Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1761_1.pdf: 1031584 bytes, checksum: 345a6e044d939eeac61491c7f0844519 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / A serpente Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco), maior responsável pelos acidentes botrópicos no Estado da Bahia, também tem ocorrência registrada em Pernambuco. As alterações na coagulação sangüínea são uma característica relevante no envenenamento provocado pela peçonha de B. leucurus. Enzimas ofídicas que atuam estrategicamente na hemostasia com ação direta sobre o fibrinogênio, convertendo-o em fibrina, são chamadas trombina-símile. Apesar de estarem presentes em diversas peçonhas botrópicas e representarem modelos moleculares para o desenvolvimento de novas drogas e reagentes, poucos estudos têm sido realizados com estas toxinas, inclusive com a peçonha de B. leucurus. Neste trabalho foi realizada a purificação e caracterização parcial de uma toxina trombina-símile da peçonha de B. leucurus. A enzima trombina símile foi obtida a partir do fracionamento de 600 mg da peçonha total de B. leucurus em quatro etapas de purificação: troca iônica em Mono-Q, afinidade em Benzamidina-Sepharose, gel filtração em TSK-G3000 SW e fase reversa em C4. A toxina purificada, denominada BL-TL I, teve um rendimento final de 0,05% e apresentou cadeia única de massa molecular 23 e 31,8 KDa, conforme estimativa em SDS-PAGE em condições não redutoras e redutoras, respectivamente. BL-TL I teve sua atividade parcialmente reduzida após cromatografia em coluna C4, não apresentando atividade sobre os substratos S-2238 e S-2765, bem como ativadora de fator X. Por outro lado, mesmo com reduzida atividade coagulante sobre fibrinogênio, a BL-TL1 foi capaz de hidrolisar o substrato S-2222. A BL-TL1 é a primeira enzima trombina-símile purificada da peçonha de B. leucurus, porém outra técnica complementar deve ser estabelecida para obtenção da toxina com atividade total para estudos subseqüentes, com o intuito de complementar a caracterização da referida toxina.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-09-26T13:15:00Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kayena Delaix Zaqueo.pdf: 7739033 bytes, checksum: 806f81f900a0ed32e6a2052560d17a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-09-26T13:15:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kayena Delaix Zaqueo.pdf: 7739033 bytes, checksum: 806f81f900a0ed32e6a2052560d17a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T13:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kayena Delaix Zaqueo.pdf: 7739033 bytes, checksum: 806f81f900a0ed32e6a2052560d17a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-08-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Snake venoms are formed by organic and inorganic compounds and result in a complex product of biological nature which present as main objectives the detention, death and the promotion of initial digestion of its prey. In addition, presents a vast potential for exploration of molecules with pharmaceutical applications. Among organic compounds protease should be highlighted due its ability to cause changes on hemostatic system. Snake venoms serine proteases (SVSPs) are a class of proteases that act on different factors of the coagulation cascade. One SVSPs class is described as thrombin-like (SVTLEs) by mimicking some thrombin activities and displays coagulant ability in vitro through the degradation of fibrinogen chains α and/or β. The objectives were (i) to characterize structurally BpirSP-39 previously isolated from Bothrops pirajai venom and (ii) to isolate and characterize the first serine protease (SP) of B. brazili. Studies of this magnitude are justified because they can provide important information on the involvement of proteins during envenoming, which can contribute to a better understanding of the mechanisms of action of these enzymes. Primary and tertiary structures model of both isolated SPs were elucidated. BpirSP-39 presented 224 amino acids and has high identity when compared to other SVSPs. BbrzSP-32 was obtained from B. brazili venom after two chromatographic steps (affinity and reverse phase) and its primary structure showed 240 amino acid residues. Both SPs characterized are enzymes which may take the SP’s structure of Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), an enzyme used as a model for molecular modeling. The enzymes are glycoproteins globular and monomeric with two α-helices and two barrels formed by sheet-β. BbrzSP- 32 showed 36 kDa of relative molecular mass and its absolute mass was confirmed by mass spectrometry as 32,520 Da. It present 79.48% identity when compared to other SVSPs and was able to degrade the α-chain of fibrinogen, in vitro models, and is considered a SVTLE-A. It showed a dose-dependent activity in the process of degradation of fibrin networks demonstrating greater specificity for this activity when compared to its thrombolytic action. BbrzSP-32 demonstrated proteolysis activity on gelatin and chromogenic substrates for serine proteases and thrombin-like enzymes (S- 2288 and S-2238 respectively), besides having coagulant activity on human plasma. 13 After pre-incubation with PMSF and benzamidine the coagulants and proteolytic activities on S-2288 and S-2238 substrate were reduced. BbrzSP-32 shows stability against pH and temperature variations, demonstrating optimum activity between 30 and 40 °C and in the pH range 7.5 to 8.5. The enzyme does not induce or interferes with the clotting washed platelets. When incubated with parasites Trypanosoma cruzi or Leishmania infantum, promastigotes and the epimastigote forms, respectively, and S. epidermidis (gram positive-bacteria), the enzyme presented to cytotoxic on microorganisms, furthermore, was able to reduce the biofilm formation by the bacteria species. Both SPs present potential biotechnological. / Os venenos de serpentes são constituídos por compostos orgânicos e inorgânicos, resultando em um produto biológico eficiente e de natureza complexa, que tem como principais objetivos a imobilização, morte e a promoção da digestão inicial das presas. Além disso, apresentam um enorme potencial para prospecção de moléculas com aplicação farmacológica. Dentre os compostos orgânicos destacam-se as proteínas, principalmente as proteases, pois apresentam capacidade em alterar o sistema hemostático. As serinoproteases dos venenos de serpentes (SVSPs) pertencem à classe de proteases que agem sobre diferentes fatores da cascata de coagulação. Uma das classes de SVSPs é descrita como trombina-símile (SVTLEs) por mimetizar algumas atividades da trombina, exibindo capacidade coagulante in vitro por intermédio da degradação das cadeias α e/ou β do fibrinogênio. Os objetivos do trabalho foram (i) caracterizar estruturalmente a BpirSP-39 isolada previamente do veneno de Bothrops pirajai e (ii) isolar e caracterizar a primeira serinoprotease (SP) do veneno de B. brazili. Estudos dessa magnitude justificam-se, pois podem trazer importantes informações sobre a participação das proteínas durante o envenenamento, podendo auxiliar no melhor conhecimento sobre os mecanismos de ações destas enzimas. As estruturas primárias, bem como, os modelos tridimensionais de ambas SPs isoladas foram elucidados. A BpirSP-39 possui 224 aminoácidos e apresenta elevada identidade com outras SVSPs. A BbrzSP-32 foi obtida do veneno de B. brazili após duas etapas cromatográficas (afinidade e fase reversa) e sua estrutura primária apresentou 240 resíduos de aminoácidos. Ambas as enzimas caracterizadas podem assumir a estrutura da SP de Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), proteína utilizada como modelo para a modelagem molecular, sendo glicoproteínas monoméricas globulares com duas α- hélices e dois barris formados por folhas-β. Com relação à BbrzSP-32, por intermédio de eletroforese foi obtida a massa molecular relativa (36 kDa), sendo sua massa absoluta confirmada por espectrometria de massa como 32.520 Da. A BbrzSP-32 possui identidade de até 79,48% quando comparada a outras SVSPs e foi capaz de, em modelos in vitro, degradar a cadeia α do fibrinogênio, sendo considerada uma SVTLE11 A. Possui atividade dose dependente no processo de degradação de redes de fibrina, demonstrando maior especificidade por essa atividade quando comparada à sua ação trombolítica. Apresenta atividade de proteólise sobre gelatina e substratos cromogênicos, para serinoproteases e enzimas trombina-símile (S-2288 e S-2238, respectivamente), além de possuir atividade coagulante sobre o plasma humano. As atividades de proteólise sobre os substratos S-2288 e S-2238, bem como, coagulantes, foram reduzidas por PMSF e benzamidina e, em menor proporção por EDTA. A BbrzSP-32 apresenta relativa estabilidade frente a variações de pH e temperatura, demonstrando maiores atividades entre 30 e 40 ºC e, em intervalo de pH 7,5 à 8,5. A enzima não induz ou interfere na coagulação de plaquetas lavadas. Quando incubada com os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum, nas formas epimastigota e promastigota, respectivamente, e bactérias gram-positiva da espécie Staphylococcus epidermidis, apresentou-se citotóxica sobre os microrganismos, além disso, foi capaz de reduzir o biofilme formado pela espécie de bactéria. Ambas SPs apresentam potenciais biotecnológicos.

A giroxina é uma enzima serinoprotease do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. É uma toxina apenas parcialmente caracterizada e com múltiplas atividades. Atua na coagulação, na diminuição da pressão arterial e induz um comportamento neurotóxico descrito como rolamento em barril. Os mecanismos envolvidos nestas atividades não são conhecidos. Considerando que a giroxina é uma enzima com alto potencial para ser um novo fármaco com aplicações em clínica médica como a trombina, tripsina, ancrod®, batroxobin® e calicreína, é importante determinar como a giroxina atua. As análises em eletroforese em gel de poliacrilamida e dicroísmo circular confirmaram a pureza e integridade da molécula. A administração intravenosa em camundongos comprovou a neurotoxicidade (rolamento em barril). O estudo in vivo com microscopia intravital comprovou que a giroxina induz vasodilatação com participação dos receptores ativados por proteases (PARs), do óxido nítrico e da Na+K+ATPase. A adesão e rolamento de leucócitos indicaram que não possui atividade pró-inflamatória. A giroxina induziu a agregação plaquetária, que foi bloqueada pelos inibidores dos receptores PAR-1 e PAR-4 (SCH 79797 e tcY-NH2, respectivamente). Finalmente, foi demonstrado que a giroxina alterou temporariamente a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Neste estudo foi comprovado que os receptores ativados por proteases e o óxido nítrico são mediadores envolvidos nas atividades biológicas da giroxina. / Gyroxin is a serine protease enzyme from the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom; it is only partially caractherized and has multiple activites. Gyroxin induces blood coagulation, blood pressure decrease and a neurotoxic behavior named barrel rotation. The mechanisms involved in this neurotoxic activity are not known. Whereas gyroxin is a member of enzymes with high potential to become a new drug with clinical applications such as thrombin, batroxobin®, ancrod®, tripsyn and kalicrein, it is important to find out how gyroxin works. The analysis on agarose gel electrophoresis and circular dichroism confirmed the molecules\' integrity and purity. The gyroxin intravenous administration in mice proved its neurotoxicity (barrel rotation). In vivo studies employing intravital microscopy proved that gyroxin induces vasodilation with the participation of protease activated receptors (PARs), nitric oxide and Na+K+ATPase. The leukocytes\' adherence and rolling counting indicated that gyroxin has no proinflammatory activity. Gyroxin induced platelet aggregation, which was blocked by inhibitors of PAR1 and PAR4 receptors (SCH 79797 and tcY-NH2, respectively). Finally, it was proved that the gyroxin temporarily alter the permeability of the blood brain barrier (BBB). Our study has shown that both the protease-activated receptors and nitric oxide are mediators involved in the biological activities of gyroxin.

A giroxina é uma enzima serinoprotease do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. É uma toxina apenas parcialmente caracterizada e com múltiplas atividades. Atua na coagulação, na diminuição da pressão arterial e induz um comportamento neurotóxico descrito como rolamento em barril. Os mecanismos envolvidos nestas atividades não são conhecidos. Considerando que a giroxina é uma enzima com alto potencial para ser um novo fármaco com aplicações em clínica médica como a trombina, tripsina, ancrod®, batroxobin® e calicreína, é importante determinar como a giroxina atua. As análises em eletroforese em gel de poliacrilamida e dicroísmo circular confirmaram a pureza e integridade da molécula. A administração intravenosa em camundongos comprovou a neurotoxicidade (rolamento em barril). O estudo in vivo com microscopia intravital comprovou que a giroxina induz vasodilatação com participação dos receptores ativados por proteases (PARs), do óxido nítrico e da Na+K+ATPase. A adesão e rolamento de leucócitos indicaram que não possui atividade pró-inflamatória. A giroxina induziu a agregação plaquetária, que foi bloqueada pelos inibidores dos receptores PAR-1 e PAR-4 (SCH 79797 e tcY-NH2, respectivamente). Finalmente, foi demonstrado que a giroxina alterou temporariamente a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Neste estudo foi comprovado que os receptores ativados por proteases e o óxido nítrico são mediadores envolvidos nas atividades biológicas da giroxina. / Gyroxin is a serine protease enzyme from the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom; it is only partially caractherized and has multiple activites. Gyroxin induces blood coagulation, blood pressure decrease and a neurotoxic behavior named barrel rotation. The mechanisms involved in this neurotoxic activity are not known. Whereas gyroxin is a member of enzymes with high potential to become a new drug with clinical applications such as thrombin, batroxobin®, ancrod®, tripsyn and kalicrein, it is important to find out how gyroxin works. The analysis on agarose gel electrophoresis and circular dichroism confirmed the molecules\' integrity and purity. The gyroxin intravenous administration in mice proved its neurotoxicity (barrel rotation). In vivo studies employing intravital microscopy proved that gyroxin induces vasodilation with the participation of protease activated receptors (PARs), nitric oxide and Na+K+ATPase. The leukocytes\' adherence and rolling counting indicated that gyroxin has no proinflammatory activity. Gyroxin induced platelet aggregation, which was blocked by inhibitors of PAR1 and PAR4 receptors (SCH 79797 and tcY-NH2, respectively). Finally, it was proved that the gyroxin temporarily alter the permeability of the blood brain barrier (BBB). Our study has shown that both the protease-activated receptors and nitric oxide are mediators involved in the biological activities of gyroxin.

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Os hormônios do eixo GH-sistema IGF são conhecidos pelo seu papel anabólico e melhora nos ganhos de força. Alguns estudos sugerem que suplementação com o composto Zinco, Magnésio e Piridoxina (\"ZMA\") poderia aumentar os níveis dos hormônios do eixo GH/IGF e na testosterona em jovens. Este hipotético aumento, poderia causar alterações significativas na composição corporal. O ZMA é um suplemento muito popular, facilmente encontrado em lojas especializadas, e tem como premissa causar este aumento nos níveis dos hormônios do eixo GH/IGF, além da testosterona. Contudo, os estudos são divergentes acerca de sua eficácia. Assim sendo, o presente projeto objetivou verificar os efeitos do treinamento físico associado à suplementação de 8 semanas do composto ZMA sobre as concentrações de IGF-1, IGFBP-3 e testosterona em jovens do sexo masculino. Participaram do estudo 18 sujeitos saudáveis, do sexo masculino, atletas amadores de futebol americano. Eles foram divididos em dois grupos: ZMA (grupo suplementado) e placebo. Os resultados mostraram elevação das concentrações de IGF-1, IGFBP-3 e de Testosterona entre a avaliação inicial e a avaliação após 8 semanas. Essa elevação foi semelhante nos dois grupos, não havendo diferenças entre o grupo suplementado e o grupo placebo. Nos dois grupos foi observado de forma semelhante aumento nos parâmetros antropométricos que atestam ganho de massa magra, acompanhado de diminuição naqueles que indicam redução da gordura corporal. Assim sendo, os resultados sugerem que em indivíduos com dieta adequada, doses extras dos micronutrientes presentes no ZMA não trazem quaisquer benefícios adicionais, seja na composição corporal ou nos níveis hormonais. / The GH-IGF system has several anabolic effects and plays an important role in strength gain. Some studies suggest that Zinc, Magnesium and Pyridoxine (\"ZMA\") supplementation could increase GH/IGF and testosterone levels in young subjects. This hypothetical increase could lead to significant changes in body composition. ZMA is a very popular supplement, easily found in specialty stores, and it is presumed to cause increasing in GH/IGF and testosterone levels. However, studies are divergent regarding its efficacy. Therefore, the present study aimed to verify the effects of physical training associated with 8-week ZMA supplementation on the IGF-1, IGFBP-3 and testosterone levels in young males. Eighteen healthy male amateur football players were included in the study. They were divided into two groups: ZMA (supplemented group) and placebo. IGF-1, IGFBP-3 and testosterone concentrations were higher in the final evaluation (8 weeks) than at the beginning of the study. The increase was similar in the supplemented and in the placebo group. Both groups showed similar changes in anthropometric parameters attesting for lean mass gain and decrease in body fat mass. The findings suggest that extra doses of the micronutrients present in the ZMA do not bring any additional benefits, either in the body composition or in the hormonal levels in subjects under adequate diet.

Os hormônios do eixo GH-sistema IGF são conhecidos pelo seu papel anabólico e melhora nos ganhos de força. Alguns estudos sugerem que suplementação com o composto Zinco, Magnésio e Piridoxina (\"ZMA\") poderia aumentar os níveis dos hormônios do eixo GH/IGF e na testosterona em jovens. Este hipotético aumento, poderia causar alterações significativas na composição corporal. O ZMA é um suplemento muito popular, facilmente encontrado em lojas especializadas, e tem como premissa causar este aumento nos níveis dos hormônios do eixo GH/IGF, além da testosterona. Contudo, os estudos são divergentes acerca de sua eficácia. Assim sendo, o presente projeto objetivou verificar os efeitos do treinamento físico associado à suplementação de 8 semanas do composto ZMA sobre as concentrações de IGF-1, IGFBP-3 e testosterona em jovens do sexo masculino. Participaram do estudo 18 sujeitos saudáveis, do sexo masculino, atletas amadores de futebol americano. Eles foram divididos em dois grupos: ZMA (grupo suplementado) e placebo. Os resultados mostraram elevação das concentrações de IGF-1, IGFBP-3 e de Testosterona entre a avaliação inicial e a avaliação após 8 semanas. Essa elevação foi semelhante nos dois grupos, não havendo diferenças entre o grupo suplementado e o grupo placebo. Nos dois grupos foi observado de forma semelhante aumento nos parâmetros antropométricos que atestam ganho de massa magra, acompanhado de diminuição naqueles que indicam redução da gordura corporal. Assim sendo, os resultados sugerem que em indivíduos com dieta adequada, doses extras dos micronutrientes presentes no ZMA não trazem quaisquer benefícios adicionais, seja na composição corporal ou nos níveis hormonais. / The GH-IGF system has several anabolic effects and plays an important role in strength gain. Some studies suggest that Zinc, Magnesium and Pyridoxine (\"ZMA\") supplementation could increase GH/IGF and testosterone levels in young subjects. This hypothetical increase could lead to significant changes in body composition. ZMA is a very popular supplement, easily found in specialty stores, and it is presumed to cause increasing in GH/IGF and testosterone levels. However, studies are divergent regarding its efficacy. Therefore, the present study aimed to verify the effects of physical training associated with 8-week ZMA supplementation on the IGF-1, IGFBP-3 and testosterone levels in young males. Eighteen healthy male amateur football players were included in the study. They were divided into two groups: ZMA (supplemented group) and placebo. IGF-1, IGFBP-3 and testosterone concentrations were higher in the final evaluation (8 weeks) than at the beginning of the study. The increase was similar in the supplemented and in the placebo group. Both groups showed similar changes in anthropometric parameters attesting for lean mass gain and decrease in body fat mass. The findings suggest that extra doses of the micronutrients present in the ZMA do not bring any additional benefits, either in the body composition or in the hormonal levels in subjects under adequate diet.

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:07:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5620_1.pdf: 8916043 bytes, checksum: 669ed68c15dd8910790b9473691f2d57 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Na ausência de um sistema imune adaptativo propriamente dito, os cnidários se valem de uma série de mecanismos bioquímicos e celulares que coletivamente compreendem sistemas da imunidade inata e são utilizados para o reconhecimento de micro-organismos, tanto parasitas quanto simbiontes. O objetivo do presente trabalho foi investigar se precursores gênicos relacionados a três polipeptídios envolvidos na resposta inata (CTL: lectina do tipo C, MBL: lectina ligante de manose e C3: componente 3 do sistema complemento) seriam expressos em Palythoa caribaeorum. Tendo como base dados moleculares descritos na literatura para os cnidários Nematostella vectensis, Pocillopora damicornis, Acropora millepora e Swiftia exserta, foram utilizadas duas estratégias metodológicas distintas para responder tal proposição: (1) síntese direta de cDNA a partir do RNAm e amplificação dos homólogos por RT-PCR e (2) construção de uma biblioteca de cDNA para propagação e resgate dos precursores completos (full length cDNAs). Ao todo, foram obtidos 11 produtos de RT-PCR (cDNAs amplificados), dos quais um se refere a um segmento similar a um domínio do receptor de imunoglobulinas das células NK (KIR), encontrado em gorilas. A presença de um domínio semelhante a KIR em P. caribaeorum sugeriria a existência de formas alternativas de imunidade antecipatória em cnidários. Tão importante quanto esse achado foi a obtenção de amplicons de CTL. Dessa forma, os níveis de expressão de transcritos de CTL foram comparados entre colônias sadias e doentes (em processo de branqueamento) de P. caribaeorum. Os resultados para o ensaio de expressão diferencial mostraram que a CTL teve uma expressão aumentada entre 63,2 e 65,5% nas colônias branqueadas, o que sugere um possível papel na resposta ao branqueamento, uma vez que essas moléculas participam do processo de reconhecimento celular. Esse resultado pode ser interpretado de duas formas: o aumento na transcrição de CTL após o branqueamento seria uma tentativa de proteção imediata contra patógenos ou estaria envolvido no recrutamento de novos simbiontes. Como um todo, o estudo de moléculas polipeptídicas da imunidade de cnidários é de importância considerável. Não somente fornece dados sobre a ancestralidade e evolução das reações imunes, mas também serve de base para uma série de aplicações de caráter científico e biotecnológico, que vão desde o monitoramento e conservação de espécies marinhas até estudos voltados ao tratamento e cura de doenças que acometem vertebrados superiores

IGF-I induz proliferação e diferenciação celular. Neste estudo visamos sua participação na imunidade específica na leishmaniose. Estudamos efeito de citocinas Th1 (IFN-g) e Th2 (IL- 4 mais IL-13) na modulação da produção de IGF-I e seu reflexo no parasitismo de macrófago (MØ) de camundongos BALB/c e C57BL/6, infectados por amastigotas e promastigotas de Leishmania (L.) major. Iniciamos avaliando os efeitos de IGF-I no modelo, onde no desenvolvimento da lesão IGF-I induziu aumento maior de lesão em camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 o efeito foi marcante com evolução progressiva da lesão enquanto que sem o fator, a lesão se controlava. Como a produção de IGF-I por MØ é modulada por citocinas, onde IFN-g diminui e IL-4 e IL-13 aumentam a sua expressão, fomos estudar seus efeitos no modelo proposto onde MØ foram infectados com amastigotas ou promastigotas de L.(L.) major (parasitos/célula = 2:1) e incubados com IFN-g (200U/mL) ou IL-4 (2ng/mL) mais IL-13 (5ng/mL). IFN-g induziu aumento significante na produção de NO nos dois modelos estudados. O efeito de citocinas Th1 e Th2 sobre o parasitismo em MØ foi distinto em BALB/c e C57BL/6. Quando infectados por amastigotas, o parasitismo aumentou sob estímulo com IL-4 mais IL-13 e diminuiu com IFN-g como era esperado. No entanto, quando infectado por promastigota, o parasitismo aumentou com IL-4 mais IL-13 somente em células BALB/c. Por outro lado, o parasitismo diminuiu com IFN- g somente em células C57BL/6. Mesmo na ausência do estímulo por citocinas, observou-se aumento na expressão de RNA de IGF-I nos MØ de animais BALB/c infectados por formas amastigotas ou promastigotas e de C57BL/6 infectados por promastigotas. Um resultado destoante foi à diminuição da expressão de IGF-I em MØ de C57BL/6 infectados por amastigotas. Em células BALB/c, essa expressão aumentada de IGF-I ocorrida em função da infecção, somente se alterou com IL-4 mais IL-13 quando infectadas por amastigotas. Em células C57BL/6, a expressão aumentada de IGF-I com a infecção por prormastigota, sofreu diminuição sob estímulo com IFN-g, não se alterando com citocinas Th2. A expressão diminuída de IGF-I com a infecção por amastigotas diminuiu ainda mais com IFN-g e aumentou com citocinas TH2. Os dados sugerem a possibilidade de modulação do efeito de citocinas pela expressão diferenciada de IGF-I em macrófagos infectados por L. (L.) major / Insulin-like growth factor (IGF)-I induces cell proliferation and differentiation. In this study, we focused on its participation on specific immunity. We studied the effect of Th1 (IFN-g) and Th2 (IL-4 plus IL-13) cytokines on the modulation of the production of IGF-I and its influence on BALB/c and C57BL/6 macrophage (MØ) parasitism using Leishmania (L.) major amastigote and promastigote. IGF-I expression was increased in infected macrophages. Initially, we substantiated the effect of IGF-I on in vitro growth of Leishmania (L.) major promastigote, on cutaneous lesion development in vivo and diminished production of nitric oxide in MØ. On development of the lesion, IGF-I induced greater increase of the lesion in BALB/c mice. In C5BL/6 mice, its effect was more pronounced with progression of the lesion whilst without the factor it was controlled. Since IGF-I production by MØ is modulated by cytokines where IFN-g decreases and IL-4 plus IL-13 increase its expression, we studied their effects in BALB/c and C57BL/6 MØ. Macrophages were infected with L.(L.) major amastigotes or promastigotes (parasites/cell = 2:1) and incubated with IFN-g (200U/mL) or IL-4 (2ng/mL) plus IL-13 (5ng/mL). IFN-g induced a significant increase of NO production by MØ from both models. The effect of Th1 and Th2 cytokines on parasitism was distinct when MØ infected with amastigotes, the parasitism increased upon IL-4 plus IL-13 stimuli and diminished with IFN-g as expected. However, when infected with promastigotes, the parasitism increased with IL-4 plus IL-13 only in BALB/c cells. Conversely, the parasitism diminished with IFN-g only in C57BL/6. Even in the absence of cytokine stimuli, an increase of the expression of IGF-I mRNA was observed in L (L.) major amastigote- and promastigote- infected BALB/c MØ and in promastigoteinfected C57BL/6 MØ. A dissonant result was a diminished IGF-I expression in amastigoteinfected C57BL/6 MØ. In BALB/c this increased IGF-I expression with infection only altered with IL-4 plus IL-13 in amastigote-infected cells. In C57BL/6 cells, the increased IGF-I expression upon prormastigote infection diminished under IFN-g stimulus that was not altered with Th2 cytokines. A decreased IGF-I expression with amastigote-infection diminished even more with IFN-g and increased with Th2 cytokines. These data suggest a possibility of modulation of the effect of cytokines on distinct expression of IGF-I in L. (L.) major-infected MØ