we identifed three QTLs controlling resistance to ToLCNDV in melon, one partially dominant with mayor effect in chromosome 11, and two minor modifiers in chromosomes 2 and 12. Epistatic interactions between them have been detected. Following the same strategy, we have also identified a locus with recessive heritage in chromosome 8 of C. moschata. However, when we tried to transfer it to C. pepo incomplete penetrance occurrence was observed, reflecting the influence of the genetic background on the trait. The genomic regions identified in both species are synthenic and share a common cluster of genes not described previously in cucurbits conferring resistance to other viruses. The advances in next generation sequencing technologies have offered us a huge quantity of genomic and transcriptomic information. Genotyping by SNPs collections allowed the identification of molecular markers linked to ToLCNDV resistance in melon, pumpkin and squash. These markers suppose a valuable resource in breeding programs, since can be used to assist the transference of the identified resistances to commercial genetic backgrounds. To further understand the molecular mechanism regulating the resistance, we have performed an RNA sequencing assay (RNAseq), comparing transcriptomes between a resistant and a susceptible accession of C. melo in the time course of ToLCNDV infection. The results obtained from the analysis of differential expression levels are compatible whit a complex transcriptional regulation. Deregulation of genes involved in hormonal jasmonic signaling, transmembrane transport, photosynthesis and transcription factors are involved in the ToLCNDV systemic infection through melon plants. Furthermore, in both resistant and susceptible genotypes, we observed expression changes of genes described in DNA methylation pathway. This suggests that RNA silencing mechanisms might be responsible of inhibit viral genome transcription, enhancing the resistance response. / [CA] Durant les últimes dècades, s'ha observat un increment en l'emergència de noves virosis als cultius del sud-est espanyol, principal regió proveïdora de fruites i hortalisses a la resta d'Europa. Entre les virosis emergents més recents en aquesta àrea de cultiu, es troba un nou aïllat del tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartit transmés per mosca blanca (Bemisia tabaci). En 2012 es va detectar per primera vegada a les províncies de Múrcia i Almeria, i des d'aleshores s'està propagant per altres països de la conca del Mediterrani, ací genera greus danys en els cultius de cucurbitàcies, i hi limita la producció, principalment de carabasseta (Cucurbita pepo) i meló (Cucumis melo). En aquesta tesi doctoral s'ha desenvolupat un programa de millora genètica enfocat a l'obtenció de varietats de cucurbitàcies resistents a l'aïllat espanyol del ToLCNDV(-ES). Hem pogut identificar per primera vegada fonts de resistència al ToLCNDV en el gènere Cucurbita i en cogombre (Cucumis sativus). Totes les accesions resistents que descrivim pertanyen a tipus silvestres o varietats locals, la major part originaris de l'Índia, on es va descriure per primera vegada el ToLCNDV. És possible que en aquesta àrea s'haja produït un fenomen de coevolució entre plantes silvestres de cucurbitàcies i aquest begomovirus. Dos accesions de Cucurbita moschata han mostrat un elevat nivell de resistència, i tot i la compatibilitat intermèdia que presenten ambdues espècies, ha sigut possible l'obtenció de descendència interespecífica i la transferència parcial de la resistència. Les accessions resistents identificades s'han caracteritzat per tal de determinar el tipus d'herència que regula la resistència al ToLCNDV. Mitjançant el desenvolupament de poblacions segregants de millora i l'aprofitament de ferramentes genètiques de mapeig i cartografia, hem identificat tres QTLs que controlen la resistència al ToLCNDV en meló, un d'efecte major i herència parcialment dominant en el cromosoma 11 i dos que modifiquen el seu efecte mitjançant interaccions epistàtiques als cromosomes 2 i 12. Seguint aquesta estratègia, també hem identificat un locus de resistència recessiva a ToLCNDV en el cromosoma 8 de C. moschata, encara que la penetració incompleta quan s'intenta transferir a C. pepo evidència la influència del fons genètic en el caràcter. Les regions genòmiques involucrades en la resistència de les dos espècies són sintèniques i agrupen un conjunt de gens comuns no descrits prèviament en la resistència a altres virus en cucurbitàcies. Els genotipats utilitzant col·leccions de SNPs han permés identificar marcadors moleculars lligats a la resistència al ToLCNDV en meló, carabassa i carabasseta. Aquests marcadors suposen un valuós recurs en programes de millora, ja que permeten transferir de forma assistida les resistències identificades a fons genètics comercials. Per tal d'aprofundir en el coneixement dels mecanismes moleculars que confereixen la resistència, hem realitzat un assaig de seqüenciació del RNA (RNA-seq), i hem comparat els transcriptomes d'un genotip resistent i altre susceptible de meló durant la infecció amb ToLCNDV. Els resultats obtinguts en analitzar l'expressió diferencial són compatibles amb el tipus d'herència quantitativa de la resistència i reflecteixen un complex sistema de regulació transcripcional. La infecció sistèmica del ToLCNDV en meló es veu influenciada per la desregulació de gens implicats en la ruta de senyalització hormonal de l'àcid jasmònic, transportadors transmembrana, fotosíntesi i factors de transcripció. A més, hem observat canvis en l'expressió de gens implicats en la metilació del DNA, tant en el genotip resistent com susceptible, el que suggereix que el silenciament gènic mediat per RNA pot estar involucrat en la inhibició de la transcripció del genoma viral, afavorint la resistència. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación de la doctoranda como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2016/188) y dos estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEPFI/2017/011 y BEFPI/2018/028). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [Proyectos AGL2017-85563-C2-1-R y RTA2017-00061-C03-03 (INIA)] y del proyecto PROMETEO para grupos de excelencia (2017/078) de la Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana). / Sáez Sánchez, C. (2020). Mejora Genética de la Resistencia al tomato leaf curl New Delhi virus en Cucurbitaceas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153801 / TESIS / Compendio

[EN] Tomato spotted wilt virus is one of the most widespread and economically important viruses worldwide. It infects a large number of plant species, being the tomato and pepper the most affected. TSWV is transmitted from one plant to another by various species of thrips in a circulative and propagative manner, being Flankliniella occidentalis the main vector. The best strategy for disease control in tomato and pepper has been breeding resistant cultivars, but only tomato with the gene Sw-5 and pepper with gene Tsw have been effective against a wide spectrum of TSWV isolates, but resistance-breaking isolates often arise. To obtain a more effective and durable control is necessary: A) the genetic and biological characterization of conventional and resistance-breaking isolates of TSWV; B) the understanding the evolutionary and epidemiological factors involved in the emergence and dispersion of resistance-breaking isolates; C) the development of tools for viral detection and quantification; and D) evaluation of new sources of resistance (total or partial, estimated as the difficulty to viral infection or/and accumulation) or tolerance (total or partial, estimated as the difficulty to symptoms development and damage without affecting viral infection). In this work, TSWV isolates from Spanish tomato and pepper crops have been biologically and molecularly characterized. The complete genome of three TSWV isolates with different biotypes were sequenced: N (unable to infect Sw-5 resistant tomato and Tsw resistant pepper), T (tomato Sw-5 resistance-breaking), and P (pepper Tsw resistance-breaking). No correlation between genetic variation and the ability of overcoming resistance was found. These nucleotide sequences and others retrieved from the GenBank database were used to develop RT-qPCR, with high sensitivity and dynamic range. Primers and one TaqMan MGB were designed from conserved sequence stretches with the aim of detecting and quantifying any TSWV isolate. It was not possible to develop a molecular method to differentiate between conventional and resistance-breaking isolates since there is no correlation between genotype and biotype. Instead, two TaqMan MGB probes were designed to quantify the two main genotypes (according to the M segment) in mixed infections. RT-qPCR was used to evaluate TSWV accumulation in non-resistant tomato, non-resistant pepper and Datura stramonium (an important reservoir), as well as in the main vector F. occidentalis, which was considered to evaluate transmission efficiency. The results showed that resistance breakdown was not associated to a fitness cost (tradeoff) in the infectivity of susceptible hosts or transmissibility by thrips and that the resistance-breaking isolates have the same potential for dispersion in field as the conventional isolates. Finally, the information obtained from the previous studies and the RT-qPCR technique were used to evaluate the resistance and tolerance to TSWV of a new accession of Capsicum baccatum. In addition to considering the genetic and biological variation of TSWV, a new approach was used based on analysis of longitudinal data (those measured in the same individuals over time). The resistance level was estimated with two variables: A) absolute fitness, calculated from the variation in time of the viral titer, quantified by RT-qPCR; and B) infectition survival, the median time in which the virus was detected in a plant by ELISA. The tolerance level was estimated as symptom survival, the median time in which a plant developed severe symptoms. This analysis showed that this new accession is partially resistant and totally tolerant to TSWV conventional and resistance-breaking isolates and therefore is a good candidate for a pepper breeding program / [ES] Tomato spotted wilt virus (TSWV) es uno de los virus más extendidos y de mayor importancia económica del mundo. Infecta a un gran número de especies vegetales, siendo los cultivos de tomate y pimiento los más afectados. Este virus se transmite de una planta a otra por trips en una manera propagativa y circulativa, siendo Flankliniella occidentalis el más eficaz. El cultivo de variedades resistentes de tomate y pimiento permitió el control de la enfermedad, ya que estos genes inducen una respuesta hipersensible impidiendo la infección sistémica del virus. Sin embargo, con frecuencia aparecen aislados del virus capaces de superar estas resistencias. Para obtener un control de la enfermedad más eficaz y duradero es necesario: A) la caracterización genética y biológica de los aislados del TSWV que superan y no superan las resistencias; B) el estudio de los factores evolutivos y epidemiológicos implicados en la aparición y establecimiento de los aislados que superan las resistencias; C) el desarrollo de herramientas que permitan la detección y cuantificación de estos aislados virales; y D) la evaluación de nuevas fuentes de resistencia o tolerancia. En este trabajo se han caracterizado biológicamente y molecularmente diferentes aislados del TSWV procedentes de cultivos de tomate y pimiento de España. Se determinó la secuencia nucleotídica del genoma completo de tres aislados españoles correspondientes a tres biotipos: N (incapaz de infectar variedades resistentes de tomate o pimiento); T (supera la resistencia Sw-5 de tomate); y P (supera la resistencia Tsw de pimiento). No se encontró correlación entre la variación genética y la capacidad de superar la resistencia. Estas secuencias nucleotídicas y otras obtenidas de la base de datos Genbank se utilizaron para desarrollar una técnica basada en la RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) que permite detectar el virus con un alto grado de sensibilidad y cuantificar en un amplio rango dinámico. Se diseñaron los iniciadores y una sonda TaqMan MGB a partir de segmentos de secuencia conservados para que fueran válidos para todos los aislados del TSWV. También se desarrollaron dos sondas Taqman que permitían cuantificar diferencialmente variantes genéticas del virus en infecciones mixtas. La RT-qPCR se utilizó para evaluar la acumulación de varios aislados del TSWV en tomate sin Sw-5, pimiento sin Tsw y Datura stramonium, así como, en su principal vector F. occidentalis que se usó para evaluar la eficiencia de la transmisión. Se observó que la superación de la resistencia no suponía un coste en la eficacia biológica (fitness) tanto en la multiplicación del virus en estas plantas como en la transmisión por trips. Por tanto, los aislados que superan las resistencias tienen la misma capacidad de dispersión en campo que los aislados convencionales. Por último, se utilizó la RT-qPCR y la información obtenida para evaluar la capacidad de resistencia y tolerancia al TSWV de una accesión de Capsicum baccatum. El nivel de resistencia se estimó a partir de dos variables: A) la eficacia absoluta, calculada a partir de la variación en el tiempo del título viral, cuantificado por RT-qPCR; y B) la infectividad, como la mediana del tiempo que tarda el virus en ser detectado en una planta por ELISA. El nivel de tolerancia se estimó como la mediana del tiempo que tarda una planta en mostrar síntomas graves. Esta nueva accesión es parcialmente resistente y totalmente tolerante tanto para aislados del TSWV convencionales como para aquellos capaces de infectar e inducir síntomas severos en variedades de pimiento con el gen Tsw. Por tanto, esta nueva variedad de C. baccatum es un buen candidato para usarlo en programas de mejora genética de pimiento. / [CAT] Tomato spotted wilt virus (TSWV) és un dels virus més estesos i de major importància econòmica del món. Infecta a un gran nombre d'espècies vegetals i els cultius de tomaca i pebrot són alguns dels més afectats. Aquest virus es transmet d'una planta a una altra, per trips de manera propagativa i circulativa, i Flankliniella occidentalis és el més eficaç. El cultiu de varietats resistents de tomaca i pebrot (en els quals s'han introduït per millora genètica els gens Sw-5 i Tsw, respectivament) va permetre el control de la malaltia, ja que aquests gens indueixen una resposta hipersensible i impedeixen la infecció sistèmica del virus (resistència total). No obstant açò, amb freqüència apareixen aïllats del virus que són capaços de superar aquestes resistències. Per a obtenir un control de la malaltia més eficaç i durador és necessari: A) la caracterització genètica i biològica dels aïllats del TSWV que superen i no superen les resistències; B) l'estudi dels factors evolutius i epidemiològics implicats en l'aparició i establiment dels aïllats que superen les resistències; C) el desenvolupament d'eines que permeten la detecció i quantificació d'aquests aïllats virals; i D) l'avaluació de noves fonts de resistència (total o parcial, que dificulten la infecció i multiplicació viral) o tolerància (total o parcial, que dificulten l'aparició de símptomes i danys encara que no tinguen un efecte en la infecció viral). En aquest treball s'han caracteritzat biològicament i molecularment diferents aïllats del TSWV procedents de cultius de tomaca i pebrot d'Espanya. Es va determinar la seqüència nucleotídica del genoma complet de tres aïllats espanyols corresponents a tres biotips: N (incapaç d'infectar varietats resistents de tomaca o pebrot); T (supera la resistència Sw-5 de tomaca); i P (supera la resistència Tsw de pebrot). Els resultats van mostrar que no hi havia una correlació entre la variació genètica i la capacitat de superar la resistència. Aquestes seqüències nucleotídiques i altres obtingudes de la base de dades Genbank es van utilitzar per a desenvolupar una tècnica basada en la RT-qPCR que permet detectar el virus amb un alt grau de sensibilitat i quantificar en un ampli rang dinàmic. Es van dissenyar els iniciadors i una sonda TaqMan MGB a partir de segments de seqüència conservats perquè foren vàlids per a tots els aïllats del TSWV. Tambe es van desenvolupar dos sondes Taqman que permetien quantificar diferencialment variants genètiques del virus en infeccions mixtes. La RT-qPCR es va utilitzar per a avaluar l'acumulació de diversos aïllats del TSWV en tomaca sense Sw-5, pebrot sense Tsw i Datura stramonium així com, en el seu principal vector F. occidentalis que es va usar per a avaluar l'eficiència de la transmissió. Es va observar que la superació de la resistència no suposava un cost en l'eficàcia biològica (fitness) tant en la multiplicació del virus en aquestes plantes com en la transmissió per trips. Per tant, els aïllats que superen les resistències tenen la mateixa capacitat de dispersió en camp que els aïllats convencionals. Finalment, es va utilitzar la RT-qPCR i la informació obtinguda per a avaluar la capacitat de resistència i tolerància d'una accessió de Capsicum baccatum al TSWV. El nivell de resistència es va estimar a partir de dues variables: A) l'eficàcia absoluta, calculada a partir de la variació en el temps del títol viral, quantificat per RT-qPCR; i B) la infectivitat, com la mitjana del temps que es tarda a detectar el virus en una planta per mitjèr d'ELISA. El nivell de tolerància es va estimar com la mitjana del temps que tarda una planta a mostrar símptomes greus. Aquesta nova accessió és parcialment resistent i totalment tolerant tant per a aïllats del TSWV convencionals com per a aquells capaços d'infectar i induir símptomes severs en varietats amb el gen Tsw. Per tant, aquesta nova varietat d / Debreczeni, DE. (2015). Caracterización de aislados del virus del bronceado del tomate (TSWV) que superan las resistencias de los genes Sw-5 en tomate y Tsw en pimiento. Identificación de una fuente de tolerancia en pimiento [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51460 / TESIS