Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T20:33:02Z No. of bitstreams: 1 Diêgo Madureira Atividade quimipssensibilizante....pdf: 8949330 bytes, checksum: a1fc3a89cc9967d30970ad432a1039b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T20:33:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diêgo Madureira Atividade quimipssensibilizante....pdf: 8949330 bytes, checksum: a1fc3a89cc9967d30970ad432a1039b4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O câncer é uma das principais causas de morte e apresenta importantes índices de morbidade em todo o mundo. Gliomas são os tumores primários malignos mais comuns e letais em adultos, e embora sejam estudados já há muito tempo, os avanços tecnológicos não se traduziram em ganhos terapêuticos reais, de forma que a sobrevida dos pacientes com esse diagnóstico continua muito baixa. Dessa forma, a pesquisa de novas formas de terapia e fármacos se apresenta como uma necessidade para a implementação de um tratamento realmente eficaz. As glutation S-transferases (GST) são enzimas multifuncionais que atuam na detoxificação celular por catalisarem a conjugação de compostos exógenos com o tripeptídeo glutation (GSH). Como esta reação também pode ocorrer com moléculas de agente terapêuticos, a expressão destas enzimas, principalmente a isoforma π, está relacionada com aquisição de resistência à quimioterapia no câncer, tornando-a um alvo na busca por novos fármacos. No presente trabalho, o 8-metoxipsoraleno (8-MOP), um derivado do psoraleno de uso clínico rotineiro no tratamento de doenças da pele, é apresentado como possível promissor agente antineoplásico por demonstrar atividade inibitória da GST-π e antiproliferativa em um modelo in vitro de glioma. O estudo adotou uma abordagem que associa técnicas químicas, bioquímicas e celulares. Análises de cinética enzimática foram feitas utilizando-se o GSH e o cloro 2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substratos e o conteúdo de GSH intracelular foi visualizado por coloração com monoclorobimano (MCB). As técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência e espetrofotometria auxiliaram no estabelecimento dos detalhes do mecanismo de ação. Para a avaliação da atividade antitumoral, células de glioma murino (C6) e humano (GL-15) foram usadas, além de astrócitos de rato como controle de células normais. A ação do 8-MOP na viabilidade, proliferação, migração, expressão de proteínas, morfologia e tipo de morte celular foi avaliada através de variadas técnicas. O composto inibiu competitivamente (aumentou Km sem alterar Vmax) a atividade enzimática, ligando-se ao sítio H da enzima. O 8-MOP agiu como quimiossensibilizante, potencializando o efeito de fármacos como etoposídeo e temozolomida em células tumorais. Além disso, reduziu a proliferação celular de forma tempo- e concentração-dependente, e induziu alterações morfológicas e apoptose quando em altas concentrações. Não foi observada morte celular por necrose. As células normais não foram afetadas nas mesmas proporções das tumorais. Adicionalmente, derivados cumarínicos estruturalmente relacionados ao 8-MOP apresentaram atividade similar, ou mesmo superior, à deste. Assim, o 8-MOP apresenta-se como um protótipo para novo agente para o tratamento, não apenas de glioma, mas do câncer de uma forma geral, podendo ainda ser útil no tratamento de outras doenças com falhas terapêuticas ligadas à GST. / Cancer is an important cause of mortality around the world. Gliomas are the most common and lethal primary malignant brain tumors, and have been studied for a long time. Nevertheless, the impact of technological advances on clinical outcome has not been satisfactory, and the available drugs are not able to provide significant increase on the survival of patients. Then, researches to find new therapeutic approaches, treatments and drugs are necessary. The Glutathione S-transferases (GSTs) are multifunctional enzymes which play a key role in cellular detoxification. Due to its ability to promote conjugation between drugs and the tripeptide glutathione (GSH), its expression is related to drug resistance, specially the isoform π (GSTP1-1), that plays a crucial role in cancer chemoprevention and chemoresistance and is a key target for anticancer drug development. In this work we presented, for the first time, the 8-methoxypsoralen (8-MOP), a psoralen derivative clinically used in skin diseases treatment, as a novel promising antitumor drug for acting as GST-π inhibitor and anti-proliferative agent. The approach was the association of chemical, biochemical and cellular techniques. Enzymatic kinetic analysis were performed in vitro using GSH and chloro-dinitrobenzene (CDNB) as substrates and cellular content of GSH was visualized by monochlorobimane (MCB) staining. Chromatographic and spectrophotometric techniques were used for elucidation of detailed mechanism of action. In order to investigate antitumor activity, rat glioma C6 cells and human glioblastoma GL-15 cells were used in tests, as well as rat astrocytes for comparison. The action of 8-MOP on cell viability, proliferation, migration, morphology, specific protein expression, and type of cell death was evaluated by several techniques. The drug inhibited dose-dependently and competitively (increased Km but did not change Vmax) the enzyme activity, binding to the H-site of GST-π. 8-MOP acted as chemosensitizer, increasing the effect of the drugs etoposide and temozolomide on tumor cells. Also, this drug reduced tumor cell proliferation in vitro time- and dose-dependently, and induced apoptosis and changes on cell morphology when used at high concentrations. No necrosis was observed. The normal astrocytes were not affected to the extent that tumor cells were. Additionally, coumarin derivatives structurally related to 8-MOP presented similar, or stronger, effects. Therefore, the 8-MOP is a prototype for new chemosensitizer and anti-cancer drug design, and could also be useful for treatment of other diseases with failure of therapy related to GST.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-10-01T14:25:59Z No. of bitstreams: 1 Pietro Araujo dos Santos Efeito... 2015.pdf: 1429638 bytes, checksum: 830edcdf557efac1a5f1e22d8e0e6a23 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-10-01T14:26:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Pietro Araujo dos Santos Efeito... 2015.pdf: 1429638 bytes, checksum: 830edcdf557efac1a5f1e22d8e0e6a23 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-01T14:26:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pietro Araujo dos Santos Efeito... 2015.pdf: 1429638 bytes, checksum: 830edcdf557efac1a5f1e22d8e0e6a23 (MD5) Previous issue date: 2015 / Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Doença de Parkinson (DP) é caracterizada por uma perda seletiva e profunda dos neurônios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta (SNpc) do mesencéfalo, acompanhada pela espoliação de dopamina no corpo estriado. A maioria dos casos de DP apresenta etiologia multifatorial, com a presença de componentes genéticos e ambientais. Embora existam diferentes causas possíveis, a patogênese da desordem parece convergir para mecanismos relacionados à disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e mau enovelamento proteico. Um modelo estabelecido na literatura para estudo desta doença, tanto in vitro quanto in vivo é a administração de rotenona, um pesticida derivado de plantas que inibe o complexo I mitocondrial e favorece a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), levando a uma espoliação de glutation reduzido (GSH) através do processo de detoxificação destes compostos eletrofílicos, catalisados por glutation S-transferases (GSTs). Sendo assim, a busca por novas substâncias com atividade neuroprotetora é atualmente o foco de estudos, e metabólitos isolados de plantas podem ser fontes destas moléculas. Dessa forma, o 8-metoxipsoraleno (8-MOP), uma furocumarina, foi testado como um possível agente protetor sobre a citotoxicidade causada pela rotenona em modelos in vitro de gliomas, considerando o papel do glutation neste processo. O estudo adotou uma abordagem que associa técnicas bioquímicas e de biologia celular. Ensaios de viabilidade celular foram realizados em células de glioma murino (C6) e glioblastoma multiforme humano (U251) através da redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT), e visualização por microscopia de contraste de fase. O tipo de morte celular provocada pela rotenona nas células U251 foi realizado por marcação com anexina V e iodeto de propídeo (IP), seguido por quantificação por citometria de fluxo. A determinação do conteúdo de GSH intracelular após tratamento com rotenona e 8-MOP foi visualizado por marcação com monoclorobimano (MCB) nas linhagens C6 e U251. Os resultados demonstraram que a rotenona foi citotóxica em ambas as linhagens, reduzindo a viabilidade e alterando a morfologia celular, enquanto que o 8-MOP não apresentou atividade citotóxica. Contudo, o tratamento com o 8-MOP não foi capaz de proteger as células contra os efeitos deletérios da rotenona. No estudo do tipo de morte celular, a porcentagem de células marcadas com anexina V foi maior nos grupos tratados com rotenona, demonstrando que a morte celular ocorre principalmente por apoptose. A análise com MCB demonstrou que a rotenona espoliou GSH, porém o pré-tratamento com 8-MOP inibiu a espoliação. Embora o 8-MOP não tenha sido bem sucedido na proteção das células, a manutenção do conteúdo de GSH corrobora com estudos prévios que descrevem este composto como um potencial inibidor de GST, uma atividade farmacológica que deve ser testada para confirmar a sua eficácia como agente terapêutico. / Parkinson’s disease (PD) is characterized by a profound and selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) accompanied by midbrain dopamine depletion in the striatum. Most cases of PD present multifactorial etiologies, with the presence of genetic and environmental components. Although there are different possible causes, the pathogenesis of the disorder seems to converge to mechanisms related to mitochondrial dysfunction, oxidative stress and bad protein folding. An established model in the literature to study this disease, both in vitro and in vivo is rotenone administration, a pesticide derived from plants that inhibits the mitochondrial complex I and favors the generation of reactive oxygen species (ROS), leading to reduced glutathione (GSH) depletion through the detoxification process of this electrophilic compound catalyzed by glutathione S-transferases (GSTs). Thus, the search for new substances with neuroprotective activity is currently the focus of studies, and plant isolated metabolites can be sources of these molecules. Thus, 8-methoxypsoralen (8-MOP), a furocoumarin, was tested as a potential protective agent on the cytotoxicity caused by rotenone in glioma cells in vitro models, considering the role of glutathione in the process. The study adopted an approach that combines biochemical and cell biology techniques. Cell viability assays were performed in murine glioma cells (C6) and human glioblastoma (U251) cells through the reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), and visualization by phase contrast microscopy. The type of cell death caused by rotenone in U251 cells was performed by staining with annexin V and propidium iodide (PI) followed by flow cytometric quantitation. The determination of intracellular GSH content after treatment with rotenone and 8-MOP was visualized by staining with monochlorobimane (MCB) in the lineages U251 and C6. The results demonstrated that rotenone was cytotoxic to both cell lineages, reducing the viability and changing the cell morphology, whereas the 8-MOP did not show cytotoxic activity. However, the treatment with 8-MOP was not able to protect cells against the deleterious effects of rotenone. In the type of cell death studies, the percentage of cells stained with annexin V was higher in the groups treated with rotenone, demonstrating that cell death occurs primarily by apoptosis. The analysis with MCB has shown that rotenone depleted GSH, but pre-treatment with 8-MOP inhibited the depletion. Although the 8-MOP has not been successful in protecting cells, the maintenance of GSH content corroborates with previous studies that describe this compound as a potential inhibitor of GST, a pharmacological activity that should be tested to confirm its effectiveness as a therapeutic agent.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T19:19:35Z No. of bitstreams: 1 Lizandra Moreira Góes... Caracterização dos efeitos tóxicos....pdf: 1602592 bytes, checksum: 16b9153b36fb34585abb21b40bd4bdef (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T19:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lizandra Moreira Góes... Caracterização dos efeitos tóxicos....pdf: 1602592 bytes, checksum: 16b9153b36fb34585abb21b40bd4bdef (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / Catecóis são derivados do benzeno, podendo apresentar citotoxicidade, que pode constituir um modelo experimental útil para o desenvolvimento de novos fármacos. No bioma brasileiro inúmeras plantas produzem metabólitos com atividades diversas, como antioxidantes, ou inibidores do crescimento celular. No Brasil, as neoplasias são a segunda causa de óbito, especialmente aquelas derivadas do sistema nervoso, aumentando o interesse por novos antineoplásicos e agentes neuroprotetores. Este trabalho caracteriza efeitos citotóxicos do 1,2-dihidroxibenzeno (CAT) e discretamina (DSC) em células do sistema nervoso in vitro. Determinou-se a EC50 de CAT e DSC usando brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT), investigou-se sua auto-oxidação por espectrofotometria, avaliou-se mudanças morfológicas e condensação/fragmentação nuclear por microscopia. Avaliou-se a proteção de DSC e 8-metoxipsoraleno (8-MOP) contra a citotoxicidade do CAT. O padrão de morte celular foi analisado por citometria de fluxo. A espoliação de glutation reduzido (GSH) foi analisada usando monoclorobimano. A toxicidade do CAT para células SH-SY5Y e C6 depende da dose e associa-se à formação de quinonas. Houve mudanças morfológicas, condensação/fragmentação da cromatina e morte apoptótica, não relacionada à espoliação de GSH. DSC não foi tóxica para células SH-SY5Y, porém protegeu contra os efeitos do CAT em baixas concentrações. DSC mostrou-se citotóxica para células de glioma (GL-15 e C6) e potencializou o CAT. Pré-tratamento por 30 minutos com DSC protegeu contra a ação do CAT após 72 horas. 8-MOP potencializou os efeitos do CAT, não revertendo seus efeitos na viabilidade celular, morfologia celular, condensação/fragmentação nuclear, e espoliação de GSH. Esses resultados caracterizam um modelo de citotoxicidade que pode ser aplicado no desenvolvimento de novos agentes farmacológicos. Estudos complementares são necessários para elucidar a proteção da DSC. / Catechols are benzene derivatives, which may exhibit cytotoxic activity that can be employed to develop new drugs. Plants are important sources of metabolites with pharmacological activities such as antioxidants, or cell growth inhibitors. In Brazil, cancer is the second leading cause of death, especially those derived from the nervous system, which increase the interest for new antineoplastic and neuroprotective drugs. The cytotoxic effects promoted by 1,2-dihydroxybenzene (CAT) and discretamine (DSC) in nervous system cells were characterized in vitro. The protective effects of DSC and 8-methoxypsoralen (8-MOP) against CAT-induced cytotoxicity were also evaluated. CAT and DSC EC50 was determined by using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). CAT auto-oxidation was investigated by spectrophotometry. Morphological changes and nuclear condensation/ fragmentation were evaluated by microscopy. The pattern of cell death was obtained by flow cytometry. Reduced glutathione (GSH) depletion was analyzed by using monochlorobimane. CAT induced a dose-dependent toxicity to SH-SY5Y and C6 cells, associated with reactive quinones formation. It also induced morphological changes, nuclear condensation/fragmentation, and apoptotic death not caused by GSH depletion. DSC was not toxic to SH-SY5Y cells, but protected against CAT effects at low concentrations. DSC was be cytotoxic to glioma cells (GL-15 and C6) and potentiated CAT effects. However, pretreatment for 30 minutes with DSC protected them against CAT after 72 hours. 8-MOP also potentiated CAT effects instead to protect cells. These results characterize an experimental model useful for studies searching new pharmacological agents. However, further studies are needed to elucidate the DSC protective effects.