Estudos demonstram que a indução do estresse oxidativo pelo peptídeo beta amiloide (A?) exerce um importante papel no desencadeamento da excitotoxicidade neuronal o que pode resultar no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. A formação do peptídeo A? se deve a alterações na proteína precursora de amiloide (APP) que é clivada para a formação do peptídeo A?. Por sua vez, os mecanismos de ação do A? no S.N.C. ocorrem através da sinalização do receptor NMDA (N-metil D-aspartato) receptor este que quando ativado pelo glutamato exerce importante papel fisiológico no S.N.C., visto que apresenta atividade ionotrópica que permite o influxo de Na+ e Ca2+ para as células neuronais, auxiliando nos processos de formação da memória e aprendizagem. Entretanto, apesar do seu papel fisiológico, a ativação excessiva do receptor NMDA é fortemente correlacionada com lesões no S.N.C. decorrente da excessiva permeabilidade do íon Ca2+ para o citosol das células neuronais. Com isso as concentrações de glutamato na fenda sináptica são estritamente controladas para que não haja ativação excessiva dos receptores com atividade glutamatérgica, como o receptor NMDA. Estudos indicam que o transporte de glutamina/glutamato através da barreira hematoencefálica é menor do que de outros aminoácidos, sendo que cerca de 25% a 30% do transporte de aminoácidos dos vasos sanguíneos para o cérebro através da barreira hematoencefálica é ocupado pelo aminoácido leucina, sendo este um grande responsável pela síntese de glutamato/glutamina no S.N.C. Com isso, estudos tem demonstrado que dietas enriquecidas com aminoácidos de cadeia ramificada, dentre eles a leucina, é responsável por alterar o metabolismo do glutamato e aumentar a susceptibilidade à excitotoxicidade de células neurais. A fim de testar esta hipótese utilizamos um modelo de cultura de células de neuroblastoma humano e realizamos o tratamento com diferentes concentrações de aminoácido leucina associado com o tratamento de peptídeo beta-amilóide. Realizamos as analises de citotoxicidade (LDH), viabilidade celular (MTT) e apoptose celular por citometria de fluxo (marcação com PE Anexina V e 7-AAD). Nossos resultados indicam que houve diferenças apenas entre o controle em relação aos demais grupos de tratamento / Studies demonstrate that induction of oxidative stress by beta amyloid peptide (A?) plays an important role in triggering neuronal excitotoxicity which can result in the development of neurodegenerative diseases. The formation of A? peptide are due to changes in the amyloid precursor protein (APP) which is cleaved to form the peptide A?. On the other hand, the mechanisms of action of A? in the C.N.S. occur through signaling of the NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor that when activated by glutamate plays an important physiological role in the C.N.S., as has inotropic activity that allows the influx of Na+ and Ca2+ into the neuronal cells, assisting in procedures of memory formation and learning. However, despite its physiological role, the excessive activation of the NMDA receptor is strongly correlated with C.N.S. lesions due to excess permeability of Ca2+ ions into the cytosol of neuronal cells. Thus the concentrations of glutamate in the synaptic cleft are strictly controlled so that there is excessive activation of receptors with glutamatergic activity, as the NMDA receptor. Studies indicate that the transport of glutamine/glutamate across the blood brain barrier is lower than that of other amino acids, of which about 25% to 30% of the amino acid transport blood vessels to the brain through the blood brain barrier is occupied by leucine this being one largely responsible for the synthesis of glutamate/glutamine in the C.N.S. Thus, studies have shown that diets enriched in branched chain amino acids, including leucine, are responsible for altering the metabolism of glutamate and excitotoxic increase susceptibility to neural cells. To test this hypothesis we used a cell culture model of human neuroblastoma and carry out the treatment with different concentrations of leucine associated with the processing of amyloid-beta peptide. We performed analysis of cytotoxicity (LDH), cell viability (MTT assay) and apoptosis using flow cytometry (Annexin V staining with PE and 7-AAD). Our results indicate that there were differences only between the control compared to the other treatment groups

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T19:19:35Z No. of bitstreams: 1 Lizandra Moreira Góes... Caracterização dos efeitos tóxicos....pdf: 1602592 bytes, checksum: 16b9153b36fb34585abb21b40bd4bdef (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T19:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lizandra Moreira Góes... Caracterização dos efeitos tóxicos....pdf: 1602592 bytes, checksum: 16b9153b36fb34585abb21b40bd4bdef (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / Catecóis são derivados do benzeno, podendo apresentar citotoxicidade, que pode constituir um modelo experimental útil para o desenvolvimento de novos fármacos. No bioma brasileiro inúmeras plantas produzem metabólitos com atividades diversas, como antioxidantes, ou inibidores do crescimento celular. No Brasil, as neoplasias são a segunda causa de óbito, especialmente aquelas derivadas do sistema nervoso, aumentando o interesse por novos antineoplásicos e agentes neuroprotetores. Este trabalho caracteriza efeitos citotóxicos do 1,2-dihidroxibenzeno (CAT) e discretamina (DSC) em células do sistema nervoso in vitro. Determinou-se a EC50 de CAT e DSC usando brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT), investigou-se sua auto-oxidação por espectrofotometria, avaliou-se mudanças morfológicas e condensação/fragmentação nuclear por microscopia. Avaliou-se a proteção de DSC e 8-metoxipsoraleno (8-MOP) contra a citotoxicidade do CAT. O padrão de morte celular foi analisado por citometria de fluxo. A espoliação de glutation reduzido (GSH) foi analisada usando monoclorobimano. A toxicidade do CAT para células SH-SY5Y e C6 depende da dose e associa-se à formação de quinonas. Houve mudanças morfológicas, condensação/fragmentação da cromatina e morte apoptótica, não relacionada à espoliação de GSH. DSC não foi tóxica para células SH-SY5Y, porém protegeu contra os efeitos do CAT em baixas concentrações. DSC mostrou-se citotóxica para células de glioma (GL-15 e C6) e potencializou o CAT. Pré-tratamento por 30 minutos com DSC protegeu contra a ação do CAT após 72 horas. 8-MOP potencializou os efeitos do CAT, não revertendo seus efeitos na viabilidade celular, morfologia celular, condensação/fragmentação nuclear, e espoliação de GSH. Esses resultados caracterizam um modelo de citotoxicidade que pode ser aplicado no desenvolvimento de novos agentes farmacológicos. Estudos complementares são necessários para elucidar a proteção da DSC. / Catechols are benzene derivatives, which may exhibit cytotoxic activity that can be employed to develop new drugs. Plants are important sources of metabolites with pharmacological activities such as antioxidants, or cell growth inhibitors. In Brazil, cancer is the second leading cause of death, especially those derived from the nervous system, which increase the interest for new antineoplastic and neuroprotective drugs. The cytotoxic effects promoted by 1,2-dihydroxybenzene (CAT) and discretamine (DSC) in nervous system cells were characterized in vitro. The protective effects of DSC and 8-methoxypsoralen (8-MOP) against CAT-induced cytotoxicity were also evaluated. CAT and DSC EC50 was determined by using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). CAT auto-oxidation was investigated by spectrophotometry. Morphological changes and nuclear condensation/ fragmentation were evaluated by microscopy. The pattern of cell death was obtained by flow cytometry. Reduced glutathione (GSH) depletion was analyzed by using monochlorobimane. CAT induced a dose-dependent toxicity to SH-SY5Y and C6 cells, associated with reactive quinones formation. It also induced morphological changes, nuclear condensation/fragmentation, and apoptotic death not caused by GSH depletion. DSC was not toxic to SH-SY5Y cells, but protected against CAT effects at low concentrations. DSC was be cytotoxic to glioma cells (GL-15 and C6) and potentiated CAT effects. However, pretreatment for 30 minutes with DSC protected them against CAT after 72 hours. 8-MOP also potentiated CAT effects instead to protect cells. These results characterize an experimental model useful for studies searching new pharmacological agents. However, further studies are needed to elucidate the DSC protective effects.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-09-28T12:03:28Z No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-28T14:14:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T14:14:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) Previous issue date: 2017-08-11 / O glutamato, aminoácido não-essencial, é um neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central (SNC), sendo liberado durante o impulso nervoso. Em situações de patologia cerebral, o acúmulo de glutamato ocorre no espaço extracelular, causando dano neuronal e, eventualmente, apoptose. Muitos trabalhos relataram que a citotoxicidade do glutamato está associada a várias doenças neurológicas. Neste contexto, o acetato, um ácido graxo de cadeia curta, pode beneficiar o SNC de forma energética e estrutural. A acetil-coenzima A, forma metabolicamente ativa de acetato, é utilizada como substrato em vias bioquímicas envolvidas no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas, além de aumentar a acetilação das histonas, alterando a expressão de genes inflamatórios. A linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y é comumente usada em estudos relacionados a doenças neurodegenerativas, com uma capacidade de expansão em larga escala antes da diferenciação, enquanto que a linhagem de células-tronco de polpa de dente de leite decíduo esfoliado (SHED) é comumente utilizada em modelos de estudo do comportamento celular. O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do acetato mediante a citotoxicidade causada pelo glutamato em células SH-SY5Y e SHED. Células SH-SY5Y e SHED foram cultivadas, respectivamente, em meio DMEM/F12 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, e meio alfa-MEM, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v), 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais e 2 mM L-glutamina. A viabilidade celular em diferentes concentrações de acetato (5 a 75 mM) e glutamato (25 a 150mM) foi medida pelo ensaio MTT. A diferenciação foi realizada em SH-SY5Y pela suplementação do meio com 10 μM de ácido retinóico (AR) e redução de SFB para 1% (v/v) durante 4, 7 e 10 dias em cultura, e em SHED pela substituição do meio de cultivo por DMEM Low-Glicose, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 10-7 M de dexametasona, 50 μM de 2-fosfato ácido ascórbico e 2 mM de β-glicerolfosfato, a fim de verificar como essas células respondem à mistura de acetato/glutamato. A análise estatística foi realizada teste ANOVA de uma ou duas vias, bem como pelo teste de Kruskal-Wallis, quando apropriado, com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Após 7 dias de incubação, as concentrações de 5 e 25 mM de acetato apresentaram menor influência sobre a viabilidade de células SH-SY5Y e SHED, enquanto que o IC50% de glutamato ficou em torno de 75mM e 50mM para estas linhagens, respectivamente. Ao submeter as células ao tratamento combinado de acetato e glutamato, observou-se que o acetato não exerceu citoproteção mediante exposição celular ao glutamato. Após análise qualitativa da diferenciação osteogênica em SHEDs, foi observado maior mineralização nas células tratadas com AR e acetato, em comparação com as células controle. Estudos subsequentes, que permitam identificar como tais células respondem ao acetato em nível molecular, considerando a expressão de ciclinas, compactação da cromatina e a presença de marcadores bioquímicos característicos durante a diferenciação de cada linhagem, por exemplo, poderão fornecer um entendimento mais completo de como esse composto atua na dinâmica metabólica e bioenergética celular. / Glutamate, a non-essential amino acid, is an excitatory neurotransmitter of the central nervous system (CNS), being released during the nerve impulse. In situations of cerebral pathology, the accumulation of glutamate occurs in the extracellular space, causing neuronal damage and, eventually, apoptosis. Many studies have reported that glutamate cytotoxicity is associated with various neurological diseases. In this context, acetate, a short chain fatty acid, can benefit the CNS energetically and structurally. Acetyl-coenzyme A, a metabolically active form of acetate, is used as a substrate in biochemical pathways involved in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, in addition to increasing the acetylation of histones, altering the expression of inflammatory genes. The SH-SY5Y human neuroblastoma cell line is commonly used in studies related to neurodegenerative diseases, with a large scale expansion capacity prior to differentiation, whereas the stem cell line of exfoliated deciduous teeth (SHED) is commonly used in models of cellular behavior. The objective of this research was evaluate the effects of acetate by glutamate-induced cytotoxicity on SH-SY5Y and SHED cells. SH-SY5Y and SHED cells were cultured respectively in DMEM / F12 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) and 1% (v/v) penicillin-streptomycin, and alpha-MEM medium, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v), 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 0.01 mM non-essential amino acids and 2 mM L-glutamine. Cell viability at different concentrations of acetate (5 to 75 mM) and glutamate (25 to 150 mM) was measured by the MTT assay. Differentiation was performed on SH-SY5Y by supplementing the medium with 10 μM retinoic acid (RA) and reducing FBS to 1% (v/v) for 4, 7 and 10 days in culture, and in SHED by replacing the culture medium with DMEM Low-Glucose, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 10-7 M dexamethasone, 50 μM ascorbic acid 2-phosphate and 2 mM β- Glycerol phosphate in order to verify how these cells respond to the acetate/glutamate mixture. Statistical analysis was performed one-way or two-way ANOVA, as well as Kruskal-Wallis test, when appropriate, with p < 0.05 considered statistically significant. After 7 days of incubation, concentrations of 5 and 25 mM acetate had less influence on the viability of SH-SY5Y and SHED cells, whereas the IC50% of glutamate was around 75mM and 50mM for these lines, respectively. By subjecting the cells to the combined treatment of acetate and glutamate, it was observed that acetate did not exert cytoprotection through cellular exposure to glutamate. After qualitative analysis of the osteogenic differentiation in SHEDs, greater mineralization was observed in the cells treated with RA and acetate, in comparison with the control cells. Subsequent studies to identify how these cells respond to acetate at the molecular level, considering the expression of cyclins, chromatin compaction, and the presence of characteristic biochemical markers during differentiation of each lineage, for example, may provide a more complete understanding of how this component acts on the metabolic dynamics and cellular bioenergetics.

Estudos demonstram que a indução do estresse oxidativo pelo peptídeo beta amiloide (A?) exerce um importante papel no desencadeamento da excitotoxicidade neuronal o que pode resultar no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. A formação do peptídeo A? se deve a alterações na proteína precursora de amiloide (APP) que é clivada para a formação do peptídeo A?. Por sua vez, os mecanismos de ação do A? no S.N.C. ocorrem através da sinalização do receptor NMDA (N-metil D-aspartato) receptor este que quando ativado pelo glutamato exerce importante papel fisiológico no S.N.C., visto que apresenta atividade ionotrópica que permite o influxo de Na+ e Ca2+ para as células neuronais, auxiliando nos processos de formação da memória e aprendizagem. Entretanto, apesar do seu papel fisiológico, a ativação excessiva do receptor NMDA é fortemente correlacionada com lesões no S.N.C. decorrente da excessiva permeabilidade do íon Ca2+ para o citosol das células neuronais. Com isso as concentrações de glutamato na fenda sináptica são estritamente controladas para que não haja ativação excessiva dos receptores com atividade glutamatérgica, como o receptor NMDA. Estudos indicam que o transporte de glutamina/glutamato através da barreira hematoencefálica é menor do que de outros aminoácidos, sendo que cerca de 25% a 30% do transporte de aminoácidos dos vasos sanguíneos para o cérebro através da barreira hematoencefálica é ocupado pelo aminoácido leucina, sendo este um grande responsável pela síntese de glutamato/glutamina no S.N.C. Com isso, estudos tem demonstrado que dietas enriquecidas com aminoácidos de cadeia ramificada, dentre eles a leucina, é responsável por alterar o metabolismo do glutamato e aumentar a susceptibilidade à excitotoxicidade de células neurais. A fim de testar esta hipótese utilizamos um modelo de cultura de células de neuroblastoma humano e realizamos o tratamento com diferentes concentrações de aminoácido leucina associado com o tratamento de peptídeo beta-amilóide. Realizamos as analises de citotoxicidade (LDH), viabilidade celular (MTT) e apoptose celular por citometria de fluxo (marcação com PE Anexina V e 7-AAD). Nossos resultados indicam que houve diferenças apenas entre o controle em relação aos demais grupos de tratamento / Studies demonstrate that induction of oxidative stress by beta amyloid peptide (A?) plays an important role in triggering neuronal excitotoxicity which can result in the development of neurodegenerative diseases. The formation of A? peptide are due to changes in the amyloid precursor protein (APP) which is cleaved to form the peptide A?. On the other hand, the mechanisms of action of A? in the C.N.S. occur through signaling of the NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor that when activated by glutamate plays an important physiological role in the C.N.S., as has inotropic activity that allows the influx of Na+ and Ca2+ into the neuronal cells, assisting in procedures of memory formation and learning. However, despite its physiological role, the excessive activation of the NMDA receptor is strongly correlated with C.N.S. lesions due to excess permeability of Ca2+ ions into the cytosol of neuronal cells. Thus the concentrations of glutamate in the synaptic cleft are strictly controlled so that there is excessive activation of receptors with glutamatergic activity, as the NMDA receptor. Studies indicate that the transport of glutamine/glutamate across the blood brain barrier is lower than that of other amino acids, of which about 25% to 30% of the amino acid transport blood vessels to the brain through the blood brain barrier is occupied by leucine this being one largely responsible for the synthesis of glutamate/glutamine in the C.N.S. Thus, studies have shown that diets enriched in branched chain amino acids, including leucine, are responsible for altering the metabolism of glutamate and excitotoxic increase susceptibility to neural cells. To test this hypothesis we used a cell culture model of human neuroblastoma and carry out the treatment with different concentrations of leucine associated with the processing of amyloid-beta peptide. We performed analysis of cytotoxicity (LDH), cell viability (MTT assay) and apoptosis using flow cytometry (Annexin V staining with PE and 7-AAD). Our results indicate that there were differences only between the control compared to the other treatment groups

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Usnic acid (UA) is the most common and abundant lichenic secondary metabolite with potential therapeutic application. Anti-inflammatory and antitumour properties have already been reported and UA-enriched extracts are widely used to treat several diseases in the folk medicine. On the other hand, a growing body of evidence has suggested that UA present pro-oxidant properties, which might induce cellular damage mediated by reactive species. Based on this data, first we performed in silico evaluation of UA interactions with genes/proteins and important compounds for cellular redox balance. Then, we assessed UA redox properties against different reactive species (RS) generated in vitro, and evaluated its action on SH-SY5Y neuronal-like cells subjected to hydrogen peroxide (H2O2) treatment, since no in vitro neurotoxicological data has been reported so far. Total reactive antioxidant potential index (TRAP) showed a significant antioxidant capacity of UA at 20 μg/mL; UA was also effective against hydroxyl radicals and reduced nitric oxid formation. However, in vitro lipoperoxidation was enhanced by UA, and cell viability was decreased along 24 hours of treatment, according to MTT assay (3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) and morphological analysis. Moreover, UA did not display protective effects against H2O2-induced cell death in any case. The DCFH- DA (2,7-dichlorfluorescein-diacetate) based assay indicated that UA enhanced basal reactive species production at 20 μg/mL for 1 hour and from 2 ng/mL to 20 μg/mL for 4 and 24 hours. In addition, UA appears to potentiate H2O2-induced reactive species production. Our results suggest that UA displays variable redox-active properties, acting either as antioxidant or pro-oxidant agent according to different system conditions and/or cellular environment. These pro-oxidant properties in SH-SY5Y might be responsible by potential neurotoxic effects of UA / O ácido úsnico (AU) é um dos mais comuns e abundantes metabólitos secundários liquênicos com potencial aplicação terapêutica. As propriedades anti-inflamatória e antitumoral já foram relatadas e extratos de liquens enriquecidos com ácido úsnico, são amplamente utilizados para tratar diversas doenças na medicina popular. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que o AU apresenta propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular mediado por espécies reativas. Baseado nesses dados, primeiro foi realizado a avaliação in silico das interações do AU com genes / proteínas e compostos importantes para o equilíbrio celular redox. Além disso, analisamos as propriedades redox-ativa do AU contra diferentes espécies reativas (SR) geradas in vitro, e seu efeito em células neuronais SH-SY5Y na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), já que nenhum dado neurotoxicológico in vitro tem sido relatado até agora. O índice de potencial antioxidante reativo total (TRAP) mostrou uma capacidade antioxidante significativa do AU a 20 μg/mL; AU também foi eficaz contra os radicais hidroxila e reduziu a formação do óxido nítrico. No entanto, a lipoperoxidação in vitro foi induzida pelo AU, e a viabilidade celular foi diminuída ao longo de 24 horas de tratamento, de acordo com ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) e análise morfológica. Além disso, o AU não protegeu a célula contra a morte celular induzida pelo H2O2. O ensaio DCFH-DA (2 7 diacetato de diclorofluoresceína) mostrou que o tratamento de AU (20 μg/mL) por 1 hora e (2 ng/mL a 20 μg/mL) durante 4 e 24 horas, aumentou a produção basal de espécies reativas e quando as células foram co-tratadas com o H2O2, o AU parece potencializar o H2O2 induzindo a produção de espécies reativas. Nossos resultados sugerem que o AU exibe variáveis propriedades redox-ativas, atuando como um agente antioxidante e pró-oxidante, de acordo com as diferentes condições do sistema e / ou ambiente celular. Estas propriedades pró-oxidantes em células SH-SY5Y podem ser responsáveis por possíveis efeitos neurotóxicos do AU.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.