MORAES, Janne Keila Sousa. Aspectos estruturais da toxina da soja (SBTX) e sua participação na defesa vegetal. xviii, 133 f. : Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T13:09:16Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T20:07:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T20:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) Previous issue date: 2007 / This work describes the structural characterization of the soybean toxin (SBTX), isolated from seeds by Siebra (2004). In addition, it is discussed the involvement of this protein in plant defense against pathogens. SBTX was isolated using ammonium sulfate fractionation (20-55%), ion exchange and gel filtration chromatographies. Judging by the SDS-PAGE patterns, it was reported to SBTX an apparent molecular mass of 44 kDa, composed of subunits of 27 kDa and 17 kDa, both linked by disulfide bond. NH2-terminal sequencing of electroblotted samples showed that 44 and 27 kDa bands possess identical NH2-terminal amino acid sequences, ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD that differs from that of the 17 kDa band, PNPKVFFDMTIGGQSAGRIVMEEYA. In the fluorescence spectroscopy, excitation of the toxin solution at 280 m gave a maximum emission in 332 m, which is typically for tryptophan residues buried inside the protein. The secondary structure of SBTX by circular dicroism classified this protein as belonging to alpha- and beta class, showing 35% -helix, 13% -sheet and strand, 27% -turn, 25% random coil and 1% aromatic residues and disulfide bonds. SBTX (50 gP/mL) inhibited the spore germination of the filamentous fungi Aspergillus niger and Penicillium herguei, but did not inhibit those of Fusarium solani e F. oxysporum, even at concentrations ten times higher. Nevertheless, SBTX did not interfere in the vegetative growth of the fungus cited above. On the other hand, SBTX slowed the growth of the yeasts Candida albicans and Kluyveromyces marxiannus, but did not have effect on Saccharomyces cerevisiae, suggesting that its effect would be species-specific. The mechanism by which SBTX acts seems to be not related to alteration of the plasmatic membrane permeability. The treatment of soybean seeds with 50 M jasmonic acid, for 24 h, led to remarkable increase in SBTX content. The results suggest that SBTX may have a role in the plant defense strategy against pathogens / Este trabalho descreve a caracterização estrutural da toxina de soja (SBTX), isolada de sementes por Siebra (2004), e discute o envolvimento desta proteína na defesa da planta contra patógenos. A SBTX foi purificada por precipitação do extrato total com sulfato de amônio (20-55%) e cromatografias de troca iônica e filtração em gel. Por PAGE-SDS, SBTX apresentou massa molecular aparente de 44 kDa, originando duas subunidades, uma de 27 kDa e outra de 17 kDa, quando tratada com 5% de -mercaptoetanol por 15 minutos. A proteína intacta (44 kDa) e a subunidade de 27 kDa apresentaram a mesma seqüência NH2-terminal ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD. Já a subunidade de 17 kDa mostrou uma outra seqüência NH2-terminal, representada por PNPKVFFDMTIGGSAGRIVMEEYA. Por espectroscopia de fluorescência, foi observado que a excitação de uma solução aquosa de SBTX, a 280 m, provocou emissão máxima a 332 m, que é típico da contribuição de resíduos de triptofano enterrados no interior da molécula. A análise da estrutura secundária da SBTX por dicroísmo circular classificou esta toxina como pertencente à classe alfa e beta, apresentando 35% de α-hélice, 13% de fitas e folhas β, 27% de volta­β, 25% de estrutura não ordenada e 1% de resíduos aromáticos e pontes dissulfeto. SBTX (0,05 µgP/µL) inibiu a germinação dos esporos dos fungos filamentosos Aspergillus niger e Penicillium herguei, mas não teve ação sobre Fusarium solani e F. oxysporum, mesmo em concentração dez vezes maior. Todavia, essa toxina não interferiu no crescimento de hifas de nenhum dos fungos citados. Por outro lado, a SBTX retardou o crescimento das leveduras Candida albicans e Kluyveromyces marxiannus, mas não de Saccharomyces cerevisiae, sugerindo ser o seu efeito espécie-específico. O mecanismo pela qual a SBTX atua parece não estar relacionado com alteração da permeabilidade da membrana plasmática. O tratamento das sementes de soja com ácido jasmônico 50 µM, por 24 h, induziu aumento expressivo no conteúdo de SBTX. Os resultados obtidos sugerem que SBTX pode ter um papel na estratégia de defesa vegetal contra patógenos

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Este trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural da toxina de soja (SBTX), isolada de sementes por Siebra (2004), e discute o envolvimento desta proteÃna na defesa da planta contra patÃgenos. A SBTX foi purificada por precipitaÃÃo do extrato total com sulfato de amÃnio (20-55%) e cromatografias de troca iÃnica e filtraÃÃo em gel. Por PAGE-SDS, SBTX apresentou massa molecular aparente de 44 kDa, originando duas subunidades, uma de 27 kDa e outra de 17 kDa, quando tratada com 5% de -mercaptoetanol por 15 minutos. A proteÃna intacta (44 kDa) e a subunidade de 27 kDa apresentaram a mesma seqÃÃncia NH2-terminal ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD. Jà a subunidade de 17 kDa mostrou uma outra seqÃÃncia NH2-terminal, representada por PNPKVFFDMTIGGSAGRIVMEEYA. Por espectroscopia de fluorescÃncia, foi observado que a excitaÃÃo de uma soluÃÃo aquosa de SBTX, a 280 m, provocou emissÃo mÃxima a 332 m, que à tÃpico da contribuiÃÃo de resÃduos de triptofano enterrados no interior da molÃcula. A anÃlise da estrutura secundÃria da SBTX por dicroÃsmo circular classificou esta toxina como pertencente à classe alfa e beta, apresentando 35% de α-hÃlice, 13% de fitas e folhas β, 27% de voltaÂβ, 25% de estrutura nÃo ordenada e 1% de resÃduos aromÃticos e pontes dissulfeto. SBTX (0,05 ÂgP/ÂL) inibiu a germinaÃÃo dos esporos dos fungos filamentosos Aspergillus niger e Penicillium herguei, mas nÃo teve aÃÃo sobre Fusarium solani e F. oxysporum, mesmo em concentraÃÃo dez vezes maior. Todavia, essa toxina nÃo interferiu no crescimento de hifas de nenhum dos fungos citados. Por outro lado, a SBTX retardou o crescimento das leveduras Candida albicans e Kluyveromyces marxiannus, mas nÃo de Saccharomyces cerevisiae, sugerindo ser o seu efeito espÃcie-especÃfico. O mecanismo pela qual a SBTX atua parece nÃo estar relacionado com alteraÃÃo da permeabilidade da membrana plasmÃtica. O tratamento das sementes de soja com Ãcido jasmÃnico 50 ÂM, por 24 h, induziu aumento expressivo no conteÃdo de SBTX. Os resultados obtidos sugerem que SBTX pode ter um papel na estratÃgia de defesa vegetal contra patÃgenos / This work describes the structural characterization of the soybean toxin (SBTX), isolated from seeds by Siebra (2004). In addition, it is discussed the involvement of this protein in plant defense against pathogens. SBTX was isolated using ammonium sulfate fractionation (20-55%), ion exchange and gel filtration chromatographies. Judging by the SDS-PAGE patterns, it was reported to SBTX an apparent molecular mass of 44 kDa, composed of subunits of 27 kDa and 17 kDa, both linked by disulfide bond. NH2-terminal sequencing of electroblotted samples showed that 44 and 27 kDa bands possess identical NH2-terminal amino acid sequences, ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD that differs from that of the 17 kDa band, PNPKVFFDMTIGGQSAGRIVMEEYA. In the fluorescence spectroscopy, excitation of the toxin solution at 280 m gave a maximum emission in 332 m, which is typically for tryptophan residues buried inside the protein. The secondary structure of SBTX by circular dicroism classified this protein as belonging to alpha- and beta class, showing 35% -helix, 13% -sheet and strand, 27% -turn, 25% random coil and 1% aromatic residues and disulfide bonds. SBTX (50 gP/mL) inhibited the spore germination of the filamentous fungi Aspergillus niger and Penicillium herguei, but did not inhibit those of Fusarium solani e F. oxysporum, even at concentrations ten times higher. Nevertheless, SBTX did not interfere in the vegetative growth of the fungus cited above. On the other hand, SBTX slowed the growth of the yeasts Candida albicans and Kluyveromyces marxiannus, but did not have effect on Saccharomyces cerevisiae, suggesting that its effect would be species-specific. The mechanism by which SBTX acts seems to be not related to alteration of the plasmatic membrane permeability. The treatment of soybean seeds with 50 M jasmonic acid, for 24 h, led to remarkable increase in SBTX content. The results suggest that SBTX may have a role in the plant defense strategy against pathogens

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A soja à uma das leguminosas mais utilizadas no mundo, sendo o uso justificado pelo elevado teor nutricional de seus grÃos, constituÃdos, principalmente, por proteÃnas e lipÃdios. A estimativa atual da produÃÃo mundial de soja à de 250.000 toneladas/ano, porÃm hà fatores limitantes dessa produÃÃo, como o ataque de pragas. As doenÃas causadas por fungos, por exemplo, causam na soja perdas em torno de 4%, sendo 20% destas causadas por Septoria glycines e Cercospora kikuchii. Assim, a busca por medidas alternativas de controle à crescente, particularmente em diminuiÃÃo ao uso de agrotÃxicos, mas, para isso, à importante o entendimento dos mecanismos de defesa vegetal. Das sementes de soja foi purificada uma proteÃna, denominada toxina da soja (SBTX), que à ativa contra diversos fungos de plantas e do homem e, tambÃm, à neurotÃxica para ratos e camundongos, razÃo pela qual recebeu o nome de toxina. A SBTX apresenta massa molecular de 44 kDa, constituÃda por duas subunidades (17 e 27 kDa) codificadas por genes distintos e jà foi identificada nas sementes, raÃzes, caules e folhas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de expressÃo gÃnica da SBTX em plantas cujas folhas primÃrias foram tratadas com elicitores (biÃtico e abiÃtico), usando a tÃcnica de PCR em tempo real, na tentativa de reforÃar o papel fisiolÃgico de defesa proposto para proteÃna. Assim sendo, Ãcido salicÃlico, injÃria mecÃnica e esporos do fungo Cercospora kikuchii foram utilizados como elicitores e os nÃveis de transcritos para as duas subunidades proteicas de SBTX avaliados. Respostas de induÃÃo foram verificadas para ambas as subunidades da SBTX, porÃm os perfis de expressÃo gÃnica foram diferenciados. Para o gene SBTX 27 kDa, o maior nÃvel de transcritos foi detectado quando o tratamento envolveu injÃria mecÃnica associada ao Ãcido salicÃlico, correspondendo a um aumento de cerca de 100 vezes apÃs 12 horas de aplicaÃÃo do tratamento. Jà para o gene SBTX 17 kDa este aumento nÃo foi verificado na mesma intensidade, tendo sido apenas em torno de 10 vezes. Os dados em conjunto mostram que SBTX à uma proteÃna passÃvel de induÃÃo por elicitores biÃticos e abiÃticos, reforÃando o seu papel fisiolÃgico de defesa, podendo vir a ser utilizada como ferramenta biotecnolÃgica no sentido de amenizar as perdas causadas por fungos. / Soybean is a legume most commonly utilized in the world, whose use is justified by the high nutritional content of its grain, consisting mainly of proteins and lipids. The current estimate of global soybean production is 250,000 tons/year, but there are limiting factors of this production, such as the pest attack. The fungal diseases, for example, cause losses in soybeans around 4%, where 20% of these are derived from infection by Septoria glycines and Cercospora kikuchii. Thus, the search for alternative measures is increasing, particularly in reducing the use of pesticides, but for this it is important to understand the plant defense mechanisms. Soybean toxin (SBTX) is a protein purified from soybean seeds with activity against plant and human pathogenic fungi and neurotoxic action to rats and mice, hence the reason it received the name of toxin. SBTX shows a molecular mass of 44 kDa, composed of two subunits (17 and 27 kDa) encoded by distinct genes and it has been detected seeds, roots, stems and leaves. This study aimed to evaluate the gene expression profile of SBTX in soybean plants whose primary leaves were treated with elicitors (biotic and abiotic), using the real-time PCR technique, in an attempt to strength the physiological role of defense proposed for this protein. Therefore, salicylic acid, mechanic injury and Cercospora kikuchii spores were used as elicitors and it was measured the transcript levels of SBTX subunits. Induction responses were observed for both subunits of SBTX, but the gene expression profiles were different. For SBTX 27 kDa gene, the highest transcript level was detected when the treatment involved mechanic injury associated to salicylic acid, an increase of about 100 fold after 12 hours of treatment application. Nevertheless, for SBTX 17 kDa gene the induction response was much smaller, it was only around 10 times. The data together show that SBTX is an inducible protein by biotic and abiotic elicitors, reinforcing its physiological role of defense, which could eventually be used as biotechnological tool in order to mitigate losses caused by fungi.

MORAIS, Vanessa Duarte de. Avaliação da expressão gênica da toxina da soja (SBTX) por indutores da defesa de plantas. 2012. 92 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-15T13:11:16Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:24:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) Previous issue date: 2012 / Soybean is a legume most commonly utilized in the world, whose use is justified by the high nutritional content of its grain, consisting mainly of proteins and lipids. The current estimate of global soybean production is 250,000 tons/year, but there are limiting factors of this production, such as the pest attack. The fungal diseases, for example, cause losses in soybeans around 4%, where 20% of these are derived from infection by Septoria glycines and Cercospora kikuchii. Thus, the search for alternative measures is increasing, particularly in reducing the use of pesticides, but for this it is important to understand the plant defense mechanisms. Soybean toxin (SBTX) is a protein purified from soybean seeds with activity against plant and human pathogenic fungi and neurotoxic action to rats and mice, hence the reason it received the name of toxin. SBTX shows a molecular mass of 44 kDa, composed of two subunits (17 and 27 kDa) encoded by distinct genes and it has been detected seeds, roots, stems and leaves. This study aimed to evaluate the gene expression profile of SBTX in soybean plants whose primary leaves were treated with elicitors (biotic and abiotic), using the real-time PCR technique, in an attempt to strength the physiological role of defense proposed for this protein. Therefore, salicylic acid, mechanic injury and Cercospora kikuchii spores were used as elicitors and it was measured the transcript levels of SBTX subunits. Induction responses were observed for both subunits of SBTX, but the gene expression profiles were different. For SBTX 27 kDa gene, the highest transcript level was detected when the treatment involved mechanic injury associated to salicylic acid, an increase of about 100 fold after 12 hours of treatment application. Nevertheless, for SBTX 17 kDa gene the induction response was much smaller, it was only around 10 times. The data together show that SBTX is an inducible protein by biotic and abiotic elicitors, reinforcing its physiological role of defense, which could eventually be used as biotechnological tool in order to mitigate losses caused by fungi. / A soja é uma das leguminosas mais utilizadas no mundo, sendo o uso justificado pelo elevado teor nutricional de seus grãos, constituídos, principalmente, por proteínas e lipídios. A estimativa atual da produção mundial de soja é de 250.000 toneladas/ano, porém há fatores limitantes dessa produção, como o ataque de pragas. As doenças causadas por fungos, por exemplo, causam na soja perdas em torno de 4%, sendo 20% destas causadas por Septoria glycines e Cercospora kikuchii. Assim, a busca por medidas alternativas de controle é crescente, particularmente em diminuição ao uso de agrotóxicos, mas, para isso, é importante o entendimento dos mecanismos de defesa vegetal. Das sementes de soja foi purificada uma proteína, denominada toxina da soja (SBTX), que é ativa contra diversos fungos de plantas e do homem e, também, é neurotóxica para ratos e camundongos, razão pela qual recebeu o nome de toxina. A SBTX apresenta massa molecular de 44 kDa, constituída por duas subunidades (17 e 27 kDa) codificadas por genes distintos e já foi identificada nas sementes, raízes, caules e folhas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de expressão gênica da SBTX em plantas cujas folhas primárias foram tratadas com elicitores (biótico e abiótico), usando a técnica de PCR em tempo real, na tentativa de reforçar o papel fisiológico de defesa proposto para proteína. Assim sendo, ácido salicílico, injúria mecânica e esporos do fungo Cercospora kikuchii foram utilizados como elicitores e os níveis de transcritos para as duas subunidades proteicas de SBTX avaliados. Respostas de indução foram verificadas para ambas as subunidades da SBTX, porém os perfis de expressão gênica foram diferenciados. Para o gene SBTX 27 kDa, o maior nível de transcritos foi detectado quando o tratamento envolveu injúria mecânica associada ao ácido salicílico, correspondendo a um aumento de cerca de 100 vezes após 12 horas de aplicação do tratamento. Já para o gene SBTX 17 kDa este aumento não foi verificado na mesma intensidade, tendo sido apenas em torno de 10 vezes. Os dados em conjunto mostram que SBTX é uma proteína passível de indução por elicitores bióticos e abióticos, reforçando o seu papel fisiológico de defesa, podendo vir a ser utilizada como ferramenta biotecnológica no sentido de amenizar as perdas causadas por fungos.

OLIVEIRA, Hermógenes David de. Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine Max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais. 2009. 179 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T13:47:53Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) Previous issue date: 2009 / Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42 ± 3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ºC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16 ± 0.08 µg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11µg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. EST’s encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens / A soja (Glycine max) é uma espécie de grande valor econômico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grãos na alimentação animal e na indústria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grãos, as perdas na produtividade em campo ainda são consideráveis, principalmente àquelas causadas por nematóides do gênero Meloidogyne e por fungos fitopatogênicos. Mesmo com a existência de alternativas químicas para o controle dessas espécies, bem como com a existência de genótipos resistentes, as perdas agrícolas ainda são consideráveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistência ambientalmente seguros são práticas necessárias para o controle de pragas e patógenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquímica e funcionalmente duas toxinas protéicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papéis na defesa contra patógenos de importância agronômica para essa espécie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) é uma proteína ácida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pI’s 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A análise por dicroísmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro típico de proteínas que apresentam α-hélice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante àquela já descrita para a SBTX. Esses padrões são gradualmente perdidos quando a proteína é aquecida de 25 a 95 ºC. Os espectros de emissão em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, máximo) mostraram padrões típicos de resíduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciária. SYTX-2 é uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrócitos de coelho em presença de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. Além disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleásica, cuja atividade específica (1821,42 ± 3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante àquela descrita para a ribonuclease de raízes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 está presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilédones, além de se distribuir também em raízes, caules e folhas. As raízes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62 ± 10,10 µg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressão triplicada em tecidos adultos (195,12 ± 35,54 µg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteína é exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudação mostrado 18 h após o contato com o tampão (6,16 ± 0,08 µgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteínas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h após a injúria mecânica de folhas (de 6,7 para 10,46 µg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h após a lesão. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita Raça 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h após incubação com a proteína, e de 100% após 24 h. Essa toxina também foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora não tenha sido efetiva em inibir a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho também descreve o isolamento, a clonagem e a caracterização do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraído de sementes 15, 25 e 35 dias após a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteína (27 e 17 kDa). Evidências experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteína são codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotídeos, codificante para uma proteína com 219 resíduos de aminoácidos. A sequência do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por EST’s para essa proteína, mostrou que além de ser expressa em todo o vegetal, níveis elevados de transcritos são observados após a infecção contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogênicos. A sequência deduzida de aminoácidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptídeo sinal de 26 resíduos de aminoácidos, clivado para a produção da proteína madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteína básica. Na sequência de aminoácidos da subunidade de 27 kDa também foram identificados: um resíduo de cisteína, envolvido na formação de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sítios de fosforilação em Ser, Thr ou Tyr, 8 sítios de glicosilação para GlcNAc e um sítio para adição de oligossacarídeos tipo mucina (GalNAc). A toxina também apresenta sítios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausência de toxicidade observada em camundongos após administração oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas através de uma caracterização estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informações obtidas permitiram definir que essas proteínas são parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogênicos e nematóides. Além de inéditos e de extrema relevância, todos esses dados darão subsídios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protéica e isolamento gênico e, para SBTX, realização de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgênicas com uma maior resistência a fungos

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A soja (Glycine max) à uma espÃcie de grande valor econÃmico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grÃos na alimentaÃÃo animal e na indÃstria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grÃos, as perdas na produtividade em campo ainda sÃo considerÃveis, principalmente Ãquelas causadas por nematÃides do gÃnero Meloidogyne e por fungos fitopatogÃnicos. Mesmo com a existÃncia de alternativas quÃmicas para o controle dessas espÃcies, bem como com a existÃncia de genÃtipos resistentes, as perdas agrÃcolas ainda sÃo considerÃveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistÃncia ambientalmente seguros sÃo prÃticas necessÃrias para o controle de pragas e patÃgenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquÃmica e funcionalmente duas toxinas protÃicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papÃis na defesa contra patÃgenos de importÃncia agronÃmica para essa espÃcie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) à uma proteÃna Ãcida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pIâs 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A anÃlise por dicroÃsmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro tÃpico de proteÃnas que apresentam α-hÃlice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante Ãquela jà descrita para a SBTX. Esses padrÃes sÃo gradualmente perdidos quando a proteÃna à aquecida de 25 a 95 ÂC. Os espectros de emissÃo em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, mÃximo) mostraram padrÃes tÃpicos de resÃduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciÃria. SYTX-2 à uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrÃcitos de coelho em presenÃa de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. AlÃm disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleÃsica, cuja atividade especÃfica (1821,42  3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante Ãquela descrita para a ribonuclease de raÃzes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 està presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilÃdones, alÃm de se distribuir tambÃm em raÃzes, caules e folhas. As raÃzes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62  10,10 Âg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressÃo triplicada em tecidos adultos (195,12  35,54 Âg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteÃna à exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudaÃÃo mostrado 18 h apÃs o contato com o tampÃo (6,16  0,08 ÂgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteÃnas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h apÃs a injÃria mecÃnica de folhas (de 6,7 para 10,46 Âg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h apÃs a lesÃo. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita RaÃa 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h apÃs incubaÃÃo com a proteÃna, e de 100% apÃs 24 h. Essa toxina tambÃm foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora nÃo tenha sido efetiva em inibir a germinaÃÃo de esporos de fungos fitopatogÃnicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho tambÃm descreve o isolamento, a clonagem e a caracterizaÃÃo do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraÃdo de sementes 15, 25 e 35 dias apÃs a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteÃna (27 e 17 kDa). EvidÃncias experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteÃna sÃo codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotÃdeos, codificante para uma proteÃna com 219 resÃduos de aminoÃcidos. A sequÃncia do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por ESTâs para essa proteÃna, mostrou que alÃm de ser expressa em todo o vegetal, nÃveis elevados de transcritos sÃo observados apÃs a infecÃÃo contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogÃnicos. A sequÃncia deduzida de aminoÃcidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptÃdeo sinal de 26 resÃduos de aminoÃcidos, clivado para a produÃÃo da proteÃna madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteÃna bÃsica. Na sequÃncia de aminoÃcidos da subunidade de 27 kDa tambÃm foram identificados: um resÃduo de cisteÃna, envolvido na formaÃÃo de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sÃtios de fosforilaÃÃo em Ser, Thr ou Tyr, 8 sÃtios de glicosilaÃÃo para GlcNAc e um sÃtio para adiÃÃo de oligossacarÃdeos tipo mucina (GalNAc). A toxina tambÃm apresenta sÃtios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausÃncia de toxicidade observada em camundongos apÃs administraÃÃo oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas atravÃs de uma caracterizaÃÃo estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informaÃÃes obtidas permitiram definir que essas proteÃnas sÃo parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogÃnicos e nematÃides. AlÃm de inÃditos e de extrema relevÃncia, todos esses dados darÃo subsÃdios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protÃica e isolamento gÃnico e, para SBTX, realizaÃÃo de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgÃnicas com uma maior resistÃncia a fungos / Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42  3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ÂC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16  0.08 Âg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11Âg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. ESTâs encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens