A poluição relacionada a metais pesados tem recebido uma atenção especial devido a sua alta toxicidade, não biodegradabilidade e tendência de acumular-se na cadeia alimentar. Apesar disso, metais pesados também são considerados recursos valiosos, portanto a sua remoção em conjunto com a sua recuperação torna-se ainda mais importante. Este caso aplica-se aos rejeitos de mineração de cobre, os quais oferecem a possibilidade de recuperação do metal e de sua contenção de maneira segura do meio ambiente. Tais rejeitos se caracterizam por ocuparem enormes áreas inundadas e abrigarem soluções diluídas de cobre (II), porém, muitas vezes, acima dos limites seguros. Diversos processos tradicionais de tratamento mostram-se disponíveis para remover o cobre de tais soluções, no entanto, em certas aplicações eles podem ser ineficientes ou muito onerosos. Nesse contexto, a biossorção é uma alternativa interessante. Nesse processo, certos microrganismos, como fungos, bactérias e algas, ligam-se passivamente ao cobre na forma íons ou outras moléculas em soluções. No presente trabalho foi avaliado o potencial de biossorção de íons cobre (II) pela biomassa do fungo Rhizopus microsporus, coletado e isolado da área de rejeitos da Mina do Sossego, na região norte do Brasil. Isotermas de biossorção foram determinadas experimentalmente em bateladas sob temperatura de 25°C, agitação de 150 rpm, concentração de biomassa de 2,0 a 2,5 g/L e tempo de contato mínimo de 4 horas. O pH mostrou ser um fator importante no equilíbrio da biossorção, sendo o valor máximo da capacidade de biossorção de 33,12 mg de cobre / g biomassa encontrado em pH 6. Valores sucessivamente menores são encontrados pela acidificação da solução, sendo o pH 1 considerado adequado para o processo de dessorção, correspondendo a uma capacidade de biossorção de 1,95 mg/g. Modelos de adsorção de Langmuir e de Freundlich ajustaram-se adequadamente às isotermas tanto com pH controlado quanto não controlado. Foi constatado que a troca iônica é um dos mecanismos envolvidos na biossorção do cobre com Rhizopus microsporus. Tanto o modelo de pseudo-primeira ordem quanto o de pseudo-segunda ordem ajustaram-se aos dados cinéticos da biossorção, sendo que o equilíbrio ocorre em aproximadamente 4 horas. A biomassa conservou a capacidade de biossorção ao operar repetidamente em três ciclos de sorção-dessorção. A biomassa viável e a morta não apresentaram diferença estatisticamente significativa na capacidade de biossorção. / Heavy metal pollution has been receiving a special attention because of the high toxicity of these metals, by their non-biodegradability and by their tendency to accumulate throughout the food chain. Nevertheless, heavy metals are also considered valuable resources, hence their recovery and recycle assumes even greater significance. This is the case of copper mining tailings, which offer the possibility of metal recovery while it must be safely contained from the environment. These wastes are characterized by occupying huge flooded areas with very dilute copper (II) solutions, however, in many cases above safe limits. Various traditional treatment methods are available to remove copper from such solutions; however, for certain applications they may be either ineffective or too costly. In this context, biosorption becomes an interesting alternative. In this process, certain microorganisms such as fungi, bacteria and algae, passively bind to the copper ion or other molecules in solution. In the present study the biosorption potential of copper (II) by the fungal biomass of Rhizopus microsporus, collected and isolated from the tailings area of Sossego mine, located in the northern region of Brazil, has been evaluated. Biosorption isotherms have been experimentally determined by batch experiments at a temperature of 25C, agitation speed of 150 rpm, biosorbent concentration in the range of 2.0 to 2.5 mg/L, and contact time of at least 4 hours. The pH has been found to be a determining factor for the sorption equilibrium, a maximum sorption capacity of 33.12 mg copper / g biomass being found at pH 6. Successively smaller values have been found by the acidification of the solution. A pH value of 1 has been considered adequate for the desorption process, which correspond to a biosorption capacity of 1,95 mg/g. Both Langmuir and Freundlich adsorption models fitted well to equilibrium data using both pH methodologies, however the determination coefficient is slightly higher for the former model. It has been found that ion exchange is one of the mechanisms involved in copper (II) biosorption by Rhizopus microsporus. Both pseudo-first and pseudo-second order models have fitted well to biosorption kinetic data. Equilibrium approaches within approximately 4 hours. The biosorbent has proved to maintain its sorption efficiency after three regeneration cycles. Viable and dead biomasses have not exhibited statistically significant difference in sorption behavior.

A poluição relacionada a metais pesados tem recebido uma atenção especial devido a sua alta toxicidade, não biodegradabilidade e tendência de acumular-se na cadeia alimentar. Apesar disso, metais pesados também são considerados recursos valiosos, portanto a sua remoção em conjunto com a sua recuperação torna-se ainda mais importante. Este caso aplica-se aos rejeitos de mineração de cobre, os quais oferecem a possibilidade de recuperação do metal e de sua contenção de maneira segura do meio ambiente. Tais rejeitos se caracterizam por ocuparem enormes áreas inundadas e abrigarem soluções diluídas de cobre (II), porém, muitas vezes, acima dos limites seguros. Diversos processos tradicionais de tratamento mostram-se disponíveis para remover o cobre de tais soluções, no entanto, em certas aplicações eles podem ser ineficientes ou muito onerosos. Nesse contexto, a biossorção é uma alternativa interessante. Nesse processo, certos microrganismos, como fungos, bactérias e algas, ligam-se passivamente ao cobre na forma íons ou outras moléculas em soluções. No presente trabalho foi avaliado o potencial de biossorção de íons cobre (II) pela biomassa do fungo Rhizopus microsporus, coletado e isolado da área de rejeitos da Mina do Sossego, na região norte do Brasil. Isotermas de biossorção foram determinadas experimentalmente em bateladas sob temperatura de 25°C, agitação de 150 rpm, concentração de biomassa de 2,0 a 2,5 g/L e tempo de contato mínimo de 4 horas. O pH mostrou ser um fator importante no equilíbrio da biossorção, sendo o valor máximo da capacidade de biossorção de 33,12 mg de cobre / g biomassa encontrado em pH 6. Valores sucessivamente menores são encontrados pela acidificação da solução, sendo o pH 1 considerado adequado para o processo de dessorção, correspondendo a uma capacidade de biossorção de 1,95 mg/g. Modelos de adsorção de Langmuir e de Freundlich ajustaram-se adequadamente às isotermas tanto com pH controlado quanto não controlado. Foi constatado que a troca iônica é um dos mecanismos envolvidos na biossorção do cobre com Rhizopus microsporus. Tanto o modelo de pseudo-primeira ordem quanto o de pseudo-segunda ordem ajustaram-se aos dados cinéticos da biossorção, sendo que o equilíbrio ocorre em aproximadamente 4 horas. A biomassa conservou a capacidade de biossorção ao operar repetidamente em três ciclos de sorção-dessorção. A biomassa viável e a morta não apresentaram diferença estatisticamente significativa na capacidade de biossorção. / Heavy metal pollution has been receiving a special attention because of the high toxicity of these metals, by their non-biodegradability and by their tendency to accumulate throughout the food chain. Nevertheless, heavy metals are also considered valuable resources, hence their recovery and recycle assumes even greater significance. This is the case of copper mining tailings, which offer the possibility of metal recovery while it must be safely contained from the environment. These wastes are characterized by occupying huge flooded areas with very dilute copper (II) solutions, however, in many cases above safe limits. Various traditional treatment methods are available to remove copper from such solutions; however, for certain applications they may be either ineffective or too costly. In this context, biosorption becomes an interesting alternative. In this process, certain microorganisms such as fungi, bacteria and algae, passively bind to the copper ion or other molecules in solution. In the present study the biosorption potential of copper (II) by the fungal biomass of Rhizopus microsporus, collected and isolated from the tailings area of Sossego mine, located in the northern region of Brazil, has been evaluated. Biosorption isotherms have been experimentally determined by batch experiments at a temperature of 25C, agitation speed of 150 rpm, biosorbent concentration in the range of 2.0 to 2.5 mg/L, and contact time of at least 4 hours. The pH has been found to be a determining factor for the sorption equilibrium, a maximum sorption capacity of 33.12 mg copper / g biomass being found at pH 6. Successively smaller values have been found by the acidification of the solution. A pH value of 1 has been considered adequate for the desorption process, which correspond to a biosorption capacity of 1,95 mg/g. Both Langmuir and Freundlich adsorption models fitted well to equilibrium data using both pH methodologies, however the determination coefficient is slightly higher for the former model. It has been found that ion exchange is one of the mechanisms involved in copper (II) biosorption by Rhizopus microsporus. Both pseudo-first and pseudo-second order models have fitted well to biosorption kinetic data. Equilibrium approaches within approximately 4 hours. The biosorbent has proved to maintain its sorption efficiency after three regeneration cycles. Viable and dead biomasses have not exhibited statistically significant difference in sorption behavior.

O fungo Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis foi submetido a determinadas condições de cultivo, objetivando produzir substâncias com atividade antimicrobiana. O microorganismo foi transferido da sílica, na qual foi armazenado, e incubado por sete dias em meio aveia-ágar para o crescimento prévio. Em seguida, 4 x 106 esporos/mL de meio foram transferidos para o meio pré-fermentativo e incubado por 24 horas, seguido de transferência para meio fermentativo (meio Czapek, meio Jackson e meio Vogel) e incubado por períodos de tempo determinados. Além disso, foi incubado em meio fermentativo de arroz por 20 dias. Após a fermentação nos diferentes meios, o caldo da cultura foi obtido por filtração e submetido a partições utilizando-se solventes orgânicos: acetato de etila e n-butanol, os quais foram recuperados por evaporação a vácuo. Os extratos obtidos dessas partições foram submetidos aos testes de bioautografia para determinação das frações ostentando atividade antimicrobiana. Os extratos em acetato de etila dos quatro meios fermentativos apresentam tal atividade. As frações ativas foram submetidas a diferentes modalidades cromatográficas para isolamento das substâncias, como a cromatografia liquida em coluna de sílica e a Cromatografia Liquida de Alta Eficiência. Foram isolados quatro metabólitos secundários a partir das frações obtidas em acetato de etila dos meio liquido Jackson e do meio sólido de arroz. Foram identificadas duas dicetopiperazinas (ciclos Leu-Pro e Leu-4-OH-Pro) e um derivado aromático contendo nitrogênio na porção alifática da molécula. Foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) das substâncias isoladas contra os seguintes microorganismos: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Todos os extratos obtidos dos meios de cultura apresentaram atividade contra S. aureus e K. rhizophila, bem como o extrato metanólico dos micélios. Apenas os extratos em n-butanol não foram ativos. Nos ensaios de microdiluição, as três ix substâncias identificadas apresentaram CIMs entre 400 e 350 μg/mL. Os resultados obtidos indicam que o fungo em questão é uma fonte interessante para obtenção de metabólitos secundários. / The fungus Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis was cultivated in different fermentative media aiming to produce secondary metabolites bearing antimicrobial activity. The conidia storage in silica gel was incubated in oat medium for conidia production. After seven days the conidia (4 x 106 conidia/mL) was transferred to a pre-fermentative medium and incubated for 24 h for mycelium production. After that, it was transferred to three fermentative media: Czapek, Jackson and Vogel, and incubated for different periods of time. After fermentation, cultures were filtered and the broth was submitted to partition using ethyl acetate and n-buthanol in sequence, which were, afterwards, recovered under vacuum. The obtained crude extracts were evaluated under bioautography assay aiming to select the most adequate medium for secondary antimicrobial metabolite production. The ethyl acetate extracts obtained from both Jackson and rice media displayed the higher activities. Therefore, they were submitted to different chromatographic means, including silica gel column and HPLC, furnishing four isolated compounds, from which three were identified: two diketopiperazines (cyclos Leu-Pro and Leu-4-OH-Pro) and one aromatic compound containing a nitrogen in the aliphatic moiety. The pure isolated compounds were submitted to microdilution tests against the following bacteria: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 25922) e a Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), aiming to determine their Minimum Inhibitory Concentrations (MIC). All the ethyl acetate extracts displayed antimicrobial activity in the bioautography assays against S. aureus and K. rhizophila, as well as the mycelia methanol extracts. Only the n-butanol extracts did not display activity. Regarding the microdilution assay, three of evaluated pure compounds displayed MIC values between 400 and 350 μg/mL. The obtained results indicated that the studied fungus is an interesting source for biologically active secondary metabolites production.

O fungo Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis foi submetido a determinadas condições de cultivo, objetivando produzir substâncias com atividade antimicrobiana. O microorganismo foi transferido da sílica, na qual foi armazenado, e incubado por sete dias em meio aveia-ágar para o crescimento prévio. Em seguida, 4 x 106 esporos/mL de meio foram transferidos para o meio pré-fermentativo e incubado por 24 horas, seguido de transferência para meio fermentativo (meio Czapek, meio Jackson e meio Vogel) e incubado por períodos de tempo determinados. Além disso, foi incubado em meio fermentativo de arroz por 20 dias. Após a fermentação nos diferentes meios, o caldo da cultura foi obtido por filtração e submetido a partições utilizando-se solventes orgânicos: acetato de etila e n-butanol, os quais foram recuperados por evaporação a vácuo. Os extratos obtidos dessas partições foram submetidos aos testes de bioautografia para determinação das frações ostentando atividade antimicrobiana. Os extratos em acetato de etila dos quatro meios fermentativos apresentam tal atividade. As frações ativas foram submetidas a diferentes modalidades cromatográficas para isolamento das substâncias, como a cromatografia liquida em coluna de sílica e a Cromatografia Liquida de Alta Eficiência. Foram isolados quatro metabólitos secundários a partir das frações obtidas em acetato de etila dos meio liquido Jackson e do meio sólido de arroz. Foram identificadas duas dicetopiperazinas (ciclos Leu-Pro e Leu-4-OH-Pro) e um derivado aromático contendo nitrogênio na porção alifática da molécula. Foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) das substâncias isoladas contra os seguintes microorganismos: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Todos os extratos obtidos dos meios de cultura apresentaram atividade contra S. aureus e K. rhizophila, bem como o extrato metanólico dos micélios. Apenas os extratos em n-butanol não foram ativos. Nos ensaios de microdiluição, as três ix substâncias identificadas apresentaram CIMs entre 400 e 350 μg/mL. Os resultados obtidos indicam que o fungo em questão é uma fonte interessante para obtenção de metabólitos secundários. / The fungus Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis was cultivated in different fermentative media aiming to produce secondary metabolites bearing antimicrobial activity. The conidia storage in silica gel was incubated in oat medium for conidia production. After seven days the conidia (4 x 106 conidia/mL) was transferred to a pre-fermentative medium and incubated for 24 h for mycelium production. After that, it was transferred to three fermentative media: Czapek, Jackson and Vogel, and incubated for different periods of time. After fermentation, cultures were filtered and the broth was submitted to partition using ethyl acetate and n-buthanol in sequence, which were, afterwards, recovered under vacuum. The obtained crude extracts were evaluated under bioautography assay aiming to select the most adequate medium for secondary antimicrobial metabolite production. The ethyl acetate extracts obtained from both Jackson and rice media displayed the higher activities. Therefore, they were submitted to different chromatographic means, including silica gel column and HPLC, furnishing four isolated compounds, from which three were identified: two diketopiperazines (cyclos Leu-Pro and Leu-4-OH-Pro) and one aromatic compound containing a nitrogen in the aliphatic moiety. The pure isolated compounds were submitted to microdilution tests against the following bacteria: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 25922) e a Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), aiming to determine their Minimum Inhibitory Concentrations (MIC). All the ethyl acetate extracts displayed antimicrobial activity in the bioautography assays against S. aureus and K. rhizophila, as well as the mycelia methanol extracts. Only the n-butanol extracts did not display activity. Regarding the microdilution assay, three of evaluated pure compounds displayed MIC values between 400 and 350 μg/mL. The obtained results indicated that the studied fungus is an interesting source for biologically active secondary metabolites production.

Submitted by LOUISE GARBELOTTI GONÇALVES (lou_ise_gg@hotmail.com) on 2016-05-31T17:27:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_GONÇALVES, Louise G._2016.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-05-31T17:56:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 goncalves_lg_me_rcla.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T17:56:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 goncalves_lg_me_rcla.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) Previous issue date: 2016-04-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O desenvolvimento de bioprocessos para produção de alimentos e energia, que utilizam resíduos agroindustriais como matéria-prima, é alvo de intensas pesquisas no mundo devido às limitações de novas fronteiras agrícolas e de fontes de energia renováveis. A utilização de enzimas nesses processos produtivos surge como uma forte tendência, dentre elas, as amilases. O objetivo desse estudo foi a otimização da produção de amilases empregando o fungo Rhizopus microsporus var. oligosporus, cultivado em Fermentação em Estado Sólido (FES), tendo como substrato os resíduos agroindustriais: farelo de trigo, bagaço de mandioca e bagaço de cana de açúcar. O hidrolisado obtido da hidrólise do bagaço de mandioca foi avaliado quanto à sua fermentabilidade por meio da fermentação alcoólica em batelada alimentada por Saccharomyces cerevisiae. A melhor fonte de carbono como substrato para formulação do meio de cultivo foi aquele contendo 100% de farelo de trigo. Em relação às fontes de nutrientes para produção de amilases, a maior atividade amilolítica (418 U/g) foi para a solução de nutrientes contendo (%): 1,34 de sulfato de amônio, 0,54 de monofosfato de amônio (MAP) e 1,86 de ureia. Porém, foi observado que, ao acrescentar um mínimo de 0,01 % (m/m) de extrato de levedura na solução de nutrientes, obteve-se aumento na atividade amilolítica de 418 U/g para 551 U/g. A hidrólise enzimática do bagaço de mandioca foi feita com a associação de celulases comerciais (Novozyme) (10 FPU/g no tempo zero horas) e com o extrato amilolítico (12 U/g no tempo 10 horas de reação) produzido em FES para a obtenção de um hidrolisado concentrado. Com estas condições foi possível converter 63% de bagaço em açúcares redutores com predomínio de glicose. Por meio da fermentação alcoólica em batelada alimentada por Saccharomyces cerevisiae, obteve-se eficiências de 74,6 e 76,8%, e produtividades etanólicas com 3,14 g L-1h-1 e 1,61 g L-1h-1 em 12 e 24 h, respectivamente. A produção de etanol a partir de um hidrolisado de bagaço de mandioca nas condições de hidrólise proposta foi possível, o que corresponde a uma alternativa à tecnologia da cana-de-açúcar para produção deste biocombustível. / The development of bioprocesses for food and energy production, which makes use of agricultural waste as raw material, is focus of intense research around the world due to limitations on new agricultural frontiers and on renewable energy sources. The use of enzymes in these processes emerges as a strong trend, among them, amylases. The aim of this study was the amylase production optimization employing fungus Rhizopus microsporus var. oligosporus, grown by Solid Station Fermentation (SSF), using as substrate these agricultural waste: wheat bran, cassava bagasse and sugarcane bagasse. The hydrolizate obtained from cassava bagasse hydrolysis was evaluated with regards to its fermentability through fed-batch alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. The best carbon source as substrate for the culture medium formulation was the one containing 100% wheat bran. Regarding salts sources for amylases production, the higher amylolytic activity (418 U/g) was for the nutrient solution containing (%): ammonium sulfate 1.34; ammonium monophosphate 0.54 and urea 1.86. However, the addiction of 0.01% (w/w) yeast extract in salts solution, amylolytic activity increased from 418 U/g to 551 U/g. The enzymatic hydrolysis of cassava bagasse was performed with the combination of commercial cellulases (Novozyme) (10 FPU/g at time zero hours) and the amylolytic extract (12 U/g at time 10 hours) produced by SSF to obtain a hydrolizate concentrate. With these conditions it was possible to convert 63% of bagasse in reducing sugars predominantly glucose. Through the fed-batch alcoholic fermentation tests by Saccharomyces cerevisiae, efficiencies were determined as 74.6 and 76.8%, and the ethanolic productivities with 3.14 gL-1h-1 and 1.61 gL-1h-1, at 12 and 24 h, respectively. Ethanol production from cassava bagasse hydrolyzate in hydrolysis conditions proposal was possible, which corresponds to an alternative technology of sugarcane for production of biofuel.