Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-25T19:12:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Ana Paula Sampaio Feitosa.pdf: 3707255 bytes, checksum: 56c270d2bf8dd01798cd86abcc07a877 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T19:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Ana Paula Sampaio Feitosa.pdf: 3707255 bytes, checksum: 56c270d2bf8dd01798cd86abcc07a877 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / CNPQ / O Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) é um ectoparasita de cães domésticos e possui grande importância médica e veterinária por está associado à transmissão de inúmeros patógenos, entre eles existe a suspeita do mesmo está associado à transmissão da Leishmania infantum. O objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta imune inata celular e humoral através da caracterização morfológica e ultraestrutural de hemócitos, avaliação da dinâmica hemocitária no 1º, 2º e 5º dia após infecção (dpi) com L. infantum, fagocitose com 1º dpi, atividade da fenoloxidase no 1º, 2º e 5º dpi, produção de óxido nítrico no 1º, 2º e 5º dpi, expressão gênica da denfesina e Glutationa S-transferase em Rh. sanguineus no tempo 0 e no 1º, 2º, 5º e 7º dpi, além de avaliar a permanência do parasita no tempo 0 e nos dias 1, 2, 5 e 7 após a infecção com L. infantum (dpi). Foram identificados cinco tipos celulares, prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos e adipohemócitos na hemolinfa do Rh. sanguineus. A partir da contagem total e diferencial dos hemócitos circulantes na hemolinfa de fêmeas de Rh. sanguineus a média do número total de hemócitos no grupo inoculado com L. infantum apresentou-se significantemente elevado (P < 0.001), no 1° e 2° dpi em relação ao grupo controle. Na contagem diferencial de hemócitos observou-se que a percentagem de plasmatócitos e granulócitos no grupo infectado, aumentou significantemente no 1°, 2° e 5° dpi (P < 0.001). Nos ensaios de fagocitose observou-se que plasmatócitos e granulócitos foram capazes de realizar fagocitose de partículas de látex e promastigotas de L. infantum, no 1dpi. A produção de NO aumentou significativamente (P < 0.05) no 2° e 5° dpi e a atividade da PO apresentou aumento significativo (P < 0.05) no 5° dpi. A expressão do gene 18S ribossomal de L. infantum teve um aumento significativo (P < 0.05) no 2°, 5° e 7° após a infecção em relação ao tempo 0. A expressão da GST foi maior no 1º e 2º dpi e o gene defensina foi maior apenas no 5º dpi. Embora não existam estudos sobre a resposta do Rh. sanguineus frente a infecção com L. infatum, estes resultados sugerem, que após a infecção com L.infantum a resposta imune celular e humoral em Rh. sanguineus é ativada, porém mais estudos são necessários para avaliar o impacto dessa resposta no combate a infecção. / The Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) is an ectoparasite of domestic dogs and has great medical and veterinary importance for being associated with the transmission of many pathogens, among them there is a suspicion of it is association with the transmission of Leishmania infantum. The aim of this study was to evaluate the innate cellular and humoral immune response by morphological and ultrastructural characterization of hemocytes, hemocyte dynamics evaluation, phagocytosis, phenoloxidase activity, nitric oxide production at the 1st, 2nd and 5th dpi, gene expression of denfesina and Glutathione S-transferase in Rh . sanguineus and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum and to evaluate the persistence of the parasite at time 0 and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum (dpi). Five cell types were identified, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, and spherulocytes adipohemocytes in Rh. sanguineus hemolymph. From the total and differential counts of circulating hemocytes in the hemolymph of Rh. sanguineus females the average of total number of hemocytes in the group inoculated with L. infantum showed to be significantly higher (P <0.001), on 1st and 2nd dpi in comparison to control group. In differential counting of hemocytes, it was observed that the percentage of granulocytes and plasmatocytes in the infected group, increased significantly at the 1st, 2nd and 5th dpi (P <0.001). In phagocytosis assays, it was observed that plasmatocytes and granulocytes were able to perform phagocytosis of latex particles and promastigotes of L. infantum, 1 day after infection. NO production increased significantly (P < 0.05) in the 1st, 2nd and 5th dpi and the PO activity increased significantly (P < 0.05) in the 5th dpi. The expression of the 18S ribosomal gene expressed by L. infantum had a significant increase (P < 0.05) in the 2st, 5th and 7th after infection in comparison to time 0. The expression of GST was higher in the 1st and 2nd dpi and the defensin gene was higher only in 5 dpi. Although there are no studies on Rh. sanguineus response against infection with L. infatum, these results suggest that after infection with L.infantum cellular and humoral immune response in Rh. sanguineus is activate, nevertheless more studies are needed to assess the impact of such response in fighting infection.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4457_1.pdf: 709167 bytes, checksum: 707d288c9f1344376a950479e85de8a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Os carrapatos são importantes vetores de doenças nas regiões tropicais e subtropicais. Rhipicephalus sanguineus é um ixodídeo causador de severa espoliação nos canídeos e vetor de doenças como as hematozooses (Babesia canis; Ehrlichia canis). Este trabalho avaliou a ação de Metarhizium anisopliae var. anisopliae, Metarhizium anisopliae var. acridum e Beauveria bassiana sobre R. sanguineus, inoculados sob a forma de contato conidial seco e mantidos à temperatura ambiente de ±28°C. Foi avaliado, também, o comportamento fúngico pós-infecção. A ação dos fungos estudados sobre R. sanguineus interferiu na média do peso da massa de ovos, ressaltando-se o tratamento com M. anisopliae var. anisopliae (0,054gtratado e 0,108gcontrole). A maior média do peso residual ocorreu no tratamento com M. anisopliae var. anisopliae (0,053gtratado e 0,022gcontrole). Para o período de pré-postura a menor média foi observada no tratamento com M. anisopliae var. acridum (4,50diatratado e 5,20diacontrole). O período de postura no grupo tratado com M. anisopliae var. anisopliae alcançou a menor média (9,14diatratado e 11,80diacontrole). O menor índice de produção médio de ovos foi observado no tratamento com M. anisopliae var. anisopliae (28,34%tratado e 58,31%controle) e que a menor eficiência reprodutiva média alcançada foi para o grupo tratado com M. anisopliae var. anisopliae (348,62% e 11512,53%controle). Beauveria bassiana apresentou menor média de incubação de ovos (12,50diatratado e 11,90diacontrole). O menor percentual de eclosão médio de larvas foi obtido no tratamento com M. anisopliae var. anisopliae (32,06%tratado e 99,59%controle), com período médio de eclosão de 10,71diatratado e11,00diacontrole. No estudo do comportamento dos fungos pós-infecção observou-se que o percentual de germinação médio de conídios de B. bassiana foi o mais alto (46,39% tratado e 30,66 %controle). B. basssiana esporulou melhor durante os 12 dias de observação. O número da colônia de M. anisopliae var. acridum foi maior nos 12 dias observados e no diâmetro da colônia de B. basssiana obteve melhor resultado nos 12 dias de observação. Na análise morfológica não foi identificada diferença nas estruturas reisoladas. (P > 0,05)

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de E. canis em cultivo celular, no 27o dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E. canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no HOVET, foi obtido no 14o dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às seqüências dos genes 16S r RNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos &plusmn; 40) de 31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP), respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população 4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações 1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank. Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães no país. / The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital (HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E. canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks, being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14 when dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E. canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies Anti-E. canis (titers &plusmn; 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9% (58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar (P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II, SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E. canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in this country.

Dentro do gênero Rhipicephalus, há o chamado complexo sanguineus formado por várias espécies presentes apenas no Velho Mundo, das quais apenas a espécie Rhipicephalus sanguineus é considerada de ocorrência no Novo Mundo. Como as espécies deste complexo apresentam grande similaridade morfológica, é possível que mais de uma espécie do complexo sanguineus esteja ocorrendo nas Américas. Um trabalho recente relatou parâmetros biológicos e genéticos significativamente diferentes entre uma população de R. sanguineus do Brasil e outra da Argentina, sugerindo que o status biosistemático de R. sanguineus na América do Sul deva ser revisto. Diante disto, e da inquestionável importância medico-veterinária de R. sanguineus na América do Sul, este projeto objetivou realizar uma análise genética de 32 populações de R. sanguineus, sendo 17 do Brasil (englobando 13 estados), 3 do Chile, 2 da Venezuela, 2 da Colômbia e 1 de cada um dos seguintes países: Argentina, Uruguai, Itália, Espanha, África do Sul, Costa Rica, Panamá, México. Uma amostra de Rhipicephalus turanicus da Espanha e uma da África do sul também foram analisadas. Para tal, carrapatos oriundos das diferentes populações foram analisados geneticamente através de seqüências dos genes mitocondriais 16S rDNA. O resultado deste trabalho permitiu inferir sobre a possibilidade da existência no mínimo de dois grupos distintos de carrapatos sob o táxon R. sanguineus na América Latina, um se aproximando dos carrapatos de origem africana e com distribuição na América tropical e subtropical e outro se aproximando das amostras européias e com distribuição temperada do sul da América do Sul / Among the genus Rhipicephalus, there is the sanguineus complex composed by many species of distribution restricted to the Old World. It has been considered that Rhipicephalus sanguineus is the only species from this complex to be present in the New World. Due to the high similarity between the sanguineus complex species, it is possible that more than one species is present in the Americas, as suggested by recent papers. The present study performed a genetic evaluation based on 16S rDNA mitochondrial gene sequences of ticks representative 26 R. sanguineus populations from South America, one from: Italy, Spain, South Africa, Costa Rica, Panama, Mexico. Additionally, Rhipicephalus turanicus ticks from South Africa and Spain were also used. The results confirm the existence of genetically distinct populations of the \"sanguineus\" complex in the Americas

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - NATHALIE COSTA DA CUNHA.pdf: 1106704 bytes, checksum: acf94c83c9ed46a4ae020bccfdfe1db8 (MD5) Previous issue date: 2009-02-19 / Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Diseases caused by rickettsiae are widely distributed worldwide and are associated with hematophagous arthropods. The bacteria Rickettsia rickettsii is the most pathogenic of the spotted fever group (SFG). In order to know the factors that led to the occurrence of the disease in this area and acquire more knowledge in the epidemiology of SF in Brazil, as their vectors and the sentinel animals, this study have had the following objectives: verify the occurrence of dogs and horses serological reactive to R. rickettsii, using the technique of indirect immunofluorescence assay (IFA); evaluate the potential of dogs and horses as sentinels for the occurrence SF; better understand the population of ixodidae in dogs and horses and evaluate by molecular tools the presence of the spotted fever group rickettsiae (SFGR) in ticks. It was found that 29 (27.62%) sera of dogs were reactive, with titles ranging from 1:64 to 1:4096 and 76 sera (72.38%) were not reactive. In the analysis of horses there was a total of 9 (9.4%) animals reactive and 87 (90.6%) not reactive to the IFA. It was collected a total of 470 ticks of dogs, which showed a percentage of infestation of 44%. It was identified the species Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense, A. aureolatum, A. ovale and Rhipicephalus (Boophilus) microplus and nymphs of Amblyomma sp., R. sanguineus and R. (B.) microplus, and 33 larvae. A total of 975 ticks were collected from horses, the species: A. cajennense, R. (B.) microplus and Dermacentor (Anocentor) nitens. It was also collected nymphs of Amblyomma sp., R. (B.) microplus and D. (A.) nitens, and 15 larvae. Considering the total number of horses observed, 71% were parasitized by ticks. The polymerase chain reaction (PCR) was performed on samples of blood and ticks of dogs that had positive serology. Thus, it was submitted to the technique 82 ticks. Only one tick of the species R. sanguineus showed PCR positive, and amplified for the four primers studied (ompA, ompB, gltA and htrA). This tick infested canine founded the property where there were the cases of SF. The rate of infection in ticks was 1.22%. The sequence had similarity of 99,3% with deposits in GenBank of R. rickettsii. Based on the results observed in the studied region, it can be concluded that dogs were important sentinels for the agent of SF; canines regular contact with forests and pastures positively influenced the reactive infection by R. rickettsii; dogs coming from properties at least six kilometers away from the outbreak were reactive to SFGR, confirming the concept of endemic area; canine remained reactive to the SFGR to at least one year after the occurrence of five cases of Brazilian spotted fever diagnosed in 2006; the population of ixodidae found corroborates with other studies in areas endemic for SF. The presence of the bacteria R. rickettsii in the tick R. sanguineus in natural conditions have demonstrated a likely chance of participation of the transmission vector of R. rickettsii to humans in the area of study. / As enfermidades causadas por rickettsias s?o amplamente distribu?das no mundo e est?o associadas a artr?podes hemat?fagos. A bact?ria Rickettsia rickettsii ? a mais patog?nica das rickettsias do grupo da febre maculosa (RGFM). No Munic?pio de Resende, Estado do Rio de Janeiro, cinco casos de febre maculosa (FM) ocorreram em uma mesma fam?lia. Com intuito de conhecer os fatores que levaram ? ocorr?ncia da doen?a nesta localidade e adquirir mais conhecimentos na epidemiologia da FM no Brasil, o presente estudo teve os seguintes objetivos: verificar a ocorr?ncia de caninos e equinos reativos sorologicamente ? R. rickettsii, utilizando a t?cnica de rea??o de imunofluoresc?ncia indireta (RIFI); avaliar o potencial dos caninos e equinos como sentinelas para a ocorr?ncia de FM; conhecer a fauna de ixod?deos dos c?es e equinos e avaliar por meio de ferramentas moleculares a presen?a de RGFM em carrapatos. Verificou-se que 29 (27,62%) dos soros caninos foram reativos, com t?tulos variando de 1:64 a 1:4096 e 76 (72,38%) soros foram n?o reativos. Na an?lise soroepidemiol?gica dos equinos observou-se um total de 9 (9,4%) animais reativos e 87 (90,6%) n?o reativos ? RIFI. Coletou-se um total de 470 carrapatos dos caninos, que apresentaram um percentual de infesta??o de 44%. Foram identificadas as esp?cies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense, A. aureolatum, A. ovale e Rhipicephalus (Boophilus) microplus e ninfas de Amblyomma sp., R. sanguineus e R.(B.) microplus e 33 larvas. Coletou-se um total de 975 carrapatos dos equinos, que apresentaram um percentual de infesta??o de 71%, pertencentes ?s seguintes esp?cies: A. cajennense, R.(B.) microplus e Dermacentor (Anocentor) nitens. Tamb?m foram coletadas ninfas de Amblyomma sp., R.(B.) microplus e D.(A.) nitens e 15 larvas. A rea??o em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em amostras de carrapatos dos caninos que apresentaram sorologia positiva, sendo submetidos ? t?cnica 82 carrapatos. Apenas um carrapato da esp?cie R. sanguineus apresentou-se positivo na PCR, tendo amplificado para os quatro marcadores estudados (ompA, ompB, gltA e htrA). Este carrapato infestava canino procedente da propriedade onde ocorreram os casos de FM. A taxa de infec??o nos carrapatos foi de 1,22%. A sequ?ncia teve similaridade de 99,3% com dep?sitos no GenBank de R. rickettsii. Com base nos resultados observados na regi?o estudada, pode-se concluir que os c?es foram importantes sentinelas para o agente da febre maculosa; o h?bito de caninos frequentarem matas e pastos influenciou positivamente na presen?a de anticorpos s?ricos anti-RGFM; os caninos provenientes de propriedades a pelo menos seis quil?metros de dist?ncia a partir do local de ocorr?ncia dos casos foram reativos a RGFM, confirmando o conceito de ?rea end?mica; caninos permaneceram reativos para RGFM pelo menos um ano ap?s a ocorr?ncia dos cinco casos de FM brasileira diagnosticados em 2006; a fauna de ixod?deos encontrada corrobora com dados de outros estudos em regi?es end?micas para FM; a presen?a, em condi??es naturais, de Rickettsia rickettsii no carrapato Rhipicephalus sanguineus indica uma poss?vel participa??o deste vetor na transmiss?o de R. rickettsii para humanos na ?rea estudada.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2018-11-28T12:09:02Z No. of bitstreams: 1 2010 - Francisco de Assis Ribeiro.pdf: 1446521 bytes, checksum: 1539b67c73688bab6449f2b66eab899e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-28T12:09:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Francisco de Assis Ribeiro.pdf: 1446521 bytes, checksum: 1539b67c73688bab6449f2b66eab899e (MD5) Previous issue date: 2010-12-09 / This study aimed to evaluate the proposed amendments in different stages of Rhipicephalus sanguineus submitted to arthropod growth regulator (AGR's), pyriproxyfen, in rabbits treated. The study was conducted on the premises of the Laborat?rio de Quimioterapia Experimental em Parasitologia Veterin?ria (LQEPV) from the Departamento de Parasitologia Animal of the Institute of Veterinary, Universidade Federal do Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ) located in the municipality of Serop?dica. Growth regulators represent a new category that has been used widely in the control of ectoparasites of small animals. This group has no chemical effect "knockdown", acts slowly and gradually interfering with their growth and development. The AGR's were divided according to their mechanism of action on juvenile hormone analogues, benzoylphenyl ureas - acting in the inhibition of chitin synthesis inhibitors and deposition of chitin. The pyriproxyfen is one of the smallest juvenile hormone analogues marketed as topical treatment for the prophylactic control of fleas on dogs and cats. The experiment was divided into three stages, and in each of 24 rabbits were divided into control group, group treated with 1% pyriproxyfen treated with pyriproxyfen 1.5% and treated with 2% pyriproxyfen. The stage I (stage adult) rabbits were infested with 25 pairs of adult R. sanguineus per rabbit. In stage II (stage larvae) the rabbit were infested with larvae of R. sanguineus at a rate of 2300 larvae / rabbit. In the stage III (nymph stage), the rabbit were infested with 200 nymphs / rabbit. The dose of pyriproxyfen applied in the form "pour-on" at all stages was 10ml/kg body weight, and 0.5 ml in each ear and the rest on the back of the animal. Trials during the parasitic phase were conducted in environmental conditions in the period from February to August 2008, and the stage is not parasitic in controlled laboratory conditions (27 ? 1? C and 80 ? 10% RH in scotophase). We analyzed parameters of the parasitic phase and not parasitic to the larvae, nymphs and adults. The pyriproxyfen caused changes in the biology of R. sanguineus such as decrease in the recovery of evolutionary forms, reduction in weight of the egg mass, increased during the incubation period of eggs, decreased reproductive efficiency rate, inhibition of moulting between stages from larva to nymph, effective in inhibiting reproductive behavior of females and lethargic, but no concentration was observed in action on nymphs. It is concluded that focuses on employee pyriproxyfen at a concentration of 2% was effective in controlling rabbits and promoted behavioral changes in R. sanguineus that indicate the possibility of employment of AGR to control this tick, with the difference in reducing the rate of reinfestation. However, new studies should be carried out on the efficacy of pyriproxyfen to 2% in the control of R. sanguineus when used in dogs. The use of rabbits was a preliminary test to indicate whether or not the activity of pyriproxyfen on the tick R. sanguineus. / A realiza??o deste estudo teve como objetivo avaliar as altera??es morfol?gicas e biol?gicas apresentadas em diferentes fases evolutivas de Rhipicephalus sanguineus submetidos ao regulador de crescimento de artr?podes (AGR?s), piriproxifen, em coelhos tratados. O trabalho foi realizado nas depend?ncias do Laborat?rio de Quimioterapia Experimental em Parasitologia Veterin?ria (LQEPV), pertencente ao Departamento de Parasitologia Animal do Instituto de Veterin?ria da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), localizada no munic?pio de Serop?dica. Os reguladores de crescimento representam uma nova categoria que vem sendo empregada amplamente no controle de ectoparasitos de pequenos animais. Este grupo qu?mico n?o apresenta efeito ?knockdown?, atua de forma lenta e gradual interferindo no seu crescimento e desenvolvimento. Os AGR?s foram divididos de acordo com o seu mecanismo de a??o, em an?logos do horm?nio juvenil, benzoilfenil ur?ias - atuando na inibi??o da s?ntese de quitina e inibidores da deposi??o de quitina. O piriproxifen apresenta uma das menores estruturas qu?micas dentre os an?logos dos horm?nios juvenis introduzido no mercado como tratamento t?pico para o controle profil?tico de pulgas em c?es e gatos. O experimento foi dividido em 3 etapas, sendo que em cada uma delas utilizados 24 coelhos, divididos em grupos controle, grupo tratado com piriproxifen a 1%, tratado com piriproxifen a 1,5% e tratado com piriproxifen a 2%. A etapa I (fase de adultos) os coelhos foram infestados com 25 casais de adultos de R. sanguineus por coelho. Na etapa II (fase de larvas) os coelhos foram infestados com larvas de R. sanguineus na raz?o de 2300 larvas/coelho. Na etapa III (fase de ninfa), os coelhos foram infestados com 200 ninfas/coelho. A dose de piriproxifen aplicada sob a forma ?pour-on? em todas as etapas foi de 10mL/kg de peso vivo, sendo 0,5mL em cada orelha e o restante no dorso do animal. As experimenta??es durante a fase parasit?ria foram realizadas em condi??es ambientais, no per?odo de fevereiro a agosto de 2008, e da fase n?o parasit?ria em condi??es controladas de laborat?rio (27 ? 1 ?C e 80 ? 10% UR, em escotofase). Foram analisados par?metros de fase parasit?ria e n?o parasit?ria, para larvas, ninfas e adultos. O piriproxifen causou altera??es na biologia de R. sanguineus tais como: diminui??o na recupera??o das formas evolutivas, diminui??o no peso da massa de ovos, aumento no per?odo de incuba??o dos ovos, diminui??o do ?ndice de efici?ncia reprodutiva, inibi??o do processo de ecdise entre os est?gios de larva para ninfa, efic?cia na inibi??o da reprodu??o das f?meas e comportamento let?rgico, no entanto em nenhuma concentra??o foi observada a??o sobre ninfas. Conclui-se que o piriproxifen empregado na concentra??o de 2% foi eficaz no controle de R. sanguineus em coelhos, promovendo altera??es comportamentais indicando a possibilidade de emprego deste AGR no controle desse carrapato, com a particularidade na redu??o da taxa de reinfesta??o. Entretanto novos estudos necessitam ser realizados visando a efic?cia do piriproxifen a 2% no controle de R. sanguineus quando empregado em c?es. O uso de coelhos foi um teste preliminar para demonstrar a atividade do piriproxifen sobre o carrapato R. sanguineus

Dentro do gênero Rhipicephalus, há o chamado complexo sanguineus formado por várias espécies presentes apenas no Velho Mundo, das quais apenas a espécie Rhipicephalus sanguineus é considerada de ocorrência no Novo Mundo. Como as espécies deste complexo apresentam grande similaridade morfológica, é possível que mais de uma espécie do complexo sanguineus esteja ocorrendo nas Américas. Um trabalho recente relatou parâmetros biológicos e genéticos significativamente diferentes entre uma população de R. sanguineus do Brasil e outra da Argentina, sugerindo que o status biosistemático de R. sanguineus na América do Sul deva ser revisto. Diante disto, e da inquestionável importância medico-veterinária de R. sanguineus na América do Sul, este projeto objetivou realizar uma análise genética de 32 populações de R. sanguineus, sendo 17 do Brasil (englobando 13 estados), 3 do Chile, 2 da Venezuela, 2 da Colômbia e 1 de cada um dos seguintes países: Argentina, Uruguai, Itália, Espanha, África do Sul, Costa Rica, Panamá, México. Uma amostra de Rhipicephalus turanicus da Espanha e uma da África do sul também foram analisadas. Para tal, carrapatos oriundos das diferentes populações foram analisados geneticamente através de seqüências dos genes mitocondriais 16S rDNA. O resultado deste trabalho permitiu inferir sobre a possibilidade da existência no mínimo de dois grupos distintos de carrapatos sob o táxon R. sanguineus na América Latina, um se aproximando dos carrapatos de origem africana e com distribuição na América tropical e subtropical e outro se aproximando das amostras européias e com distribuição temperada do sul da América do Sul / Among the genus Rhipicephalus, there is the sanguineus complex composed by many species of distribution restricted to the Old World. It has been considered that Rhipicephalus sanguineus is the only species from this complex to be present in the New World. Due to the high similarity between the sanguineus complex species, it is possible that more than one species is present in the Americas, as suggested by recent papers. The present study performed a genetic evaluation based on 16S rDNA mitochondrial gene sequences of ticks representative 26 R. sanguineus populations from South America, one from: Italy, Spain, South Africa, Costa Rica, Panama, Mexico. Additionally, Rhipicephalus turanicus ticks from South Africa and Spain were also used. The results confirm the existence of genetically distinct populations of the \"sanguineus\" complex in the Americas

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de E. canis em cultivo celular, no 27o dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E. canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no HOVET, foi obtido no 14o dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às seqüências dos genes 16S r RNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos &plusmn; 40) de 31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP), respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população 4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações 1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank. Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães no país. / The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital (HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E. canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks, being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14 when dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E. canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies Anti-E. canis (titers &plusmn; 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9% (58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar (P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II, SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E. canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in this country.