Lichens are known producers of a variety of secondary metabolites. Fungal polyketides constitute a large family of these secondary metabolites that have a high degree of struc-tural diversity. Usnic acid is a lichen metabolite that has a broad range of biological ac-tivities. However the use of usnic acid in medical applications is limited due to the slow growth of the lichen in nature. In order to conduct in depth studies on compounds such as usnic acid it will be necessary to express their gene clusters in fast growing organisms. To achieve this goal, polyketide biosynthesis in the lichen fungi Cladonia uncialis has been investigated to identify the gene clusters that are responsible for secondary metabo-lites production. This thesis reports the de novo whole-genome sequencing of the lichen Cladonia un-cialis, in silico analysis of polyketide biosynthetic gene clusters, and putative identifica-tion and annotation of 56 different secondary metabolite gene clusters. The identified gene clusters include thirty two different type I polyketide synthase genes (non-reducing, partly reducing and highly reducing PKS genes) gene clusters besides two gene clusters of type III PKS gene, three independent, novel non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) biosynthetic gene clusters, as well as seven noncanonical NRPS genes that did not contain condensation (C) domains, three polyketide non-ribosomal (PKS-NRP) hy-brid gene clusters, one lanthipeptide synthase gene and six different terpene synthase gene clusters. Out of 32 candidate genes a single PKS has been identified as being re-sponsible for usnic acid biosynthesis. The structure of one of the lichen non-reducing PKS genes that is responsible for produc-tion of a halogenated lichen metabolite was also studied. Based on the biosynthetic opera-tions of the gene cluster as well as catalogued examples of halogenated polyketides iso-lated from lichen fungi to date, this study suggests that the gene cluster is a biosynthetic gene for an unidentified anthraquinone. The ketosynthase and the acyltransferase do-mains among two different non reducing PKS genes from Cladonia uncialis genome se-quence are also studied. The amino acid sequences of the domains are confirmed by us-ing mass spectrometry. Protein homology modeling was performed using the Swiss-Model server. The generated protein models were visualized using LASERGENE Pro-tean 3D molecular visualization system. / May 2015

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The usnic acid AU is a secondary metabolite of lichens described as a component with antibiotic, antifungal, antiviral, anti-inflamattory, antiproliferative and antiparasitic effects. Previous studies reported that this substance has anti Tripanosoma cruzi activity. Therefore, the aim of this study was evaluate the antioxidant potential on heart, intracellular calcium dynamic and cardiac contractility effects of the usnic acid. After exposure, in vitro, to the AU, experiments were performed to assess cell viability in human endothelial cells In isolated cardiomyocytes of rats were analyzed the intracellular calcium transient, cell contractility and the production of hydrogen peroxide (H2O2), superoxide and nitric oxide (NO). After oral treatment in C57Bl6J mice with AU, were performed lipid peroxidation tests, contractility experiments (Langendorff technique), western blot to nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) e NADPH expressions. Enzyme kinetics was used to measure total activity of superoxide dismutase and catalase. Oral treatment with AU was performed in infected mice with Trypanosoma cruzi. The results of cell viability showed that AU was not cytotoxic, after 24 hours exposure. The cellular contractility and intracellular calcium transient were not altered after exposure in vitro to AU. Moreover, usnic acid in isolated cardiomyocytes promoted decrease in the levels of H2O2 (CTR = 564.3  72, n=88 e AU = 514,3  60, n=87), superoxide and NO superóxido (citoplasm: CTR = 231,7  42 e AU = 144,2  56,3, n=67; ***P<0,001; nuclei: CTR = 675,8  101,5 e AU = 614,2  133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8  63,7, n=85 e AU = 514,3 72,3, n=94). Oral treatment had no effect on cardiac contractility of healthy and chagasic mice. However, treatment with AU showed antioxidant, inducing decrease in lipid peroxidation (heart: CTR 0,0438  0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9 and AU = 0,0180  0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=8. In liver CTR= 0,0145  0,021 nmol MDA min-1.mg protein1, n=8 and AU = 0,004  0,022 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9) and increased SOD activity in the heart and liver (CTR = 7,98  2,5 unity/g protein and AU =25, 02  4,5 unity/g protein), increased SOD and GPx expression and decreased eNOS and NADPH oxidase expression in a heart. The catalase activity showed decreased (CTR = 1,37  0,77 AE. min-1.mg protein-1 and AU = 0,45  0,22 AE. min-1.mg protein-1) and has no change in expression in a heart. The nNOS expression was not altered in a heart. In conclusion data showed suggest the AU was able to promote antioxidant effects in both experiments (in vitro and in vivo). In cardiac parameters, the AU have no changes in contract values (systolic and diastolic tension), hear rate and calcium mobility. Therefore, the AU have an antioxidant action in a heart and therapeutic potential in a Chagas disease. / O ácido úsnico (AU) é um metabólito secundário de liquens, descrito na literatura como um componente com efeito antibiótico, antifúngico, antiviral, anti-inflamatório, antiproliferativo e antiparasitário. Sendo essa substância apontada na literatura como um composto capaz de ter atividade anti Tripanosoma cruzi. Neste trabalho o AU foi utilizado com o objetivo de estudar o potencial efeito antioxidante bem como potenciais efeitos sobre a contratilidade cardíaca e dinâmica do cálcio intracelular. Para isso, após exposição, in vitro, ao AU, foram realizados experimentos para avaliar a viabilidade celular via MTT em células endoteliais humanas. Em células cardíacas isoladas foram analisados o transiente intracelular de cálcio, a contratilidade celular, a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion superóxido e óxido nítrico (NO). O efeito do tratamento oral com AU em camundongos C57Bl6J foi avaliado pela mensuração da peroxidação lipídica, experimentos para a análise da função cardíaca (utilizando-se a técnica de Langendorff), cinética enzimática a fim de avaliar a atividade total da superóxido dismutase (SOD) e catalase. Para avaliar a expressão das enzimas: óxido nítrico sintase (NOS), superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e NADPH oxidase foi utilizada a técnica de western blot. Para avaliar se o tratamento oral com AU alteraria os parâmetros da função cardíaca e o perfil redox em camundongos infectados com Tripanosoma cruzi, foram utilizadas a técnica de Langendorff, a mensuração da atividade total da SOD e a peroxidação lipídica. Os resultados de viabilidade celular mostraram que o AU não foi citotóxico nas concentrações estudadas (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM e 100 μM), após 24 horas de exposição. A contratilidade celular e o transiente celular de cálcio não foram alterados após exposição, in vitro, ao AU. Por outro lado, o AU em cardiomiócitos isolados promoveu a diminuição dos níveis de H2O2 (CTR = 564.3  72, n=88 e AU = 514,3  60, n=87), ânion superóxido (citoplasma: CTR = 231,7  42 e AU = 144,2  56,3, n=67; ***P<0,001; núcleo: CTR = 675,8  101,5 e AU = 614,2  133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8  63,7, n=85 e AU = 514,3 72,3, n=94). O tratamento oral não influenciou os parâmetros cardíacos avaliados dos camundongos hígidos e chagásicos. Entretanto, o tratamento com AU se mostrou antioxidante, induzindo a diminuição da peroxidação lipídica (No coração: CTR 0,0438  0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9 e AU = 0,0180  0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=8. e no fígado CTR= 0,0145  0,021 nmol MDA min-1.mg proteína1, n=8 e AU = 0,004  0,022 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9) e foi também detectado aumento da atividade da SOD (CTR = 7,98  2,5 unidades/g de proteína e AU =25, 02  4,5 unidades/g de proteína) aumento da expressão da SOD e GPx e diminuição da expressão da eNOS e NADPH oxidase no coração. A atividade da catalase (CTR = 1,37  0,77 AE. min-1.mg proteína-1 e AU = 0,45  0,22 AE. min-1.mg proteína-1) se mostrou diminuída e sua expressão não foi alterada no coração. A expressão da nNOS também não foi alterada no coração. Em conclusão nossos resultados sugerem que o AU é uma substância capaz de promover a redução do perfil oxidativo, tanto em células isoladas expostas a ele, in vitro, bem como, após o tratamento por via oral. E, do ponto de vista cardíaco, o AU não promove alterações nos parâmetros contráteis analisados (tensões sistólica e diastólica), bem como, na frequência cardíaca e na mobilidade do cálcio, o que indica que o essa substância pode ter potencial terapêutico como substância antioxidante no coração e potencial terapêutico na doença de Chagas.

Disruption of the skin generally leads to an increased fluid loss, infection, hypothermia, scarring, compromised immunity and change in body image; furthermore, large skin damage can cause mortality. Collagen-based film is a potentially useful biomaterial since it is the major constituent of the connective tissue and permit controlled drug release within target tissues. Usnic acid (UA), a dibenzofuran originally isolated from lichens, it can act as an anti-inflammatory, analgesic and antibacterial agent. The purpose of this study was to evaluate the physical-chemical properties and effect of collagen-based films containing usnic acid as a wound dressing for dermal burn healing. Collagen (CL) and usnic acid/collagen-based (UAC) films were characterized using differential thermal analysis (DTA), thermogravimetry (TG/DTG), infrared spectroscopy (FTIR), and scanning electron microscopy (SEM). Second-degree burn wounds of 1 cm2 were performed in the dorsum of forty-five Wistar rats, assigned into nine groups (n=5): COL animals treated with collagen-based films; PHO animals treated with collagen films containing empty liposomes; UAL animals treated with collagen-based films containing usnic acid incorporated into liposomes. After 7, 14 and 21 days the animals were euthanized. The specimens removed were formalin-fixed, and paraffin-embedded and histological sections were stained in HE and Sirius Red. In the spectrum of UAC, similar bands of the usnic acid are observed, indicating that the polymerization (film formation) did not affect the stability of the drug. Distinctly, DTA curve of UAC did not show an endothermic peak at 201ºC, indicative that the drug was incorporated into the polymeric system. These results were corroborated by the scanning electron microscopy (SEM). The TG/DTG curves of UAC presented a different thermal decomposition profile compared to the individual compounds and CL. These findings suggest the occurrence of molecular dispersion or solubilization of the drug in the collagen film. The specificity revealed that the excipients in the formulation did not interfere with the analysis. The linearity in the range of 2-10 μg/mL presented a correlation coefficient of 0.9994. The method showed excellent repeatability (R.S.D. < 1.0 %). The accuracy, revealed a mean percentage recovery of 100.43 %. The method was robust for the variation of temperature and solvent. The detection and quantization limits were found 0.109 and 0.364 μg/mL. The total rate recovery of the analyte film showed values between 100.4 and 83.2%. Biologycal assays showed on 7th day there was a moderate infiltration of neutrophils, in UAL, distributed throughout the burn wounds, whereas in COL and PHO, the severity of the reaction was slighter and still limited to the margins of the burn wounds. On the 14th day, the inflammatory reaction was less intense in UAL, with remarkable plasma cells infiltratation. On the 21st day, there was unequivocal reduction of the inflammation, which was predominantly composed of plasma cells in all groups, particularly in UAL. The use of collagen-based films containing usnic acid provided more rapid substitution of type-III for type-I collagen on the 14th day, and improved the collagenization density on the 21st day. It was concluded that the use of reconstituted bovine type-I collagen-based films containing usnic acid improved burn healing process in rats. / Há diversos produtos disponíveis para o tratamento de feridas provocadas principalmente por queimaduras tais como, agentes tópicos, soluções, enxertos, curativos interativos e filmes bioativos. O colágeno têm sido um dos materiais mais estudados, pois representa um importante constituinte protéico da pele. Os avanços científico-tecnológicos têm permitido o aprimoramento destes biomateriais através, por exemplo, da utilização de lipossomas, que possibilitam a incorporação de fármacos insolúveis para posterior liberação controlada diretamente na área lesada. O ácido úsnico (AU), um metabólito secundário de líquens, tem apresentado propriedades biológicas promissoras para o tratamento de feridas, como atividade antimicrobiana, analgésica e antiinflamatória. Nesta perspectiva, o objetivo desse estudo foi desenvolver, caracterizar físico-quimicamente e avaliar o efeito de filmes de colágeno contendo AU sobre o processo de reparo cicatricial em queimaduras de segundo grau. Para a caracterização físico-química dos filmes foi utilizada a análise térmica diferencial (DTA), termogravimetria (TG/DTG), espectroscopia no infravermelho (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após essas análises, foi desenvolvida a validação do método de quantificação de AU nos filmes por espectrofotometria no ultravioleta. Por fim, o ensaio biológico foi realizado com 54 ratos divididos em três grupos: tratados com filme de colágeno (COL); tratados com filmes de colágeno contendo fosfolipídio (LIP); tratados com filmes de colágeno contendo lipossoma/ácido úsnico (AUL). Após 7, 14 e 21 dias seis animais de cada grupo foram submetidos à eutanasia para análise histológica e imunohistoquímica. Os resultados de análise térmica mostraram através da curva DTA do filme UAL a ausência do pico endotérmico à 201ºC, característico da fusão do AU puro, indicando que o fármaco foi incorporado ao sistema polimérico. Estes resultados foram confirmados pelo MEV. As curvas TG/DTG dos filmes LIP e AUL apresentaram comportamento térmico diferente do AU livre. No espectro de IV do filme AUL foram observadas bandas similares ao AU livre, indicando que a incorporação não afetou a estabilidade do mesmo. A validação do método de doseamento apresentou um coeficiente de correlação de 0,9994 e excelente repetibilidade (C.V.< 1,0%). A exatidão apresentou média percentual de recuperação de 100,4%. Os valores dos limites de detecção e quantificação foram de 0,109 e 0,364 μg/mL, respectivamente. A taxa total de recuperação do analito nos filmes apresentou valores entre 100,4 e 82,3%. Os resultados do ensaio biológico aos 7 dias, mostraram que houve uma moderada infiltração neutrofílica, no filme AUL, distribuídos por toda a lesão, enquanto que no COL e LIP, a intensidade da reação inflamatória foi mais leve e limitada as margens da ferida. Aos 14 dias, a reação inflamatória foi reduzida em todos os grupos, no entanto, a reação de granulação foi mais desenvolvida no AUL. Aos 21 dias, observou a presença ainda expressiva de linfócitos nos grupos COL e LIP, enquanto que no AUL houve o predomínio de células plasmáticas. O uso dos filmes de colágeno contendo lipossomas/ácido úsnico (AUL), atuou desde a substituição mais rápida das fibras de colágeno tipo III para tipo I, até a melhora na densidade da colagenização. Conclui-se assim, que os filmes de colágeno contendo lipossomas/ácido úsnico promovem a aceleração dos eventos biológicos associados à dinâmica do reparo cicatricial.

Chemical eye burns are among the most frequently reported causes of ocular damage. These lesions may range from mild conjunctival or corneal unilateral epithelial damage to damage to the conjunctiva and cornea with risk of vision loss. Knowing the importance of new treatment proposals for this affection, the objective was to investigate the potential of membranes based on gelatin / usnic acid / liposomes to promote the healing of corneal burns using animal model. Analysis of the biological activity of gelatin membranes containing usnic acid/liposomes was performed by means of the chorioallantoic membrane (CAM) assay where Gallus domesticus and Ross lineage eggs. For evaluation of ocular tolerance of the gelatin membrane, the Chicken Eggs Test - Coronary Membrane Test (HET-CAM). For the study in animals, 13 female New Zealand rabbits, aged 3 months and weighing 2 kg, were used. The chemical lesion on the corneas of the animals was performed by exposure to absolute ethanol for 30 seconds. The animals were divided into two study groups: group with lesion treated with gelatin membrane containing usnic acid / liposomes (n = 7) and group with lesion treated with gelatin membrane without acidic / liposomes (n = 6). To evaluate the healing, the injured area was demarcated with 1 (one) drop of eye drops fluorescein, later realized the registry. In order to identify dead cells in the cornea, 1 drop of Bengal Rose eye drops (1.0%) was instilled in the eye to be evaluated, after being topically anesthetized, after 1 minute the animals were exposed to white light and then performed the records. Hematoxylin-eosin staining for standard histopathological evaluation and Gomori trichrome stain for evaluation of collagen fibers were used for histological evaluation. It has been observed that the membrane of gelatin containing usnic acid/liposomes promotes neovascularization without promoting toxicity and is biocompatible with the ocular system by CAM and HET-CAM methods. In addition to not promoting ocular irritability, the membranes promoted improved healing of alkaline corneal chemical burn, as well as reduction in the number of dead cells and conjunctival irritability in the treated group when compared to the control group. Moreover, in animals treated with gelatin membrane containing single acid, there was absence of granulation tissue, in addition to organized collagen bundles, a different result from that found in animals treated with the membrane without single acid. Therefore, this work showed that the membrane of gelatin containing usnic acid promotes corneal healing caused by alkaline chemical burn efficiently in rabbits, accompanied by a reduction in the presence of dead cells in the injured cornea and improvement of conjunctival irritability. / As queimaduras oculares químicas estão entre as causas mais frequentemente relatadas de lesões oculares. Essas lesões podem variar desde dano epitelial unilateral leve conjuntival ou corneano até danos à conjuntiva e córnea com risco de perda da visão. Sabendo da importância de novas propostas de tratamento para tal afecção, objetivou-se investigar o potencial de membranas à base de gelatina contendo ácido úsnico carreado em lipossomas em promover cicatrização de queimaduras da córnea utilizando modelo animal. A análise da atividade biológica das membranas de gelatina contendo ácido úsnico foi realizada por meio do ensaio da membrana corioalantóica (MCA) na qual ovos de galinha da espécie Gallus domesticus e da linhagem Ross. Para avaliação de tolerabilidade ocular da membrana de gelatina foi realizado o Teste de Ovos de Galinha - Teste de Membrana Corioalantóica (HET-CAM). Para a realização do estudo em animais, foram utilizadas 13 coelhas da espécie New Zealand, com idade de 3 meses e pesando 2 kg. A lesão química na córnea dos animais foi realizada por exposição ao etanol absoluto durante 30 segundos. Os animais foram divididos em dois grupos do estudo: grupo com lesão tratado com membrana de gelatina contendo ácido úsnico carreado em lipossomas (n=7) e grupo com lesão tratado com membrana de gelatina sem ácido úsnico (n=6). Para avaliação da cicatrização a área lesada foi demarcada com 1 (uma) gota de colírio fluoresceína e exposição à luz de cobalto e então realizado o registro. Afim de identificar células mortas na córnea, 1 (uma) gota de colírio Rosa Bengala (1,0%) foi instilada no olho a ser avaliado, após ser anestesiado topicamente, após 1 minuto os animais foram expostos à luz branca e então realizados os registros. Para avaliação histológica foi utilizado coloração hematoxilina-eosina para avaliação histopatológica padrão e corante tricrômico de Gomori para avaliação de fibras de colágeno. Observou-se que a membrana de gelatina contendo ácido úsnico carreado em lipossomas promove neovascularização sem causar toxicidade e são biocompatíveis com o sistema ocular pelos métodos da MCA e HET-CAM. Além de não promover irritabilidade ocular, as membranas promoveram melhor cicatrização de queimadura química alcalina corneana, bem como uma redução do número de células mortas e irritabilidade conjuntival no grupo tratado quando comparado ao grupo controle. Além disso, nos animais tratados com membrana de gelatina contendo ácido úsnico foi observado ausencia de tecido de granulação, além de feixes de colágeno organizados, resultado diferente do encontrado nos animais tratados com a membrana sem ácido úsnico. Sendo assim este trabalho mostrou que a membrana de gelatina contendo ácido único carreado em lipossoma promove cicatrização corneana provocada por queimadura química alcalina de maneira eficiente em coelhos, acompanhado de uma redução na presença de células mortas na córnea lesada e da melhora da irritabilidade conjuntival. / Aracaju

Burns provoke a metabolic impairment with systemic repercussions, leading to need for products that act directly on burns healing, such as usnic acid, observed in previous studies in rodent and swine models. For this, gelatine has been widely used in biomaterials, allowing drugs incorporation. In this perspective, the objective of this research was to evaluate the effect of gelatine membranes (P1QLS08) containing usnic acid incorporated in liposomes on the healing process of second degree burns in humans. It is a Pilot Clinical Trial, controlled and randomized, developed at Burns Treatment Unit of Sergipe Emergency Hospital. Thirty individuals were studied, the patient being his own control. The areas for analysis were randomly selected, comprising a test region (P1QLS08 membrane) and a control region (treated with silver sulfadiazine - SDZ, reference product). The patients were submitted to anamnesis and were followed for 7, 14 and 21 days after administration of the products. At determined times, standardized photographic records were made of P1QLS08 and SDZ areas, as well as wound secretion collection through the swab. Then, a microbiological analysis was performed, a macroscopic description of each image, as well as the analysis by Image J®, in order to obtain a quantitative evaluation. It was observed Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumanni prevalence, followed by Staphylococcus aureus in both groups. A better clinical aspect of the lesions was observed, with a pattern of area reduction visibly better in P1QLS08 than SDZ, besides lower relief, nearer to normal vascularization, less pigmentation and flexibility more compatible with physiological condition in P1QLS08 group when compared to SDZ group (p <0.05), effectively contributing to development and use of a new product for clinical importance in biological events acceleration associated with the dynamic of cicatricial repair in burn patients. This thesis also had two systematic reviews, one for patents and the other for clinical evaluation instruments in burn patients. / As lesões dérmicas por queimaduras provocam resposta metabólica com repercussões sistêmicas, levando à necessidade pela busca por produtos que atuem diretamente sobre a cicatrização de queimaduras, a exemplo do ácido úsnico, observado em estudos anteriores realizados em modelos de roedores e suínos. Para isso, a gelatina tem sido amplamente utilizada em biomateriais, permitindo a incorporação de fármacos. Nessa perspectiva, o objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito de membranas (P1QLS08) de gelatina contendo ácido úsnico incorporado em lipossomas sobre o processo de cicatrização de queimaduras de segundo grau em humanos. Trata-se de um Ensaio Clínico Piloto, controlado e randomizado, desenvolvido na Unidade de Tratamento de Queimados (UTQ) do Hospital de Urgência de Sergipe (HUSE). Foram estudados 30 indivíduos, sendo o paciente seu próprio controle. As regiões para análise foram selecionadas de forma aleatória, compreendendo uma área denominada teste (administração da membrana - P1QLS08) e uma área denominada controle (tratada com sulfadiazina de prata - SDZ, produto de referência). Os pacientes foram submetidos à anamnese e acompanhados por 7, 14 e 21 dias após a administração dos produtos. Nos tempos determinados, foram feitos registros fotográficos padronizados tanto da área P1QLS08 quanto da SDZ, assim como foi realizada a coleta de secreção da ferida através do swab. Em seguida, procedeu-se à análise microbiológica, descrição macroscópica de cada imagem, bem como à análise pelo Image J®, a fim de se obter uma avaliação quantitativa. Observou-se predomínio de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni, seguido de Staphylococcus aureus em ambas as áreas. Foi verificado melhor aspecto clínico das lesões, com padrão de redução de sua área visivelmente melhor em P1QLS08 que em SDZ, além de menor relevo, vascularização mais próxima do normal, menos pigmentação e flexibilidade mais compatível com a condição fisiológica na área P1QLS08 quando comparada à área SDZ (p<0,05), contribuindo efetivamente para o desenvolvimento e utilização de um novo produto de importância clínica na aceleração dos eventos biológicos associados à dinâmica do reparo cicatricial em pacientes queimados. Esta tese também contou com duas revisões sistemáticas, sendo uma voltada para patentes e outra para instrumentos de avaliação clínica em pacientes queimados.

Burns provoke a metabolic impairment with systemic repercussions, leading to need for products that act directly on burns healing, such as usnic acid, observed in previous studies in rodent and swine models. For this, gelatine has been widely used in biomaterials, allowing drugs incorporation. In this perspective, the objective of this research was to evaluate the effect of gelatine membranes (P1QLS08) containing usnic acid incorporated in liposomes on the healing process of second degree burns in humans. It is a Pilot Clinical Trial, controlled and randomized, developed at Burns Treatment Unit of Sergipe Emergency Hospital. Thirty individuals were studied, the patient being his own control. The areas for analysis were randomly selected, comprising a test region (P1QLS08 membrane) and a control region (treated with silver sulfadiazine - SDZ, reference product). The patients were submitted to anamnesis and were followed for 7, 14 and 21 days after administration of the products. At determined times, standardized photographic records were made of P1QLS08 and SDZ areas, as well as wound secretion collection through the swab. Then, a microbiological analysis was performed, a macroscopic description of each image, as well as the analysis by Image J®, in order to obtain a quantitative evaluation. It was observed Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumanni prevalence, followed by Staphylococcus aureus in both groups. A better clinical aspect of the lesions was observed, with a pattern of area reduction visibly better in P1QLS08 than SDZ, besides lower relief, nearer to normal vascularization, less pigmentation and flexibility more compatible with physiological condition in P1QLS08 group when compared to SDZ group (p <0.05), effectively contributing to development and use of a new product for clinical importance in biological events acceleration associated with the dynamic of cicatricial repair in burn patients. This thesis also had two systematic reviews, one for patents and the other for clinical evaluation instruments in burn patients. / As lesões dérmicas por queimaduras provocam resposta metabólica com repercussões sistêmicas, levando à necessidade pela busca por produtos que atuem diretamente sobre a cicatrização de queimaduras, a exemplo do ácido úsnico, observado em estudos anteriores realizados em modelos de roedores e suínos. Para isso, a gelatina tem sido amplamente utilizada em biomateriais, permitindo a incorporação de fármacos. Nessa perspectiva, o objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito de membranas (P1QLS08) de gelatina contendo ácido úsnico incorporado em lipossomas sobre o processo de cicatrização de queimaduras de segundo grau em humanos. Trata-se de um Ensaio Clínico Piloto, controlado e randomizado, desenvolvido na Unidade de Tratamento de Queimados (UTQ) do Hospital de Urgência de Sergipe (HUSE). Foram estudados 30 indivíduos, sendo o paciente seu próprio controle. As regiões para análise foram selecionadas de forma aleatória, compreendendo uma área denominada teste (administração da membrana - P1QLS08) e uma área denominada controle (tratada com sulfadiazina de prata - SDZ, produto de referência). Os pacientes foram submetidos à anamnese e acompanhados por 7, 14 e 21 dias após a administração dos produtos. Nos tempos determinados, foram feitos registros fotográficos padronizados tanto da área P1QLS08 quanto da SDZ, assim como foi realizada a coleta de secreção da ferida através do swab. Em seguida, procedeu-se à análise microbiológica, descrição macroscópica de cada imagem, bem como à análise pelo Image J®, a fim de se obter uma avaliação quantitativa. Observou-se predomínio de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni, seguido de Staphylococcus aureus em ambas as áreas. Foi verificado melhor aspecto clínico das lesões, com padrão de redução de sua área visivelmente melhor em P1QLS08 que em SDZ, além de menor relevo, vascularização mais próxima do normal, menos pigmentação e flexibilidade mais compatível com a condição fisiológica na área P1QLS08 quando comparada à área SDZ (p<0,05), contribuindo efetivamente para o desenvolvimento e utilização de um novo produto de importância clínica na aceleração dos eventos biológicos associados à dinâmica do reparo cicatricial em pacientes queimados. Esta tese também contou com duas revisões sistemáticas, sendo uma voltada para patentes e outra para instrumentos de avaliação clínica em pacientes queimados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Burns are injuries in the skin that are usually caused by thermal accidents and the treatment of this disease is considered a great challenge due the amount of complications that are caused. Therefore, is necessary to look for alternatives that optimize the treatment of injuries caused by burns such as the use of bioactive membranes. Usnic acid (UA) is a substance that has potential for the burns treatment. However, this compound presents some unfavorable physical-chemical characteristics, such as low solubility in water. One way to stabilize this situation is through the use of AU encapsulated in liposome and combined with a gelatin membrane. Therefore, the purpose of this work was to prepare and characterize gelatin membranes containing AU incorporated in liposomes to the burns treatment. The membranes were prepared according with the casting method and the liposomes by the solvent rotavaporation technique. After obtaining, the swelling capacity of the membranes was evaluated. The analytical method was developed and validated by high performance liquid chromatography (HPLC), which was used to determine the content and encapsulation efficiency of UA in the membranes. In vitro release studies, permeation and adhesion of UA to skin layers were performed by Franz cells, and after, the stability and photostability of formulation was evaluated. Macroscopically, gelatin membranes showed yellowish color, smooth surface and swelling capacity in phosphate buffer (pH 7.4) and saline solution. The method developed by HPLC was effective to the identification and quantification of UA and all parameters used for validation showed suitable results according with the current legislation (RDC 899 – ANVISA, 2003). The UA content in the membranes was 172.07 ± 0.27 μg·cm-2, obtaining encapsulation efficiency of 93.75%. The in vitro release experiments demonstrated that the gelatin membranes containing UA in liposomes showed a controlled release profile, releasing 98.15% (41.37 μg·cm-2) of the UA in 24 hours of analysis. The UA has the ability to penetrate and permeate in the skin layers because it was quantified in the epidermis (3.54 ± 0.79 μg·cm-2) and dermis (13.64 ± 0.17 μg·cm-2) respectively, as well as, it has adhesion capacity, because it remained adhered to the skin after washing the formulation with saline solution (epidermis: 2.32 ± 0.95 μg·cm-2; dermis: 8.87 ± 0.56 μg·cm-2). The membranes showed stability to thermal variations and light exposure, because they didn’t show changes in the macroscopic characteristics and /or significant decrease in the UA content. According with the results obtained, we can conclude that gelatin membranes containing AU in liposomes are a promising formulation for the burns treatment, because they have the capacity to release control of UA and showed adequate stability, besides the fact that AU has the ability to penetrate, permeate and adhere in the skin layers. / As queimaduras são lesões na pele que geralmente são causadas por acidentes térmicos e o tratamento dessa enfermidade é considerado um grande desafio, devido a quantidade de complicações que podem causar. Dessa forma, é necessário buscar alternativas que otimizem o tratamento das lesões causadas por queimaduras, como por exemplo, o uso de membranas bioativas. O ácido úsnico (AU) é uma substância que apresenta potencial para o tratamento de queimaduras. No entanto, esse composto apresenta algumas características físico-químicas desfavoráveis, como a baixa solubilidade em água. Uma das maneiras de estabilizar essa situação é através da utilização do AU encapsulado em lipossoma, combinado com uma membrana de gelatina. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi preparar e caracterizar membranas de gelatina contendo AU incorporado em lipossomas para o tratamento de queimaduras. As membranas foram preparadas de acordo com método de casting e os lipossomas pela técnica de rotaevaporação do solvente. Após a obtenção, a capacidade de intumescimento das membranas foi avaliada. Um método analítico foi desenvolvido e validado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), o qual, foi utilizado para determinar o teor e a eficiência de encapsulação do AU nas membranas. Estudos de liberação in vitro, permeação e adesão do AU nas camadas da pele foram realizados através de células de Franz, seguidos da avaliação da estabilidade e fotoestabilidade da formulação. Macroscopicamente, as membranas de gelatina apresentaram coloração levemente amarelada, superfície lisa e capacidade de intumescimento em tampão fosfato (pH 7,4) e soro fisiológico. O método desenvolvido por CLAE, mostrou-se eficaz para identificação e quantificação do AU e todos os parâmetros utilizados para a validação apresentaram resultados adequados de acordo com a legislação vigente (RE 899 – ANVISA, 2003). O teor de AU nas membranas foi de 172,07 ± 0,27 μg·cm-2, obtendo eficiência de encapsulação de 93,75%. Os experimentos de liberação in vitro demonstraram que as membranas de gelatina contendo AU na forma lipossomal apresentaram um perfil de liberação controlado, liberando 98,15% (41,37 μg·cm-2) do AU em 24 horas de análise. O AU apresenta capacidade de penetrar e permear nas camadas da pele, pois, foi quantificado na epiderme (3,54 ± 0,79 μg·cm-2) e na derme (13,64 ± 0,17 μg·cm-2), respectivamente, bem como, possui capacidade de adesão, uma vez que, permaneceram aderidos na pele após a lavagem da formulação com solução salina (epiderme: 2,32 ± 0,95 μg·cm-2; derme: 8,87 ± 0,56 μg·cm-2). As membranas apresentaram estabilidade à variações térmicas e a exposição à luz, pois não demonstraram alterações nas características macroscópicas e/ou diminuição significativa do teor do AU. De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que as membranas de gelatina contendo AU na forma lipossomal é uma formulação promissora para o tratamento de queimaduras, pois apresentam capacidade de controlar a liberação do AU e apresentam estabilidade adequada, além do fato, que o AU apresenta capacidade de penetrar, permear e de aderir-se nas camadas da pele.

The search for products to treat wounds caused by burns is mainly increasing. Several products are developed and marketed with the purpose of act accelerating the scar dynamics, such as topical agents, solutions, grafts, and interactive dressings and biofilms. The gelatin has been one of the most studied materials for this purpose because it shows cellular architecture suitable to act as support in the construction of new tissues as well, allows the incorporation of active substances in its protein structure. The usnic acid (UA), a secondary metabolite of lichens, has shown promising biological properties for the treatment of wounds, such as antimicrobial and anti-inflammatory activities. However, it is a metabolite waterinsoluble and for its incorporation into gelatin membranes, it is necessary the use of liposomes, which enable the incorporation of insoluble drugs for subsequent controlled release. In this perspective, the aim of this study was to evaluate the effect of gelatin membranes containing usnic acid/liposome about scar repair of burns in pigs. The biological assay was realized with nine (09) male pigs, 03 animals in each group forming three groups which were sacrificed 8, 18 and 30 days after the induction of the burn for removal of specimens and development of histological slides. Three burns were made on the dorsum of each animal, which were coated with three products: silver sulfadiazine ointment (group SDZ); Duoderme ® (group GDU) and gelatin films containing usnic acid/liposome (group UAL). The results of the macroscopic examination showed progressive reduction of the injured area over time for the three experimental groups, furthermore, there was no clinical signs of secondary infections. In the analysis of the average rate of contraction of wounds no statistically significant difference between the rates of decline observed for animals in any group and time periods analyzed (p> 0,05). In the microscopy in eight days, all three groups showed hydropic degeneration of the epithelium, with intense neutrophilic infiltration. The reaction of granulation observed in the central region of the injured group SDZ was more immature than in groups GDU and UAL. In 18 days, the neo-formation epidermal, although partial in the three groups showed quite incipient in SDZ compared to groups GDU and UAL. The inflammatory reaction was reduced in all groups, but the reaction of granulation was more immature in group SDZ, in relation to the reaction of exuberant granulation, richly with cells evidenced in groups GDU and UAL. In 30 days, the reaction of granulation, showed to be more extensive in group SDZ, opposing the restricted reaction of granulation observed in groups GDU and UAL, present only in the region below the epithelium. In group SDZ also observed the presence of inflammatory infiltrate involved in the reaction of granulation. In the analysis of collagen by picrosirius there was a gradual substitution of the fibers of collagen type III to type I, and the improvement in the density of collagen in all groups, but in UAL compared to groups and SDZ GDU it was observed a faster substitution of collagen fibers, as well as improvement in the density of collagen. Therefore it is concluded that the UAL group promoted the development and maturation of granulation reaction, scar repair comparable to duoDermeÒ and better than the sulfadiazine silver ointment, as well as increase of collagen deposition compared to the other two groups. / A busca por produtos para o tratamento de feridas provocadas principalmente por queimaduras é cada vez maior. Diversos produtos são desenvolvidos e comercializados com finalidade de atuarem acelerando a dinâmica cicatricial, tais como, agentes tópicos, soluções, enxertos, curativos interativos e biofilmes. A gelatina têm sido um dos materiais mais estudados para esse fim, visto que apresenta arquitetura celular adequada para atuar como suporte na construção de novos tecidos, bem como, possibilita a incorporação de substâncias ativas em sua estrutura proteica. O ácido úsnico (AU), um metabólito secundário de líquens, tem apresentado propriedades biológicas promissoras para o tratamento de feridas, como atividade antimicrobiana e anti-inflamatória. Porém é um metabólito insolúvel em água e para sua incorporação às membranas de gelatina se faz necessário o uso de lipossomas, que possibilitam a incorporação de fármacos insolúveis para posterior liberação controlada. Nesta perspectiva, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de membranas de gelatina contendo AU/lipossomas sobre o reparo cicatricial em queimaduras em suínos. O ensaio biológico foi realizado com nove (09) suínos machos, 03 animais em cada grupo, formando três grupos, que foram sacrificados 8, 18 e 30 dias após a indução da queimadura, para remoção dos espécimes e preparo das lâminas histológicas. Foram realizadas três queimaduras no dorso de cada animal, as quais foram recobertas com três produtos: pomada de sulfadiazina de prata (grupo SDZ); Duoderme® (grupo GDU) e filmes de gelatina contendo lipossoma/ácido úsnico (grupo UAL). Os resultados da macroscopia demonstraram redução progressiva da área lesada ao longo do tempo experimental para os três grupos estudados, além disso, não foi observado sinais clínicos de infecção secundária. Na análise do índice médio da retração das feridas não houve diferença estatisticamente significativa entre os índices de retração obtidos nos animais em nenhum grupo e tempos analisados (p>0,05). Na microscopia, em 8 dias, os três grupos mostraram degeneração hidrópica do epitélio, com intensa infiltração neutrofílica. A reação de granulação observada na região central das feridas do grupo SDZ foi mais imatura em relação aos grupos GDU e UAL. Em 18 dias, a neoformação epidérmica, apesar de parcial nos três grupos, se mostrou bastante incipiente no SDZ quando comparada aos grupos GDU e UAL. A reação inflamatória foi reduzida em todos os grupos, entretanto a reação de granulação mostrou-se mais imatura no grupo SDZ, em relação à reação de granulação exuberante, ricamente celularizada, evidenciada nos grupos GDU e UAL. Em 30 dias, a reação de granulação, demostrou estar mais extensa no grupo SDZ, contrapondo-se a restrita reação de granulação observada nos grupos GDU e UAL, presente apenas na região abaixo do epitélio. No grupo SDZ, ainda observou-se presença de infiltrado inflamatório envolvido na reação de granulação. Na análise de colágeno por picrossírius verificou-se uma gradativa substituição das fibras de colágeno tipo III para tipo I, bem como, melhora da densidade de colagenização em todos os grupos, porém no UAL, quando comparado aos grupos SDZ e GDU, observou a substituição mais rápida das fibras de colágeno, assim como melhora na densidade da colagenização. Conclui-se assim, que o grupo UAL promoveu o desenvolvimento e maturação da reação de granulação, do reparo cicatricial comparáveis ao duoderme e melhores que a pomada de sualfadizina de prata, bem como maior incremento da deposição colagênica em relação aos dois outros grupos.

There is interest in the pharmaceutical area in the use of sponges, produced with biopolymers, as matrices for the controlled release of drugs. The biopolymers for pharmaceutical applications must have physicochemical and appropriate mechanical and biocompatibility. Alginate is a biopolymer, obtained from the alginic acid, which has been largely studied due to its ability to incorporate and promote the controlled release of drugs. Gelatin is a protein obtained by hydrolysis of collagen and has been used in obtaining produce hydrogels and sponges with therapeutic properties. Usnic acid (UA) is the most abundant metabolite of the lichen Cladonia substellata has proven antimicrobial, anti-inflammatory, analgesic and healing activities. In this context, the aim of this work was to physicochemical characterization and evaluate the effect of alginate-gelatin sponges, containing usnic acid on wound healing in rats. The sponges were prepared from gelatin, alginate and incorporated with usnic acid in concentrations of 1 and 5% (m/v) and freeze dried. For material characterization were used thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TG/DTG), differential scanning calorimetry (DSC), infrared absorption spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM) and mechanical properties tests. The biological assay was performed with 36 rats divided into three groups: without treatment (CTR); treated with inert sponge (ALG/GEL); and treated with the sponge containing usnic acid 5% (AU 5%). After 7 and 14 days, six animals from each group were submitted to euthanasia for histological analysis. The average content of usnic acid was 60.03 and 97.38% for sponges in 1 and 5%, respectively. DSC analysis results show the absence of endothermic peak of UA pure, indicating that the drug was incorporated into the polymer system. TG/DTG curves corroborate with the DSC data and showed that the incorporation of usnic acid has not changed the thermal behavior of sponges. The FTIR spectra of sponges showed a sum corresponding to the event of usnic acid, alginate and gelatin bands, indicating the presence of these compounds in the system. The analysis by SEM showed that the incorporation of different concentrations of UA, in sponges promotes changes in microscopic structure, resulting in different mechanical behaviors. The biological assays in 7 days, showed an inflammatory reaction in the marginal and central portions of the wound, but ALG/ GEL and AU 5% groups, promoted an acceleration in the formation of granulation tissue. In 14 days, in the AU 5% group, was a clear reduction of the inflammatory component even in the central portion of the wound. Additionally, there was a marked reduction in vascular component, when compared to the CTR group with a homogeneous pattern of colagenization type III in the entire length of the scar. In conclusion, the incorporation of usnic acid has not changed the thermal stability of sponges and, in addition, the use of alginate-gelatin sponge and promotes the wound healing and the incorporation of the drug eases wound contraction and a homogeneous deposition of collagen, avoiding the formation of hipertrophic scars. / Existe um interesse na área farmacêutica no uso de esponjas, produzidas com biopolímeros, como matrizes para a liberação controlada de fármacos. Os biopolímeros para aplicações farmacêuticas devem possuir propriedades físico-químicas e mecânicas adequadas, além de serem biocompatíveis. O alginato é um biopolímero, obtido a partir do ácido algínico, que tem sido largamente estudado devido a sua capacidade de incorporar compostos e promover a liberação controlada de fármacos. A gelatina é uma proteína obtida pela hidrólise do colágeno e vem sendo empregada na obtenção de hidrogéis e esponjas com propriedades terapêuticas. O ácido úsnico (AU) é o metabólito mais abundante do líquen Cladonia substellata e possui comprovada atividade antimicrobiana, anti-inflamatória, analgésica e cicatrizante. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar físico-quimicamente e avaliar o efeito de esponjas de alginato-gelatina, contendo ácido úsnico sob a cicatrização em ratos. As esponjas foram preparadas a partir do alginato e gelatina, incorporadas com ácido úsnico, nas concentrações de 1 e 5% (m/v) e liofilizadas. Para caracterização do material foram utilizadas a análise termogravimétrica/termogravimétrica derivada (TG/DTG), a calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e testes de propriedades mecânicas. O ensaio biológico foi realizado com 36 ratos divididos em três grupos: sem tratamento (CTR); tratados com esponja inerte (ALG/GEL); e tratados com esponja contendo ácido úsnico a 5% (AU 5%). Após 7 e 14 dias, seis animais de cada grupo foram eutanasiados para análise histológica. O teor médio de ácido úsnico foi de 60,03 e 97,38% nas esponjas de 1 e 5%, respectivamente. Os resultados da análise de DSC mostram a ausência do pico endotérmico referente ao AU puro, indicando que o fármaco foi incorporado ao sistema polimérico. As curvas TG/DTG corroboram com os dados do DSC e mostraram que a incorporação do ácido úsnico não alterou o perfil geral da decomposição térmica das esponjas. Os espectros FTIR das esponjas mostraram um somatório de eventos correspondentes às bandas do ácido úsnico, alginato e gelatina, indicando a presença dos referidos compostos no sistema. A análise por MEV mostrou, que a incorporação de diferentes concentrações de AU, nas esponjas promove alterações na estrutura microscópica, resultando em diferentes comportamentos mecânicos. Os ensaios biológicos em 7 dias, mostram uma reação inflamatória nas porções centrais e marginais da ferida, porém os grupos ALG/GEL e AU 5%, promoveram uma aceleração na formação de tecido de granulação mais maduro. Em 14 dias, no grupo AU 5%, foi nítida a redução do componente inflamatório mesmo na porção central da ferida. Adicionalmente, observou-se uma marcante redução na rede vascular, quando comparado ao grupo CTR, acompanhada de um padrão homogêneo de colagenização tipo III em toda a extensão da cicatriz. Em conclusão, a incorporação do ácido úsnico não alterou a estabilidade térmica das esponjas e, além disso, o uso de esponja de alginato e gelatina favorece a cicatrização de feridas e a incorporação do fármaco facilita a contração da ferida e uma deposição homogênea de colágeno, evitando a formação de cicatrizes antiestéticas.

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These aspects have stimulated the search for new leishmanicide agents, like the isolation and identification of natural compounds which could provide new therapeutic models for the treatment of leishmaniases. It was aimed in the present work a comparative evaluation of potentially antileishmania natural isolate compounds and their action on promastigote and amastigote forms of Leishmania chagasi by observing the cycle of this parasite in vitro. Assays were carried out with usnic acid, coumarin, quercetin, and reserpine which showed to have significant antileishmanial activity on promastigote forms of Leishmania chagasi, presenting IC50 equal to 0.0417; 1.07; 0.271 and 1.7 mM, respectively. It was possible in our experimental conditions of standardized cultivation of parasites, to establish their life cycle in vitro, by observing their metamorphosis from promastigote to mastigote. The in vitro life cycle was characterized by parasite cultivations with establishment of: 1) lag (initial), log or exponential and stationary stages of promastigotes; 2) transformation of promastigotes to intracellular amastigotes by infection of murine macrophages; this step favoured the promastigotes infectivity; and 3) amastigote isolation and transformation to promastigotes completing the cycle. Furthermore, it was also possible to establish the in vitro transformation of promastigotes in axenic amastigotes of Leishmania chagasi and its use for the evaluation of antileishmanial activity. In this case, the natural compound usnic acid exhibited antileishmanial activity against axenic amastigote forms with IC50 of 1,16 mM. It was not observed any similarity of IC50 on antileishmanial activity of usnic acid and pentamidine between the axenic amastigote and promastigote forms. This demonstrates that it is important to characterize the action of compound on each life form of the parasites. It is concluded that all assayed compounds carried out in this work had antileishmanial activity on promastigote forms, mainly, and the effect of concentration was different between promastigote, of lower IC50 values, and axenic amastigotes forms, of greater IC50 values. / As leishmanioses constituem-se por um complexo de doenças infectoparasitárias, causadas por parasitas do gênero Leishmania, e apresentam um espectro de sintomas variando de simples lesões cutâneas de cicatrização espontânea a lesões viscerais letais. A leishmaniose visceral, causada pela espécie Leishmania chagasi, no Brasil infecta cerca de duas mil pessoas por ano, sendo cerca de 90% dos casos no Nordeste. Os tratamentos atuais são baseados em compostos antimôniais pentavalentes, ou na utilização de outras drogas como a anfotericina B e a pentamidina. A toxicidade desses agentes, com efeitos colaterais graves, o alto custo dos tratamentos, as dificuldades de administração e o surgimento de resistência são grandes desvantagens, tornando essencial a busca por novos agentes leishmanicidas, como a identificação de compostos naturais isolados, que podem fornecer novos modelos terapêuticos no tratamento das leishmanioses. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar comparativamente o potencial antileishmania de compostos naturais isolados sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania chagasi, estabelecendo o ciclo do parasito in vitro. Os compostos naturais ensaiados, ácido úsnico, cumarina, quercetina e reserpina apresentaram significativa atividade antileishmania sobre as formas promastigotas de Leishmania chagasi, com IC50 igual a 0,0417; 1,07; 0,271 e 1,7 mM respectivamente. Nas condições de cultivo padronizadas no presente estudo foi possível estabelecer o ciclo de vida in vitro dos parasitos, com passagem destes pelas duas principais formas de vida: promastigotas e amastigotas. O ciclo in vitro foi caracterizado pelo cultivo das promastigotas com estabelecimento: 1) das fases: lag (inicial), log ou exponencial e estacionária dos parasitos; 2) transformação das formas promastigotas em amastigotas intracelulares, pela infecção de macrófagos murinos, o que favoreceu a infectividade das promastigotas; e 3) pelo isolamento das formas amastigotas e transformação destas em promastigotas novamente, completando o ciclo. Além disto, foi também possível estabelecer a transformação in vitro das promastigotas em amastigotas axênicas de L. chagasi e o cultivo das formas axênicas para ensaios de ação antileishmania sobre essa forma. Nesse caso, o composto natural isolado ácido úsnico apresentou atividade antileishmania sobre amastigotas axênicas de L. chagasi, com IC50 igual a 1,16 mM. Não foi observada similaridade da IC50 na atividade antileishmania do ácido úsnico e da pentamidina entre as formas amastigotas axênicas e promastigotas, o que demonstra a importância de caracterizar a ação dos compostos sobre cada forma de vida dos parasitos. Conclui-se que os compostos isolados têm atividade antileishmania sobre as formas promastigotas e o ácido úsnico sobre as formas amastigotas axênicas de L. chagasi.