A diet rich in polyphenols has been proposed to have beneficial health effects and to reduce risk of disease. Ellagic acid, a polyphenol common in red berries and pomegranates, has potential anti-tumorigenic effects that make it interesting to further study in different cancer cell systems. Neuroblastoma is a childhood cancer that arises during development of the peripheral nervous system. Neuroblastoma, being an embryonal tumor, show loss of function of genes controlling differentiation and apoptosis. Neuroblastoma is a heterogenic tumor disease, and highly malignant neuroblastomas are difficult to treat despite different treatment modalities, identifying a need for new and combinatory treatments. A common model for human neuroblastoma is the SH-SY5Y cell line resembling immature neuroblasts that can be differentiated in vitro with several agents including the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and the vitamin A-derivative all-trans retinoic acid. Here, the effect of ellagic acid on proliferation, cell detachment and apoptosis in non-differentiated and in vitro-differentiated SH-SY5Y cells were studied with the aim of identifying cellular target mechanisms and a possible therapeutic potential for ellagic acid. In non-differentiated cells, ellagic acid reduced cell number, inhibited cell cycle activity, and induced cell detachment and apoptosis. Apoptosis was partly mediated by the intrinsic pathway. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and all-trans retinoic acid both induced morphological differentiation, while only the latter induced G0/G1-arrest. Single-cell analysis revealed that 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-treated cells continued cycling during neuritogenesis while these two read-outs were mutually exclusive in all-trans retinoic acid-treated cells. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate- and especially all-trans retinoic acid-differentiated cells showed lower sensitivity to ellagic acid-dependent cell detachment and apoptosis. / <p>Artikel 4 ("Altered sensitivity...") ingick som manuskript i avhandlingen, nu publicerad.</p>

O açaí (Euterpe oleracea) é um fruto proveniente do açaizeiro, uma palmeira nativa da Amazônia Brasileira, considerado uma “superfruta” devido ao seu alto valor nutricional, com destaque para as antocianinas, associadas a efeitos benéficos à saúde. Uma vez que genótipos de frutos desenvolvidos por programas de melhoramento têm sido avaliados a fim de identificar frutos com composição fitoquímica melhorada e potencial antioxidante, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do melhoramento genético na composição química, perfil de compostos bioativos e atividade antioxidante de seis genótipos de açaí (E. oleracea). Análises de composição química, perfil de antocianinas e carotenoides e de atividade antioxidante em diversos sistemas in vitro (método ABTS, oxidação da glutationa, teste da desoxirribose e células SH-SY5Y) foram realizadas em 6 genótipos e 1 amostra comercial utilizada como padrão. Com relação a composição química, de maneira geral, os genótipos apresentaram elevados teores de lipídeos (36,30 – 47,44%), fibras totais (11,31 – 15,88%), proteínas (7,78-9,50%) e cinzas (3,49 – 4,44%). Adicionalmente, as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (12-43%) e cianidina 3-rutinosídeo (57-88%) foram identificadas nos genótipos avaliados e o genótipo L22P13 apresentou um incremento de 85% no teor de antocianinas totais. Com relação ao perfil de carotenoides, luteína, zeaxantina, α-caroteno e β-caroteno foram os principais carotenoides identificados nos genótipos avaliados, sendo que os genótipos BRS-PAMISTA e L22P13 apresentaram os teores mais elevados de carotenoides totais (125,39μg/g e 118μg/g). Com relação a atividade antioxidante, todos os genótipos reduziram a geração do radical ABTS em maior ou menor grau, embora diferenças significativas entre os genótipos e a amostra comercial não tenham sido observadas (IC50 = 73,98 – 175,7 vs. 121,7 μg/g). Entretanto, houve associação moderada e inversa entre a geração do radical ABTS e níveis de antocianinas e carotenoides. Ausência de diferenças significativas entre os extratos hidroetanólicos dos genótipos e a amostra comercial também foi observada no ensaio da desoxirribose (IC50 = 361,5 – 497,7 vs. 520,1 μg/g). Em cultura de células SH-SY5Y, os extratos hidroetanólicos na concentração de 50 μg/mL apresentaram um efeito protetor contra as espécies reativas geradas pelo H2O2 (ensaio DCFH-DA) e esse resultado foi associado ao teor de antocianinas dos extratos. Os resultados apontam genótipos promissores, com elevados teores de antocianinas e carotenoides, com potencial atividade antioxidante in vitro e um possível efeito protetor de células frente as espécies reativas. / The açaí (Euterpe oleracea) is a fruit of the açaizeiro, a native palm of the Brazilian Amazon, considered a "superfruit" due to its high nutritional value, especially anthocyanins, associated with beneficial health effects. Since fruit genotypes developed by breeding programs have been evaluated to identify fruits with improved phytochemical composition and antioxidant potential, the aim of this study was to investigate the effect of genetic improvement in the chemical composition, bioactive compounds profile and antioxidant activity of six açaí (E. oleracea) genotypes. The analysis of chemical composition, anthocyanins and carotenoids profile and antioxidant activity in various in vitro systems (ABTS method, glutathione oxidation, deoxyribose test and SH-SY5Y cells) were performed in six genotypes of açaí and one commercial sample that was used as standard. Regarding the chemical composition, in general, the genotypes showed high levels of lipids (36.30 – 47.44%), total fiber (11.31 – 15.88%), protein (7.78-9.50%) and ashes (3.49 – 4.44%). In addition, the anthocyanins cyanidin 3-glucoside (12-43%) and cyanidin 3-rutinoside (57-88%) were identified in evaluated genotypes and L22P13 genotype showed an increase of 85% in total anthocyanin content. Regarding the carotenoid profile, lutein, zeaxanthin, α-carotene and β-carotene were the main carotenoid identified in genotypes, being that BRS-PAMISTA and L22P13 genotypes showed the highest levels of total carotenoids (125.39 μg/g and 118 μg/g). Regarding the antioxidant activity, all genotypes reduced ABTS radical generation in greater or lesser extension, although there were no significant differences between hydroethanolic extracts of different genotypes and the commercial sample (IC50 = 73.98 - 175.7 vs. 121.7 μg/g). However, an inverse and moderate association between radical ABTS generation and anthocyanins and carotenoids content was observed. Absence of significant differences between hydroethanolic extracts of evaluated genotypes and the commercial sample was observed also in the deoxyribose assay (IC50 = 361.5 to 497.7 vs. 520.1 μg/g). In culture of SH-SY5Y cells, hydroethanolic extracts at concentration of 50 μg/mL had a protective effect against the reactive species generated by H2O2 (DCFH-DA assay) and this result was associated with the anthocyanins content of the extracts. The results showed promising genotypes with high levels of anthocyanins and carotenoids with antioxidant potential in vitro and a possible protective effect of cells against reactive species.

O açaí (Euterpe oleracea) é um fruto proveniente do açaizeiro, uma palmeira nativa da Amazônia Brasileira, considerado uma “superfruta” devido ao seu alto valor nutricional, com destaque para as antocianinas, associadas a efeitos benéficos à saúde. Uma vez que genótipos de frutos desenvolvidos por programas de melhoramento têm sido avaliados a fim de identificar frutos com composição fitoquímica melhorada e potencial antioxidante, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do melhoramento genético na composição química, perfil de compostos bioativos e atividade antioxidante de seis genótipos de açaí (E. oleracea). Análises de composição química, perfil de antocianinas e carotenoides e de atividade antioxidante em diversos sistemas in vitro (método ABTS, oxidação da glutationa, teste da desoxirribose e células SH-SY5Y) foram realizadas em 6 genótipos e 1 amostra comercial utilizada como padrão. Com relação a composição química, de maneira geral, os genótipos apresentaram elevados teores de lipídeos (36,30 – 47,44%), fibras totais (11,31 – 15,88%), proteínas (7,78-9,50%) e cinzas (3,49 – 4,44%). Adicionalmente, as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (12-43%) e cianidina 3-rutinosídeo (57-88%) foram identificadas nos genótipos avaliados e o genótipo L22P13 apresentou um incremento de 85% no teor de antocianinas totais. Com relação ao perfil de carotenoides, luteína, zeaxantina, α-caroteno e β-caroteno foram os principais carotenoides identificados nos genótipos avaliados, sendo que os genótipos BRS-PAMISTA e L22P13 apresentaram os teores mais elevados de carotenoides totais (125,39μg/g e 118μg/g). Com relação a atividade antioxidante, todos os genótipos reduziram a geração do radical ABTS em maior ou menor grau, embora diferenças significativas entre os genótipos e a amostra comercial não tenham sido observadas (IC50 = 73,98 – 175,7 vs. 121,7 μg/g). Entretanto, houve associação moderada e inversa entre a geração do radical ABTS e níveis de antocianinas e carotenoides. Ausência de diferenças significativas entre os extratos hidroetanólicos dos genótipos e a amostra comercial também foi observada no ensaio da desoxirribose (IC50 = 361,5 – 497,7 vs. 520,1 μg/g). Em cultura de células SH-SY5Y, os extratos hidroetanólicos na concentração de 50 μg/mL apresentaram um efeito protetor contra as espécies reativas geradas pelo H2O2 (ensaio DCFH-DA) e esse resultado foi associado ao teor de antocianinas dos extratos. Os resultados apontam genótipos promissores, com elevados teores de antocianinas e carotenoides, com potencial atividade antioxidante in vitro e um possível efeito protetor de células frente as espécies reativas. / The açaí (Euterpe oleracea) is a fruit of the açaizeiro, a native palm of the Brazilian Amazon, considered a "superfruit" due to its high nutritional value, especially anthocyanins, associated with beneficial health effects. Since fruit genotypes developed by breeding programs have been evaluated to identify fruits with improved phytochemical composition and antioxidant potential, the aim of this study was to investigate the effect of genetic improvement in the chemical composition, bioactive compounds profile and antioxidant activity of six açaí (E. oleracea) genotypes. The analysis of chemical composition, anthocyanins and carotenoids profile and antioxidant activity in various in vitro systems (ABTS method, glutathione oxidation, deoxyribose test and SH-SY5Y cells) were performed in six genotypes of açaí and one commercial sample that was used as standard. Regarding the chemical composition, in general, the genotypes showed high levels of lipids (36.30 – 47.44%), total fiber (11.31 – 15.88%), protein (7.78-9.50%) and ashes (3.49 – 4.44%). In addition, the anthocyanins cyanidin 3-glucoside (12-43%) and cyanidin 3-rutinoside (57-88%) were identified in evaluated genotypes and L22P13 genotype showed an increase of 85% in total anthocyanin content. Regarding the carotenoid profile, lutein, zeaxanthin, α-carotene and β-carotene were the main carotenoid identified in genotypes, being that BRS-PAMISTA and L22P13 genotypes showed the highest levels of total carotenoids (125.39 μg/g and 118 μg/g). Regarding the antioxidant activity, all genotypes reduced ABTS radical generation in greater or lesser extension, although there were no significant differences between hydroethanolic extracts of different genotypes and the commercial sample (IC50 = 73.98 - 175.7 vs. 121.7 μg/g). However, an inverse and moderate association between radical ABTS generation and anthocyanins and carotenoids content was observed. Absence of significant differences between hydroethanolic extracts of evaluated genotypes and the commercial sample was observed also in the deoxyribose assay (IC50 = 361.5 to 497.7 vs. 520.1 μg/g). In culture of SH-SY5Y cells, hydroethanolic extracts at concentration of 50 μg/mL had a protective effect against the reactive species generated by H2O2 (DCFH-DA assay) and this result was associated with the anthocyanins content of the extracts. The results showed promising genotypes with high levels of anthocyanins and carotenoids with antioxidant potential in vitro and a possible protective effect of cells against reactive species.

Espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas através da respiração aeróbica e durante processos inflamatórios. Além disso, agressões externas como radiações, poluição, estresse, alcoolismo e tabagismo aumentam a sua produção. Altos níveis de ERO podem ocasionar dano oxidativo à lipídios, proteínas e DNA, comprometendo a função normal da célula, podendo estar envolvidos na patogênese e agravamento de diversas doenças. Há evidências que sugerem que antioxidantes naturais presentes em alimentos conferem benefícios adicionais à saúde, atuando como anticarcinogênicos, antiinflamatórios ou agentes antimutagênicos. O orégano (Oreganum sp) é uma especiaria mediterrânea usada como condimento na alimentação e pela medicina popular para diversos tipos de moléstias. O óleo possui forte ação antimicrobiana, devido ao elevado conteúdo de monoterpenos, sendo os principais o carvacrol, o timol e o para-cimeno. O carvacrol (5-isopropil-2metilfenol) é um fenol monoterpênico, com sabor picante e odor característico e tem sido amplamente usado na indústria de alimentos como aditivo seguro para aumentar a vida útil dos alimentos, como aromatizante em produtos assados, doces, bebidas e gomas de mascar, e/ou agente antimicrobiano com atividades contra bactérias, fungos e leveduras. Estudos têm relatado efeito antidepressivo e ansiolítico do carvacrol em camundongos, assim como proteção contra a radiação UVB diminuindo a peroxidação lipídica, estresse oxidativo e danos no DNA em células linfocitárias humanas e atividade antioxidante em diferentes sistemas de lipídios. Nós avaliamos a viabilidade celular e parâmetros de citotoxicidade do carvacrol em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Este parece modificar levemente a morfologia das células, sem modificar significativamente a biomassa celular, parecendo ser tóxico na concentração de 100 μg/mL. Nas demais concentrações (1 a 50 μg/mL) não houve citotoxicidade. No ensaio de DCFH-DA o carvacrol reduziu a produção de ERO intracelular e diminui significativamente a produção de radicais peroxil no ensaio TRAP. Esses dados reforçam a ideia do carvacrol ser um potencial antioxidante, sendo necessários mais estudos para avaliar o mecanismo de ação deste composto. / Reactive oxygen species (ROS) are produced through aerobic respiration and during inflammation. Besides, external aggressions such as radiation, pollution, stress, alcoholism and smoking increase their production. Elevated levels of ROS can cause oxidative damage to lipids, proteins and DNA, compromising the normal cell function, and may be involved in the pathogenesis and progression of several diseases. There is suggesting that natural antioxidants found in foods provide additional health benefits, acting as anticarcinogenic, anti-inflammatory agents or antimutagenic. Oregano (Oreganum sp) is a Mediterranean spice used in food as a condiment and in popular medicine to treat several types of diseases. The essential oil has strong antimicrobial activity, due to the high content of monoterpenes, the main ones being carvacrol, thymol and para-cymene. Carvacrol (5-isopropyl-2metilfenol) is a phenol monoterpene with spicy taste and odor and has been widely used in food industry as additive to preserve foods, as flavoring agent in baked goods, candy, drinks and chewing gums, and/or antimicrobial agent with activity against bacteria, fungi and yeasts. Studies have reported antidepressant and anxiolytic effects of carvacrol in mice, as well as protection against UVB radiation, decreased lipid peroxidation, oxidative stress and DNA damage in human lymphocyte cells, and antioxidant activity in different lipid systems. We evaluated cell viability and cytotoxicity parameters of carvacrol in human neuroblastoma cells SH-SY5Y. Carvacrol induced morphology changes in cells without significant modification of the cellular biomass content and it was toxic at the concentration of 100 μg/mL. In other concentrations (1-50 μg/mL) it showed no cytotoxicity. In DCFH-DA assay carvacrol reduced the intracellular ROS production and significantly decreased the production of peroxyl radicals in the TRAP assay. These data reinforce the idea of carvacrol as a potential antioxidant and more research is needed to evaluate the mechanism of action of this compound.

Espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas através da respiração aeróbica e durante processos inflamatórios. Além disso, agressões externas como radiações, poluição, estresse, alcoolismo e tabagismo aumentam a sua produção. Altos níveis de ERO podem ocasionar dano oxidativo à lipídios, proteínas e DNA, comprometendo a função normal da célula, podendo estar envolvidos na patogênese e agravamento de diversas doenças. Há evidências que sugerem que antioxidantes naturais presentes em alimentos conferem benefícios adicionais à saúde, atuando como anticarcinogênicos, antiinflamatórios ou agentes antimutagênicos. O orégano (Oreganum sp) é uma especiaria mediterrânea usada como condimento na alimentação e pela medicina popular para diversos tipos de moléstias. O óleo possui forte ação antimicrobiana, devido ao elevado conteúdo de monoterpenos, sendo os principais o carvacrol, o timol e o para-cimeno. O carvacrol (5-isopropil-2metilfenol) é um fenol monoterpênico, com sabor picante e odor característico e tem sido amplamente usado na indústria de alimentos como aditivo seguro para aumentar a vida útil dos alimentos, como aromatizante em produtos assados, doces, bebidas e gomas de mascar, e/ou agente antimicrobiano com atividades contra bactérias, fungos e leveduras. Estudos têm relatado efeito antidepressivo e ansiolítico do carvacrol em camundongos, assim como proteção contra a radiação UVB diminuindo a peroxidação lipídica, estresse oxidativo e danos no DNA em células linfocitárias humanas e atividade antioxidante em diferentes sistemas de lipídios. Nós avaliamos a viabilidade celular e parâmetros de citotoxicidade do carvacrol em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Este parece modificar levemente a morfologia das células, sem modificar significativamente a biomassa celular, parecendo ser tóxico na concentração de 100 μg/mL. Nas demais concentrações (1 a 50 μg/mL) não houve citotoxicidade. No ensaio de DCFH-DA o carvacrol reduziu a produção de ERO intracelular e diminui significativamente a produção de radicais peroxil no ensaio TRAP. Esses dados reforçam a ideia do carvacrol ser um potencial antioxidante, sendo necessários mais estudos para avaliar o mecanismo de ação deste composto. / Reactive oxygen species (ROS) are produced through aerobic respiration and during inflammation. Besides, external aggressions such as radiation, pollution, stress, alcoholism and smoking increase their production. Elevated levels of ROS can cause oxidative damage to lipids, proteins and DNA, compromising the normal cell function, and may be involved in the pathogenesis and progression of several diseases. There is suggesting that natural antioxidants found in foods provide additional health benefits, acting as anticarcinogenic, anti-inflammatory agents or antimutagenic. Oregano (Oreganum sp) is a Mediterranean spice used in food as a condiment and in popular medicine to treat several types of diseases. The essential oil has strong antimicrobial activity, due to the high content of monoterpenes, the main ones being carvacrol, thymol and para-cymene. Carvacrol (5-isopropyl-2metilfenol) is a phenol monoterpene with spicy taste and odor and has been widely used in food industry as additive to preserve foods, as flavoring agent in baked goods, candy, drinks and chewing gums, and/or antimicrobial agent with activity against bacteria, fungi and yeasts. Studies have reported antidepressant and anxiolytic effects of carvacrol in mice, as well as protection against UVB radiation, decreased lipid peroxidation, oxidative stress and DNA damage in human lymphocyte cells, and antioxidant activity in different lipid systems. We evaluated cell viability and cytotoxicity parameters of carvacrol in human neuroblastoma cells SH-SY5Y. Carvacrol induced morphology changes in cells without significant modification of the cellular biomass content and it was toxic at the concentration of 100 μg/mL. In other concentrations (1-50 μg/mL) it showed no cytotoxicity. In DCFH-DA assay carvacrol reduced the intracellular ROS production and significantly decreased the production of peroxyl radicals in the TRAP assay. These data reinforce the idea of carvacrol as a potential antioxidant and more research is needed to evaluate the mechanism of action of this compound.

O açaí (Euterpe oleracea) é um fruto proveniente do açaizeiro, uma palmeira nativa da Amazônia Brasileira, considerado uma “superfruta” devido ao seu alto valor nutricional, com destaque para as antocianinas, associadas a efeitos benéficos à saúde. Uma vez que genótipos de frutos desenvolvidos por programas de melhoramento têm sido avaliados a fim de identificar frutos com composição fitoquímica melhorada e potencial antioxidante, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do melhoramento genético na composição química, perfil de compostos bioativos e atividade antioxidante de seis genótipos de açaí (E. oleracea). Análises de composição química, perfil de antocianinas e carotenoides e de atividade antioxidante em diversos sistemas in vitro (método ABTS, oxidação da glutationa, teste da desoxirribose e células SH-SY5Y) foram realizadas em 6 genótipos e 1 amostra comercial utilizada como padrão. Com relação a composição química, de maneira geral, os genótipos apresentaram elevados teores de lipídeos (36,30 – 47,44%), fibras totais (11,31 – 15,88%), proteínas (7,78-9,50%) e cinzas (3,49 – 4,44%). Adicionalmente, as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (12-43%) e cianidina 3-rutinosídeo (57-88%) foram identificadas nos genótipos avaliados e o genótipo L22P13 apresentou um incremento de 85% no teor de antocianinas totais. Com relação ao perfil de carotenoides, luteína, zeaxantina, α-caroteno e β-caroteno foram os principais carotenoides identificados nos genótipos avaliados, sendo que os genótipos BRS-PAMISTA e L22P13 apresentaram os teores mais elevados de carotenoides totais (125,39μg/g e 118μg/g). Com relação a atividade antioxidante, todos os genótipos reduziram a geração do radical ABTS em maior ou menor grau, embora diferenças significativas entre os genótipos e a amostra comercial não tenham sido observadas (IC50 = 73,98 – 175,7 vs. 121,7 μg/g). Entretanto, houve associação moderada e inversa entre a geração do radical ABTS e níveis de antocianinas e carotenoides. Ausência de diferenças significativas entre os extratos hidroetanólicos dos genótipos e a amostra comercial também foi observada no ensaio da desoxirribose (IC50 = 361,5 – 497,7 vs. 520,1 μg/g). Em cultura de células SH-SY5Y, os extratos hidroetanólicos na concentração de 50 μg/mL apresentaram um efeito protetor contra as espécies reativas geradas pelo H2O2 (ensaio DCFH-DA) e esse resultado foi associado ao teor de antocianinas dos extratos. Os resultados apontam genótipos promissores, com elevados teores de antocianinas e carotenoides, com potencial atividade antioxidante in vitro e um possível efeito protetor de células frente as espécies reativas. / The açaí (Euterpe oleracea) is a fruit of the açaizeiro, a native palm of the Brazilian Amazon, considered a "superfruit" due to its high nutritional value, especially anthocyanins, associated with beneficial health effects. Since fruit genotypes developed by breeding programs have been evaluated to identify fruits with improved phytochemical composition and antioxidant potential, the aim of this study was to investigate the effect of genetic improvement in the chemical composition, bioactive compounds profile and antioxidant activity of six açaí (E. oleracea) genotypes. The analysis of chemical composition, anthocyanins and carotenoids profile and antioxidant activity in various in vitro systems (ABTS method, glutathione oxidation, deoxyribose test and SH-SY5Y cells) were performed in six genotypes of açaí and one commercial sample that was used as standard. Regarding the chemical composition, in general, the genotypes showed high levels of lipids (36.30 – 47.44%), total fiber (11.31 – 15.88%), protein (7.78-9.50%) and ashes (3.49 – 4.44%). In addition, the anthocyanins cyanidin 3-glucoside (12-43%) and cyanidin 3-rutinoside (57-88%) were identified in evaluated genotypes and L22P13 genotype showed an increase of 85% in total anthocyanin content. Regarding the carotenoid profile, lutein, zeaxanthin, α-carotene and β-carotene were the main carotenoid identified in genotypes, being that BRS-PAMISTA and L22P13 genotypes showed the highest levels of total carotenoids (125.39 μg/g and 118 μg/g). Regarding the antioxidant activity, all genotypes reduced ABTS radical generation in greater or lesser extension, although there were no significant differences between hydroethanolic extracts of different genotypes and the commercial sample (IC50 = 73.98 - 175.7 vs. 121.7 μg/g). However, an inverse and moderate association between radical ABTS generation and anthocyanins and carotenoids content was observed. Absence of significant differences between hydroethanolic extracts of evaluated genotypes and the commercial sample was observed also in the deoxyribose assay (IC50 = 361.5 to 497.7 vs. 520.1 μg/g). In culture of SH-SY5Y cells, hydroethanolic extracts at concentration of 50 μg/mL had a protective effect against the reactive species generated by H2O2 (DCFH-DA assay) and this result was associated with the anthocyanins content of the extracts. The results showed promising genotypes with high levels of anthocyanins and carotenoids with antioxidant potential in vitro and a possible protective effect of cells against reactive species.

Espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas através da respiração aeróbica e durante processos inflamatórios. Além disso, agressões externas como radiações, poluição, estresse, alcoolismo e tabagismo aumentam a sua produção. Altos níveis de ERO podem ocasionar dano oxidativo à lipídios, proteínas e DNA, comprometendo a função normal da célula, podendo estar envolvidos na patogênese e agravamento de diversas doenças. Há evidências que sugerem que antioxidantes naturais presentes em alimentos conferem benefícios adicionais à saúde, atuando como anticarcinogênicos, antiinflamatórios ou agentes antimutagênicos. O orégano (Oreganum sp) é uma especiaria mediterrânea usada como condimento na alimentação e pela medicina popular para diversos tipos de moléstias. O óleo possui forte ação antimicrobiana, devido ao elevado conteúdo de monoterpenos, sendo os principais o carvacrol, o timol e o para-cimeno. O carvacrol (5-isopropil-2metilfenol) é um fenol monoterpênico, com sabor picante e odor característico e tem sido amplamente usado na indústria de alimentos como aditivo seguro para aumentar a vida útil dos alimentos, como aromatizante em produtos assados, doces, bebidas e gomas de mascar, e/ou agente antimicrobiano com atividades contra bactérias, fungos e leveduras. Estudos têm relatado efeito antidepressivo e ansiolítico do carvacrol em camundongos, assim como proteção contra a radiação UVB diminuindo a peroxidação lipídica, estresse oxidativo e danos no DNA em células linfocitárias humanas e atividade antioxidante em diferentes sistemas de lipídios. Nós avaliamos a viabilidade celular e parâmetros de citotoxicidade do carvacrol em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Este parece modificar levemente a morfologia das células, sem modificar significativamente a biomassa celular, parecendo ser tóxico na concentração de 100 μg/mL. Nas demais concentrações (1 a 50 μg/mL) não houve citotoxicidade. No ensaio de DCFH-DA o carvacrol reduziu a produção de ERO intracelular e diminui significativamente a produção de radicais peroxil no ensaio TRAP. Esses dados reforçam a ideia do carvacrol ser um potencial antioxidante, sendo necessários mais estudos para avaliar o mecanismo de ação deste composto. / Reactive oxygen species (ROS) are produced through aerobic respiration and during inflammation. Besides, external aggressions such as radiation, pollution, stress, alcoholism and smoking increase their production. Elevated levels of ROS can cause oxidative damage to lipids, proteins and DNA, compromising the normal cell function, and may be involved in the pathogenesis and progression of several diseases. There is suggesting that natural antioxidants found in foods provide additional health benefits, acting as anticarcinogenic, anti-inflammatory agents or antimutagenic. Oregano (Oreganum sp) is a Mediterranean spice used in food as a condiment and in popular medicine to treat several types of diseases. The essential oil has strong antimicrobial activity, due to the high content of monoterpenes, the main ones being carvacrol, thymol and para-cymene. Carvacrol (5-isopropyl-2metilfenol) is a phenol monoterpene with spicy taste and odor and has been widely used in food industry as additive to preserve foods, as flavoring agent in baked goods, candy, drinks and chewing gums, and/or antimicrobial agent with activity against bacteria, fungi and yeasts. Studies have reported antidepressant and anxiolytic effects of carvacrol in mice, as well as protection against UVB radiation, decreased lipid peroxidation, oxidative stress and DNA damage in human lymphocyte cells, and antioxidant activity in different lipid systems. We evaluated cell viability and cytotoxicity parameters of carvacrol in human neuroblastoma cells SH-SY5Y. Carvacrol induced morphology changes in cells without significant modification of the cellular biomass content and it was toxic at the concentration of 100 μg/mL. In other concentrations (1-50 μg/mL) it showed no cytotoxicity. In DCFH-DA assay carvacrol reduced the intracellular ROS production and significantly decreased the production of peroxyl radicals in the TRAP assay. These data reinforce the idea of carvacrol as a potential antioxidant and more research is needed to evaluate the mechanism of action of this compound.

Philosophiae Doctor - PhD / Neurodegenerative disorders are characterised by progressive loss of the brain’s physiological functions as a result of gradual degeneration of neurons in the central nervous system. Even though they are classified as diseases of the elderly, occurrence earlier in life is possible, but that would suggest the influence of genetic and/or environmental factors. Due to the continuous rise in modernisation and industrialisation over the years, there has been an increase in incidence and prevalence of neurodegenerative disorders. With the advances in technology and life expectancy, the rates of the common forms (Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease), are expected to increase exponentially by 2050. Unfortunately, there is still no clinically approved treatment or therapy to slow down or halt the degenerative process as most registered drugs only offer symptomatic relief. Confounding this issue is the lack of definite mechanism of neurodegeneration, which is still poorly defined and not completely understood. Nonetheless, the pathology of most neurodegenerative disorders is believed to be a combination of interrelated processes that eventually leads to neuronal cell death. Among the postulated processes, the impact of excitotoxicity mediated by NMDA receptor over-activation is prominent and it is implicated in virtually all neurodegenerative disorders. With this basic insight, it is believed that molecules capable of inhibiting NMDA receptors and associated calcium channels, without affecting the normal physiological functions of the brain, could potentially serve as good neuroprotective drugs. Competitive and uncompetitive blockers (MK-801 and ketamine) have been explored, but none were clinically accepted due to undesirable side effects such as hallucinations, sedation and depression. However, NGP1-01, a polycyclic cage molecule, has been shown to be neuroprotective through modulation of NMDA receptors and voltage gated calcium channels and attenuation of MPP+ -induced toxicity. A similar approach could be useful in the design and development of new neuroprotective drugs. The aim of this study was to synthesise a series of open and rearranged cage-like molecules and explore their neuroprotective potential in neuroblastoma SH-SY5Y cells. The proposed structures, with norbornane scaffolds that contained different moieties, were designed to structurally resemble NGP1-01 and MK-801. Once synthesised, the compounds were purified and characterised, and were evaluated for their biological activities. Compounds were first screened for cytotoxicity at different concentrations. Thereafter, they were evaluated for neuroprotective effects against MPP+ -induced excitotoxicity and for calcium flux modulatory effects on NMDA receptor and voltage gated calcium channels. The norbornane derivatives were synthesised and characterised, and all final products were afforded in sufficient yields. All compounds with the exception of two compounds displayed good cytotoxic profiles towards the SH-SY5Y neuroblastoma cells at 10 µM, 50 µM and 100 µM concentrations as they demonstrated percentage cell viabilities close to 100% (control treated cells). Only two compounds showed percentage cell viability of 51% and 59% at 100 µM. Utilising the same cell line, all compounds, tested at 10 µM, attenuated MPP+ -induced toxicity after 24 hours of exposure to a neurotoxin. This was evident in the 23% to 53% enhancement (significant with p < 0.05) in cell viability when compared to the MPP+ only treated cells. In comparison to known NMDA receptor and/or voltage gated calcium channel blockers (MK-801, NGP1-01 or nimodipine), the synthesised compounds demonstrated mono or dual inhibition of calcium channels as they effectively attenuated calcium influx by blocking NMDA receptors and/or voltage gated calcium channels expressed in neuroblastoma SHSY5Y cells. This group of compounds were found to be more potent NMDA receptor inhibitors, probably due to similarities with MK-801 and memantine, than voltage gated calcium channel inhibitors. All compounds demonstrated moderate to good calcium inhibitory effects at NMDA receptors in the range of 23% to 70% while a selected few displayed very little or no activity at the voltage gated calcium channels. In conclusion, 27 compounds with norbornane scaffolds were successfully synthesised and evaluated for cytotoxicity and neuroprotection. The abilities of the synthesised compounds to protect neurons from the neurotoxin MPP+ and reduce calcium flux into neuronal cells were successfully demonstrated. These characteristics are essential in neuroprotection as they may prove significant in halting or slowing down the disease progression. The compounds showing a good cytotoxicity profile, neuroprotective effects and ability to reduce calcium overload, could potentially act as neuroprotective agents with good safety profiles or contribute as lead structures to the development and design of structurally related molecules that could clinically benefit people with neurodegenerative disorders.

Estudos demonstram que a indução do estresse oxidativo pelo peptídeo beta amiloide (A?) exerce um importante papel no desencadeamento da excitotoxicidade neuronal o que pode resultar no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. A formação do peptídeo A? se deve a alterações na proteína precursora de amiloide (APP) que é clivada para a formação do peptídeo A?. Por sua vez, os mecanismos de ação do A? no S.N.C. ocorrem através da sinalização do receptor NMDA (N-metil D-aspartato) receptor este que quando ativado pelo glutamato exerce importante papel fisiológico no S.N.C., visto que apresenta atividade ionotrópica que permite o influxo de Na+ e Ca2+ para as células neuronais, auxiliando nos processos de formação da memória e aprendizagem. Entretanto, apesar do seu papel fisiológico, a ativação excessiva do receptor NMDA é fortemente correlacionada com lesões no S.N.C. decorrente da excessiva permeabilidade do íon Ca2+ para o citosol das células neuronais. Com isso as concentrações de glutamato na fenda sináptica são estritamente controladas para que não haja ativação excessiva dos receptores com atividade glutamatérgica, como o receptor NMDA. Estudos indicam que o transporte de glutamina/glutamato através da barreira hematoencefálica é menor do que de outros aminoácidos, sendo que cerca de 25% a 30% do transporte de aminoácidos dos vasos sanguíneos para o cérebro através da barreira hematoencefálica é ocupado pelo aminoácido leucina, sendo este um grande responsável pela síntese de glutamato/glutamina no S.N.C. Com isso, estudos tem demonstrado que dietas enriquecidas com aminoácidos de cadeia ramificada, dentre eles a leucina, é responsável por alterar o metabolismo do glutamato e aumentar a susceptibilidade à excitotoxicidade de células neurais. A fim de testar esta hipótese utilizamos um modelo de cultura de células de neuroblastoma humano e realizamos o tratamento com diferentes concentrações de aminoácido leucina associado com o tratamento de peptídeo beta-amilóide. Realizamos as analises de citotoxicidade (LDH), viabilidade celular (MTT) e apoptose celular por citometria de fluxo (marcação com PE Anexina V e 7-AAD). Nossos resultados indicam que houve diferenças apenas entre o controle em relação aos demais grupos de tratamento / Studies demonstrate that induction of oxidative stress by beta amyloid peptide (A?) plays an important role in triggering neuronal excitotoxicity which can result in the development of neurodegenerative diseases. The formation of A? peptide are due to changes in the amyloid precursor protein (APP) which is cleaved to form the peptide A?. On the other hand, the mechanisms of action of A? in the C.N.S. occur through signaling of the NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor that when activated by glutamate plays an important physiological role in the C.N.S., as has inotropic activity that allows the influx of Na+ and Ca2+ into the neuronal cells, assisting in procedures of memory formation and learning. However, despite its physiological role, the excessive activation of the NMDA receptor is strongly correlated with C.N.S. lesions due to excess permeability of Ca2+ ions into the cytosol of neuronal cells. Thus the concentrations of glutamate in the synaptic cleft are strictly controlled so that there is excessive activation of receptors with glutamatergic activity, as the NMDA receptor. Studies indicate that the transport of glutamine/glutamate across the blood brain barrier is lower than that of other amino acids, of which about 25% to 30% of the amino acid transport blood vessels to the brain through the blood brain barrier is occupied by leucine this being one largely responsible for the synthesis of glutamate/glutamine in the C.N.S. Thus, studies have shown that diets enriched in branched chain amino acids, including leucine, are responsible for altering the metabolism of glutamate and excitotoxic increase susceptibility to neural cells. To test this hypothesis we used a cell culture model of human neuroblastoma and carry out the treatment with different concentrations of leucine associated with the processing of amyloid-beta peptide. We performed analysis of cytotoxicity (LDH), cell viability (MTT assay) and apoptosis using flow cytometry (Annexin V staining with PE and 7-AAD). Our results indicate that there were differences only between the control compared to the other treatment groups

O crescente interesse científico relacionado ao estudo das propriedades dos grãos de arroz vermelho (Oryza glaberrima) e preto (Oryza sativa) está atrelado ao elevado teor nutricional desses grãos. Quando submetidos ao processo de beneficiamento, eles geram subprodutos, entre os quais a quirera e o farelo, ricos em amido e compostos fenólicos, respectivamente. Uma vez consideradas as diferenças varietais dos grãos e o potencial uso dos seus subprodutos, os objetivos deste trabalho foram, primeiramente, determinar a composição química e o perfil de compostos bioativos desses grãos e, sequencialmente, avaliar sua atividade antioxidante por meio da análise do efeito protetor de células SH- SY5Y. Posteriormente, esses grãos e seus subprodutos foram utilizados como material para o desenvolvimento de filmes biodegradáveis. A identificação e quantificação de compostos fenólicos foi avaliada em extratos da fração farelo de ambos os grãos, por ser essa a fração que contém sua maior concentração. Os resultados evidenciaram que o ácido ferúlico foi o principal composto fenólico encontrado em ambas as amostras. Enquanto no farelo de arroz preto a cianidina-3-glicosídeo foi a antocianina majoritária, no farelo de arroz vermelho foi identificada a presença de proantocianidinas Com relação à atividade antioxidante, o ensaio realizado em cultura de células SH-SY5Y, demonstrou que os extratos de ambos os farelos de arroz, nas duas concentrações testadas (10 and 50 μg/mL), apresentam um efeito protetor contra as espécies reativas geradas pelo H2O2 (ensaio DCFH-DA) e, esse resultado foi relacionado à presença de compostos bioativos, especialmente ácidos fenólicos e antocianinas. Devido às propriedades físico-químicas e antioxidantes, amido e farinha de arroz vermelho foram utilizados para o desenvolvimento de filmes biodegradáveis. Foram desenvolvidas formulações contendo diferentes proporções de farinha e amido (10:0, 9:1, 7:3, 5:5 e 0:10, p/p). A incorporação de amido nos filmes de farinha promoveu melhora das propriedades mecânicas e estruturais e, redução da permeabilidade ao vapor de água. Baseado na excelente atividade de sequestro do radical DPPH. e no menor custo de produção, a formulação 9:1 foi escolhida para ser aplicada na forma de sachê para análise da estabilidade de óleo de girassol armazenado sob condições de oxidação acelerada. Os resultados demonstraram que os filmes foram eficazes como embalagem protetora impedindo a formação de produtos de degradação primários (peróxidos e dienos conjugados) e secundários (trienos conjugados) durante o armazenamento. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, fica evidenciada a possibilidade de utilização dos grãos de arroz vermelho e preto e seus subprodutos como matérias-primas promissoras para o desenvolvimento de embalagens biodegradáveis fonte de compostos antioxidantes. / The increase scientific interest related to the study of the properties of red (Oryza glaberrima) and black rice (Oryza sativa) grains is related to the high nutritional content of these grains. When submitted to the polishing process, they generate by-products, among them broken grains and bran, rich in starch and phenolic compounds, respectively. Once considered varietal differences of the grains, and the potential use of their by-products, the goals of this work were, firstly, to determine the chemical composition and the bioactive compounds profile of these grains and, sequentially evaluate their antioxidant activity by analyzing the protective effect of SH-SY5Y cells. Subsequently, these grains and their by-products were used as material for the development of biodegradable films. The identification and quantification of phenolic compounds was evaluated in extracts of the bran fraction of both grains, since this is the fraction that contains the highest concentration of them. The results showed that ferulic acid was the main phenolic compound found in both samples. While in the black rice bran cyanidin-3-glycoside was the major anthocyanin, in the red rice bran the presence of proanthocyanidins was identified. In relation to the antioxidant activity, the SHSY5Y cell culture assay showed that the extracts from both rice bran, at both concentrations tested (10 and 50 μg/ mL), had a protective effect against the reactive species generated by H2O2 (DCFH-DA assay) and this result was related to the presence of bioactive compounds, especially phenolic acids and anthocyanins. Due to the physicochemical and antioxidant properties, starch and red rice flour were used for the development of biodegradable films Formulations containing different ratios of flour and starch (10:0, 9:1, 7:3, 5:5 and 0:10, w/w) were developed. The incorporation of starch in the flour films promoted improved mechanical and structural properties, and reduced permeability to water vapor. Based on excellent scavenging activity of DPPH radical and lowest production cost, the 9: 1 formulation was chosen to be applied in the form of sachets to analyze the stability of sunflower oil stored under accelerated oxidation conditions. The results demonstrated that the films were effective as protective packaging preventing the formation of primary degradation products (peroxides and conjugated dienes) and secondary (conjugated trienes) during the storage. Based on the results obtained in this work, it was confirmed the possibility of using red and black rice grains and their by-products as promising raw materials for the development of biodegradable packaging source of antioxidant compounds.