L’épissage alternatif et l’export nucléaire de l’ARN pré-génomique 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) ont fait l’objet de peu d’études. Quatre isoformes épissées de l’ARN 35S ont déjà été décrites. Nos résultats montrent que l’épissage alternatif est plus complexe vu que plus d’une douzaine d’isoformes d’ARN 35S sont générées par ce mécanisme. Ce processus ne semble pas avoir pour fonction d’augmenter la complexité du protéome viral. Le rôle de l’épissage alternatif apparait encore difficile à appréhender puisque l’inactivation des sites d’épissage est systématiquement contrecarrée par l’utilisation de sites cryptiques. Pour maintenir l’intégrité du génome viral, des molécules d’ARN 35S préservées de l’épissage sont exportées vers le cytoplasme. L’essentiel de nos travaux sur ce sujet a porté sur le développement d’approches destinées à l’étude de la voie d’export nucléaire de l’ARN 35S, et des séquences et protéines virales potentiellement impliquées dans ce processus. / Alternative splicing and nuclear export of the pregenomic 35S RNA are two steps of the infectious cycle of Cauliflower mosaic virus (CaMV) that are poorly understood. Four 35S RNA spliced isoforms were described in previous reports. Our results show that at least twelve spliced 35S RNA isoforms are generated upon infection. Alternative splicing is important for CaMV infectivity but apparently, it does not expand CaMV proteome. Its role is difficult to assess because inactivation of splice donor or acceptor sites is constantly rescued by the use of cryptic sites. In order to maintain CaMV genomic integrity, unspliced 35S RNA must be exported to the cytoplasm. Our work has been mainly focused on developing experimental tools dedicated to study the 35S RNA nuclear export pathway as well as viral sequences and proteins potentially involved in this process.

Parmi les nombreuses perturbations participant à l'hétérogénéité bioclinique des leucémies aiguës myéloïdes (LAM), les anomalies d'épissage ont récemment pu être identifiées grâce au développement des techniques de microarray et du séquençage à haut débit. Après une revue bibliographique abordant les possible mécanismes et conséquences des perturbation de l'épissage dans les LAM, nous avons dans un deuxième article, analysé les patrons d'épissage associés à l'expression d'oncogènes connus pour interférer avec le splicéosome, l'ARN et la chromatine, ainsi qu'à la résistance aux principales drogues utilisées dans la prise en charge des LAM. Nos résultats identifient des signatures spécifiques et originales, de nombreux évènements concernant des gènes non dérégulés au plan transcriptionnel. Parmi ces perturbation nous avons, dans une troisième étude, évalué l'impact clinique d'une perturbation d'épissage de l'ARN messager de TET2. Les résultats montrent que l'exclusion de l'exon 2 de TET2 défini un facteur pronostic indépendant chez les malades traités par chimiothérapie intensive, en particulier chez les patients au caryotype normal. La dernière étude aborde l'impact des anomalies d‘épissage du transporteur ABCA3 identifiées dans les LAM. In vitro nous trouvons que l'exclusion de l'exon 19 d'ABCA3 favorise la résistance à la daunorubicine et au VP16. Paradoxalement, alors que la résistance liée à cette exclusion d'exon dépasse significativement celle liée à l'expression de la forme sauvage d'ABCA3, l'effet de l'isoforme sans exon 19 sur la rétention cellulaire de daunorubicine apparaît significativement inférieur à celui de l'ABCA3 sauvage. Au plan bioclinique, l'exclusion de l'exon 19 d'ABCA3 réduit les chances de rémission et défini un facteur pronostic indépendant chez les malades traités par chimiothérapie intensive, en particulier chez les patients au caryotype normal / Approximately one-third of expressed genes are misspliced in AML, opening the possibility that additional factors than splicing factor mutations might cause RNA missplicing in these diseases. We performed exon-array analysis and exon-specific PCR (ESPCR) to identify specific landscapes of exon expression that are associated with DEK and WT1 oncogene expression and the resistance of AML cells to AraC, doxorubicin or azacitidine. More than 70% of AEUs identified by exon-array were technically validated through ESPCR. In vitro, 1,130 to 5,868 exon events distinguished the 5 conditions from their respective controls while in vivo 6,560 and 9,378 events distinguished chemosensitive and chemoresistant AML, respectively, from normal bone marrow. Whatever the cause of this effect, 30 to 80% of mis-spliced mRNAs involved genes unmodified at the whole transcriptional level. These AEUs unmasked new functional pathways that are distinct from those generated by transcriptional deregulation. Having identified aberrant TET2 exon 2 and ABCA3 exon 19 expression in, we tested their prognostic impact In a discovery cohort (n=99), TET2 exon 2 skipping (TET2E2S) was found positively associated with a significant reduction in the cumulative incidence of relapse (CIR). Age, cytogenetics, and TET2E2S were independent prognostic factors for disease-free survival (DFS), and favorable effects on outcomes predominated in cytogenetic normal (CN)-AML and younger patients. Using the same cutoff in a validation cohort of 86 CN-AML patients, TET2E2Shigh patients exhibited a significantly lower CIR (p<10-4). TET2E2S and FLT3-ITD, but not age or NPM1 mutation status were independent prognostic factors for DFS and eventfree survival (EFS), while TET2E2S was the sole prognostic factor that we identified for overall survival (OS). In both the intermediate-1 and favorable ELN genetic categories, TET2E2S remained significantly associated with prolonged survival. Regarding ABCA3, we found that skipping of exon 19 (A3S19) triggered resistance to daunorubicine and VP16 in vitro. However such skipping did not significantly modify drug efflux, when compared with wild-type ABCA3. At the clinical level, A3S19 was found negatively correlated with response to IC, OS, DFS, and EFS, independently of age, cytogenetics, FLT3-ITD, and NPM1 mutation. AS19 improved the European LeukemiaNet Risk Classification of AML whereas it possessed no prognostic impact in patients unfit for IC

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Marcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Otávio Henrique Thiemann / Resumo: A família Trypanosomatidae inclui diversos parasitas protozoários responsáveis por diferentes doenças humanas. Várias evidências sugerem importantes diferenças entre a maquinária de tradução e processamento de mRNA (trans-splicing) em Tripanosomatídeos quando comparados com eucariótos superiores. Neste contexto, alguns fatores importantes para o funcionamento da célula eucarióticas são os pequenos complexos constituídos de proteínas e RNA, chamados de ribonucleoproteínas (U snRNPs). Esta partículas possuem papel essencial no processamento de RNA mensageiros e durante a reação de splicing apresenta um core comum composto por proteínas (proteínas Sm) and RNAs estruturais (U snRNAs) e um conjunto de proteínas específicas de cada complexo. Embora bem definidas em mamíferos, snRNPs permanecem pouco caracterizadas em Tripanosomatídeos. Ferramentos de bioinformática identificaram quatro possíveis proteínas específicas do complexo U5 snRNP (U5-15K, U5-40K, U5-102K e U5-116K), e importantes parâmetros foram determinados, como peso molecular estimado, domínios e motivos conservados. Este trabalho demonstrou que U5-15K e 45-102K são altamente conservadas entre o Tripanosomatídeos e os domínios Dim1 and Prp1 foram identificados, respectivamente. Técnicas de purificação de complexos (PTP-tag) revelaram que estas proteínas interagem com o U5 snRNA, sugerindo que participem do complexo U5 snRNP. Análises funcionais demonstraram que U5-15K é essencial para viabilidade celular e que de alguma forma esta asssociada tanta a reação de cis quanto de tras-splcing. Experimentos de imunolocalização de U5-15K and U5-102K corroboram este dados, uma vez que as protínas em questão possuem localização nuclear. / Abstract:There are several protozoan parasites in Trypanosomatidae family, including different agents responsible for human diseases. Several evidences suggest important differences in the translational system and mRNA processing (trans-splicing) in Trypanosomatids when compared to higher eukaryotes. In this context, some important factors for the functioning of eukaryotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing. UsnRNP presents a common protein core associated between itself and with the snRNA, named Sm proteins and specific proteins of each snRNP. Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not well characterized in certain Trypanosomatids. Bioinformatics analysis identified four possible U5 snRNP specific proteins (U5-15K, U5-40K, U5-102K and U5-116K), and important parameters were determinated, as estimated molecular weight, motifs and conserved domains. This work shows that the U5-15K and U5-102K proteins are highly conserved among different Tryponosomatids species and Dim1 and Prp1 domains were identified, respectively. Tandem affinity pull-down assay revealed that these proteins interact with U5snRNA, suggesting its participation in U5snRNP particle, and functional analysis showed that U5-15K is essential for cell viability and it is associated in some way to trans and cis-splicing machinery. Immunolocalization experiments corroborated those data, showed U5-15K and U5-102K in the nucleus of the cell. / Doutor

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-10T13:11:28Z No. of bitstreams: 1 DissJLO.pdf: 1924288 bytes, checksum: 2b2ce6a9b82a3dfb41ddb5f343fde1b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:39:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJLO.pdf: 1924288 bytes, checksum: 2b2ce6a9b82a3dfb41ddb5f343fde1b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:39:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJLO.pdf: 1924288 bytes, checksum: 2b2ce6a9b82a3dfb41ddb5f343fde1b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T19:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJLO.pdf: 1924288 bytes, checksum: 2b2ce6a9b82a3dfb41ddb5f343fde1b7 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The genus Anastrepha (Tephritidae) has several species of great economic importance due to their impact in fruticulture. We are particularly interested in the evolutionary history of Anastrepha fraterculus, the most relevant species in the closely related group of species fraterculus, which has undergone recent divergence and holds the majority of species of economic importance in the genus. To better understand the differentiation process and identification in the group, we need to find molecular and morphological markers that are involved with the differences between species. Reproductive genes have, in general, been very informative in this regard due to their rapid evolutionary rates, although few of them have been studied and characterized in this species so far. Therefore, the present study focuses on the exuperantia gene (exu), which participates in both oogenesis (localization of bicoid and oskar mRNAs) and spermatogenesis, since exu embryos from mutant mothers are unviable and males are sterile. Thus, the first step was to use Next generation sequencing strategies (RNA-seq) to structurally characterize and define expression patterns of this gene between sexes in the cephalic and reproductive tissues of A. fraterculus. A. fraterculus has similar structural and expression patterns to Drosophila melanogaster in reproductive tissues, in which the transcripts differ between sexes for the 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs). We describe for the first time the expression of exu in cephalic tissues, involving a new isoform that is common to both sexes. All these alternative spliced transcripts share a common coding region, resulting in the same protein. We used the exu coding region, along with sequences from several Diptera to investigate the molecular evolution of exu in Cyclorrhapha. This group has experienced an enormous adaptive radiation, associated with molecular and morphological changes, and by comparing the dN/dS ratio between Cyclorrhapha and other Diptera we found that exu was subjected to positive selection in Cyclorrhapha for at least two sites in the coding region. One of the sites is present in the RNA exonuclease-like domain of exu. The second site is located in a not characterized region that is conserved and under purifying selection in Diptera, suggesting that it may be an important region of the protein. The adaptive changes found in exu may reflect an evolutionary gain that allowed its co-option for a new function the gene performs in Cyclorrhapha: the localization of bicoid in the anterior region of the oocyte, since bcd is a gene exclusive of Cyclorrhapha. / O gênero Anastrepha (Tephritidae) é de grande importância econômica devido ao seu impacto na fruticultura nacional. Estudamos aqui a história evolutiva de Anastrepha fraterculus, a espécie mais relevante do grupo fraterculus, o qual sofreu divergência recente e contém a maioria das espécies de importância econômica do gênero. Para entender melhor o processo de especiação nesse grupo, e auxiliar no processo de identificação taxonômica, precisamos estabelecer marcadores morfológicos e moleculares envolvidos com as diferenças entre as espécies. Genes envolvidos com a reprodução têm se mostrado bastante informativos para estes propósitos, devido às rápidas taxas evolutivas que apresentam, embora poucos tenham sido estudados e caracterizados nessas espécies até o momento. Nesse sentido, esse trabalho tem como foco o gene exuperantia (exu), que participa tanto da ovogênese (localização dos mRNAs bicoid e oskar) quanto da espermatogênese, uma vez que embriões formados a partir de fêmeas mutantes exu são inviáveis e machos mutantes exu são estéreis. Assim, o primeiro passo foi caracterizar estruturalmente e definir padrões de expressão desse gene entre os sexos nos tecidos cefálicos e reprodutivos em A. fraterculus. Utilizando sequenciamento de próxima geração (RNA-seq), identificamos um padrão estrutural e de expressão semelhante àquele de Drosophila melanogaster em tecidos reprodutivos: os transcritos diferem nas regiões não traduzidas (UTRs) 5’ e 3’ entre os sexos. Pela primeira vez identificamos a expressão de exu em tecidos cefálicos, envolvendo uma nova isoforma que é igual nos dois sexos. Em todos os casos, as regiões codificadoras são iguais, resultando na sequência proteica. Utilizamos essa região codificadora de exu junto com sequências de outras espécies de Diptera para investigar a evolução molecular de exu em Cyclorrhapha, que sofreu uma grande radiação adaptativa associada com alterações morfológicas e moleculares. Comparando a relação dN/dS entre Cyclorrhapha e outros Diptera, encontramos dois sítios sob seleção positiva em Cyclorrhapha, um deles presente no domínio semelhante à RNA exonuclease de exu. O segundo está presente em uma região não caracterizada para domínios proteicos, mas que é bem conservada e está sob seleção purificadora em Diptera, sugerindo ser uma região importante da proteína. As mudanças adaptativas encontradas em exu podem refletir um ganho evolutivo que permitiu sua co-optação para uma nova função em Cyclorrhapha: a de localização de bicoid na região anterior do ovócito, visto que bcd é um gene exclusivo de Cyclorrhapha.

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Marcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Lucile Maria Floeter-Winter / Resumo: Alguns fatores importantes no funcionamento das células eucarióticas correspondem à pequenos complexos de RNA e proteínas; essas partículas de ribonucleoproteínas (UsnRNPs) têm um papel essencial no processamento do pré-mRNA, principalmente durante o splicing (corte de íntrons e união de éxons). Embora as snRNPs estejam definidas em mamíferos, ainda não estão bem caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. Assim, este trabalho propôs a caracterização molecular dos snRNAs (U2, U4, U5 e U6), por PCR e RT-PCR de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). Essas seqüências amplificadas foram clonadas, seqüenciadas e comparadas entre os tripanosomatídeos e o alinhamento múltiplo apresentou mais de 70% de identidade, exceto da U5 snRNA, que se mostrou menos conservada. Árvores filogenéticas mostraram a proximidade evolutiva dos snRNAs analisados em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. As respectivas estruturas secundárias foram preditas, confirmando-se também as semelhanças com aquelas de T. brucei. O alinhamento das snRNAs de T. cruzi com as seqüências de Homo sapiens mostrou regiões únicas em U2, U4 e U5 snRNAs, nessa espécie, enquanto U6 mostrou-se fortemente conservada. Até o momento, ainda não foi possível a obtenção da seqüência completa de U1 snRNA de T. cruzi. / Abstract: Some important factors in functioning of the eucariotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing (cut of introns and union of exons). Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not characterized in certain Trypanosomatids, as well, Trypanosoma cruzi. So, this work proposed the molecular characterization of the snRNAs (U2, U4, U5 and U6), by PCR and RT-PCR with T. cruzi epimastigote forms (Y strain). These amplified sequences were cloned, sequenced and compared among the Trypanosomatids and the multiple alignment presented more than 70% of identity, except for U5 snRNA, which showed less conserved. Phylogenetic trees showed the evolutionary proximity between the Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi snRNAs analysed. The respective secondary structures were predicted and also confirmed similarity with T. brucei. The alignment of T. cruzi snRNAs with Homo sapiens sequences showed unique regions in U2, U4 and U5 snRNAs in this species, while U6 was strongly conserved. Until this moment, it was not still possible to obtain U1 snRNA of T. cruzi complete sequence. / Mestre

Orientadores: Lucia Elvira Alvares, Jose Xavier Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T10:17:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobreira_DeboraRodrigues_M.pdf: 2481929 bytes, checksum: 2cb1105ccc78322b5f11f4528108d2fc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Splicing Alternativo é um mecanismo importante para expandir a diversidade protéica em eucariotos. Este processo permite a produção de diferentes mRNAs a partir de uma mesma molécula de pré-RNA e é freqüentemente utilizado pelos genes envolvidos no desenvolvimento embrionário. O gene Oapper1 (Opr1) é um importante modulador da via de sinalização Wnt, atuando em diversos processos como especificação do tecido neural, morfogênese cefálica e desenvolvimento do coração e olho. Entre seus parceiros estão as '1lOléculas Dishevelled, o fator de transcrição TCF-3 (ambas as moléculas envolvidas na sinalização Wnt) e Dbf-4 (regulador do ciclo celular). Considerando que Dpr1 possui uma estrutura modular e interage com diferentes parceiros moleculares através de diferentes domínios estruturais, esta molécula poderia utilizar a maquinaria de Splicing Alternativo para combinar diferentes domínios e conseqüentemente ampliar suas funções biológicas. Neste estudo, descrevemos uma nova Variante do gene Opr1, identificada inicialmente no transcriptoma de camundongo utilizando ferramentas de Bioinformática. Esta nova Variante é maior em 111 pb em relação à codificada pela seqüência referência de RNAm para Dpr1 RefSeq, as quais são denominadas, respectivamente, como Variante A e Variante B. Estes transcritos variantes são gerados por dois sítios aceptores de Splicing distintos presentes no início do exon 4. O segmento exclusivo da Variante A codifica 37 aminoácidos localizados na região onde Opr1 se associa ao fator transcricional TCF-3. Uma análise comparativa do lócus de Opr1 entre diversos vertebrados (peixe, anfíbio, galinha, camundongo e humano) revelou que ambos os sítios aceptores de Splicing são conservados nos tetrápodas, enquanto que em peixe apenas um sítio é encontrado. Ensaios de RT-PCR confirmaram nossos resultados obtidos em Bioinformática. Além disso, demonstramos que ambas as Variantes são co-expressas ao longo do desenvolvimento de galinha, sugerindo que a concentração relativa dessas moléculas pode ser importante para a sua função. Finalmente, análises de pressão seletiva foram realizadas para a molécula de Dpr1. Apesar de não se confirmar a presença de seleção positiva ao longo da proteína Dpr1, o exon 4 parece estar sob pressão seletiva mais relaxada quando comparado aos outros exons. Nossos resultados são consistentes com a hipótese de que o mecanismo de Splicing Alternativo atua acelerando a evolução, reduzindo a seleção negativa. / Abstract: Alternative splicing is an important mechanism to expand protein diversity in eukaryotes. This process allows the production of different mRNAs from a single coding sequence and is frequentfy used by genes involved in development. Oapper 1 (Opr1) is an important rnodulator of Wnt signalling, working in several developmental processes, such as neural tissue specification, head morphogenesis, heart and eye development. While its interaction with Oishevelled is known to modulate Wnt signalling both in vivo and in vitre, the interaction wrth other molecules is required to mediate its multiple biological functions. Considering that Dpr1 has a modular structure that mediates its interaction with different partners through different structural domains, this molecule could greatly benefit from alternative splicing in order to combine different domains and consequently amplify its biological functions. In the present study we describe a new Opr1 isoform that was initially identified in the mouse transcriptome using bioinformatic tools. This isoform is 111 pb longer than the one encoded by the RefSeq mRNA for Opr1, here named O and E isoforms, respectively. The variant transcripts are generated through two distinct acceptor splice sites in exon 4. The segment exclusive of the O isoform is in frame and encodes 37 residues located in a variable region of Oprl exon 4, known to be necessary for the interaction with the transcriptional factor Tcf3. comparative analysis of the Opr1 locus among fish, frog, chicken, mouse and human revealed that in tetrapods two acceptor splice sites are conserved in the beginning of the exon 4, while in fish a single acceptor splice site is found. RT-PCR using species-specific primers confirmed the expression of the O and E isoforms in tetrapods while in fish only the O isoform was detected. In addition, we showed that the Opr1 isoforms are coexpressed throughout chicken development, suggesting that the relative concentration of these molecules may be important for their functionality. Finally, even though no evidence of positive selection was detected for the entire Dpr1 protein, exon 4 seems to be under more relaxed selective pressure than the other exons. These results are consistent with the notion that alternative splicing can act as a mechanism for opening accelerated paths of evolution by reducing negative selection pressure. / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:23:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hollanda_LucianaMariade_D.pdf: 4424025 bytes, checksum: 8c238f31a49b17fab4715981e3919ca2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Várias mutações hereditárias no gene GATA1 localizadas no éxon 4 e conseqüentemente que afetam o domínio dedo de zinco N-terminal foram descritas em algumas famílias que apresentavam graus variáveis de plaquetopenia com ou sem anemia. Por outro lado, mutações adquiridas no éxon 2 deste gene foram observadas em quase todos os casos estudados de pacientes com Síndrome de Down e que apresentavam TMD ou AMKL. Essas mutações impedem a síntese da proteína total, mas permite a síntese da isoforma menor da proteína, denominada GATA-1s. Experimentos em camundongo sugeriram que a síntese única da isoforma GATA-1s seria suficiente para induzir hemopoese normal nesses animais. Neste trabalho descrevemos em pacientes e portadores de uma família a mutação 332G--C localizada no éxon 2 do gene GATA 1 que conduz a produção apenas da proteína GATA-1s nos homens afetados. Os perfis hematológicos desses pacientes demonstraram anemia macrocítica, neutropenia em vários casos e número normal de plaquetas. Em seu conjunto, esses dados sugerem que a proteína GATA -1s, produzida em níveis normais ou baixos não é suficiente para conduzir à eritropoese normal. Além disso, este é o primeiro estudo onde uma mutação hereditária no éxon 2 do gene GATA1 origina apenas a proteína GATA-1s e não provoca AMKL ou TMD em indivíduos não portadores de síndrome de Down. Desta forma este estudo indica que outros eventos cooperativos, como outras mutações ou a trissomia do cromossomo 21 provavelmente podem ser os responsáveis por essas anomalias em crianças com síndrome de Down / Abstract: Inherited mutations in exon 4 of the GATA1 gene, which codes for the N-terminal zinc finger domain of GATA-1, have been found in some families, leading to a familial dyserythropoietic anemia with thrombocytopenia, X-linked thrombocytopenia and X-linked thalassemia with thrombocytopenia. Acquired somatic mutations in exon 2 of the hematopoietic transcription factor GATA-1 have been found in individuals with Down syndrome with both transient myeloproliferative disorder and acute megakaryoblastic leukemia . These mutations prevent the synthesis of the full-length protein but allow the synthesis of its short isoform, GATA-1s. Experiments in mice suggest that GATA-1s supports normal adult megakaryopoiesis, platelet formation and erythropoiesis. Here we report a mutation, 332G-C, in exon 2 of GATA1, leading to the synthesis of only the short isoform in seven affected males from two generations of a family. Hematological profiles of affected males demonstrate macrocytic anemia, normal platelet counts and neutropenia in most cases. Altogether, data suggest that GATA-1s alone, produced in low or normal levels, is not sufficient to support normal erythropoiesis. Moreover, this is the first study to indicate that a germline splicing mutation does not lead to leukemia in the absence of other cooperating events, such as Down syndrome / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Anna Wedell / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soardi_FernandaCaroline_D.pdf: 4267789 bytes, checksum: 80c77e1664dcc041014d42a92bdd435e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A causa mais freqüente de hiperplasia congênita da adrenal (HCA) é a deficiência da enzima CYP21A2 responsável por cerca de 90% dos casos, seguida da deficiência de CYP11B1, a qual é responsável por 5-8%. A deficiência de CYP21A2 apresenta diferentes sintomas clínicos, que podem variar de uma forma leve não clássica (NC) a uma forma grave clássica, dividida em virilizante simples (VS) e perdedora de sal (PS). Enquanto a deficiência de CYP11B1 é classificada nas formas clássica e não-clássica, dependendo da gravidade do fenótipo. As diferentes formas destas deficiências estão associadas a mutações distintas ou a combinação de mutações nos genes, sendo estas mutações provenientes dos genes homólogos ou não. O primeiro objetivo desta tese foi identificar novas mutações em alelos de 31 pacientes. As variantes protéicas novas p.G56R, p.L107R e p.L142P e, as raras p.H62L, p.H62L+p.P453S e p.R408C do gene CYP21A2 foram expressas para comparar as atividades da enzima CYP21A2 nas suas formas normal e mutantes. Foi objetivo, também, estudar através da técnica de mini-genes as possíveis alterações no processo de splicing para as variantes IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E do gene CYP21A2 e para a variante g.1753G>A do gene CYP11B1. O estudo da atividade enzimática do gene CYP21A2, realizado pela técnica de mutagênese sítio-dirigida, demonstrou que as mutações p.L107R, p.L142P e p.R408C reduziram a atividade enzimática para valores praticamente nulos, classificando-as como responsáveis pela forma PS. A alteração p.G56R apresentou uma quantidade mínima de conversão de progesterona em desoxicorticosterona, quantidade suficiente para evitar a perda de sal, sendo considerada clássica associada à forma VS. A mutação p.H62L foi encontrada no mesmo alelo que a mutação p.P34L, em uma das pacientes da casuística desse trabalho, ambas inseridas num gene quimérico portador da deleção de 30 Kb. A mutação p.H62L também foi encontrada em associação com a mutação p.P453S, em dois pacientes de origem Escandinava. No estudo funcional a mutação p.H62L reduziu parcialmente a atividade enzimática. Os resultados cinéticos classificaram essa mutação como relacionada à forma NC da deficiência de CYP21A2. Em combinação com a mutação p.P453S, observou-se um sinergismo, uma vez que reduziu a atividade da enzima para a faixa limítrofe entre NC e VS. A investigação no processo de splicing utilizando a técnica de minigenes para as alterações no gene CYP21A2 indicou que a variação IVS2+5G>A causa a perda do exon 2 na formação do mRNA, sendo relacionada à forma PS. Da mesma forma, a variação IVS2- 2A>G foi classificada como associada à forma PS, pois inseriu no mRNA 19 bases provenientes do intron 2 na junção exon2-exon3, o que modificou o frame de leitura do mRNA criando um códon de parada prematura. Por outro lado, ficou demonstrado que as variações IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E não interferem no processamento normal do mRNA do gene CYP21A2. No caso da alteração g.1753G>A no gene CYP11B1, que foi classificada como responsável pela forma clássica da deficiência de CYP11B1, o estudo de mini-gene indicou a perda dos últimos 45 nucleotídeos do exon 4, criando um códon de parada prematura. A elucidação do papel funcional e estrutural das mutações nos genes estudados permitiu o correto estabelecimento da correlação genótipo-fenótipo na maioria dos pacientes com HCA estudados / Abstract: Deficiency of CYP21A2 enzyme is responsible for more than 90% of congenital adrenal hyperplasia (CAH) followed by the deficiency of CYP11B1, which is responsible for 5-8% of the cases. The deficiency of CYP21A2 is normally classified in clinical forms that vary from a mild non-classical (NC) to a severe classical form, which can manifest as salt wasting (SW) or as simple virilizing (SV). Depending on the severity of phenotype, deficiency of CYP11B1 can be classified in classical or non-classical forms. In both deficiencies the clinical forms are associated with different mutations or combination of mutations, which may or may not be originated from the homologous genes. The aim of this study was to identify novel or rare mutations in alleles of 31 patients with CYP21A2 deficiency. Using site-direct mutagenesis strategies, nucleotide variants were introduced into the cDNA and the novel p.G56R, p.L107R and p.L142P and rare p.H62L, p.H62L+p.P453S and p.R408C protein variants of CYP21A2 were expressed to compare the enzymatic activity between the wild-type and mutant proteins. Furthermore, splicing activities were investigated for IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E sequence CTP21A2 variations and for g.1753G>A on CYP11B1 gene by minigene constructions. The analysis of enzymatic conversion of both CYP21A2 substrates, 17-hydroxyprogesterone and progesterone, into 11-desoxycortisol and corticosterone, respectively, showed low levels of residual activities for p.L107R, p.L142P and p.R408C, which were classified as SW mutations. Whereas, the result of enzyme activity for p.G56R indicated that it might be a SV-related mutation due a residual activity of 1.4% toward progesterone as substrate. The p.H62L was associated to p.P34L mutation in a chimeric gene present in a 30-kb deletion allele in Brazilian patients. In Scandinavian patients, the p.H62L mutation was found associated to the p.P453S which is known as a NC mutation. The p.H62L itself showed an activity within the range of NC mutations. The apparent kinetic constant confirmed this classification. A synergistic effect was observed for the allele bearing the p.H62L+p.P453S combination as it had caused a significant reduction in the enzymatic activity bringing it to the borderline level between SV and NC mutations. On the minigene analyses for CYP21A2, the IVS2+5G>A variation showed skipping of exon 2, therefore this alteration was classified as SW mutation. Likely, IVS2-2A>G was considered as a SW mutation due to the insertion of 19 nucleotides from intron 2 into the resulting mRNA, which changed the reading frame and created a premature stop codon. Conversely, the group of variations IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E did not affect the normal splicing of CYP21A2 mRNA. In the CYP11B1 minigene analysis, the g.1753G>A nucleotide variation was classified as responsible for the classical form of deficiency. An alternative splicing due to disruption of the normal donor site was used and the skipping of the last 45 nucleotides of exon 4 was observed. This alteration modified the mRNA reading frame and created a premature stop codon. The elucidation of functional and structural characters of the steroidogenic gene mutations led to the establishment of a correct genotype-phenotype in most patients studied. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Ácido Hialurônico (HA) é um componente da matriz extracelular, responsável pela hidratação e manutenção do equilíbrio osmótico tecidual. Concentrações de HA estão elevadas em vários tipos de cânceres, incluindo próstata. Hialuronidases (HAases), são uma família de enzimas relacionadas com a propagação de infecções bacterianas, toxinas de venenos e progressão tumoral. A quebra do HA em pequenos fragmentos (3-25 dissacarídeos) promovidos pela ação das HAases tipo Hyal1, Hyal2 e Hyal3, está relacionada à promoção do câncer através da indução da angiogênese e estímulo a proliferação através de ativação da via tirosina quinase. Algumas isoformas de HAases, descritas como produto de splicing alternativo, possuem atividade enzimática diversificada. A heterogeneidade de expressão das HAases foi identificada em alguns tipos de câncer e pode ser correlacionada com o comportamento diferenciado dos tumores. Para este trabalho estudamos amostras de 55 pacientes submetidos a prostatectomia radical por carcinoma de próstata (CP) . A média de idade foi 66 anos e o tempo médio de seguimento 73,7 meses. Os pacientes foram divididos em dois grupos para análise dos resultados: 1- Escore de Gleason (EG) >=7 (30) e EG <=6 (25). 2- Comportamento tumoral (recidiva-19, e não recidiva-36), considerando o nível sérico de Antígeno Específico da Próstata (PSA) 0,2 ng/mL. O grupo controle foi representado por 11 pacientes com hiperplasia prostática benigna, submetidos à ressecção retropúbica. As HYAL foram identificadas por PCR, com uso de primers específicos para as variantes 1, 2, 3, 4 e 5 e wt da HYAL1, wt da HYAL2, e wt e variantes 1, 2 e 3 da HYAL3. As HYAL mais freqüentemente expressas pelo CP foram HYAL2-wt (65,4%), HYAL1-v1 (63,3%) e HYAL3-wt (47,2%). Em tecidos prostáticos benignos, a HYAL3-v1 foi expressa em 90,9% dos casos, estando presente em 36% dos tumores com EG baixo, e não expressa em tumores com EG alto (p=<0,001). Nos tumores sem recidiva HYAL1-v3 foi expressa em 30,5% dos casos versus 5,2% em casos que recorreram (p=0,041). HYAL3 v2, foi expressa por 33,3% dos tumores que não recorreram e não expressa em tumores que recorreram (p=0,002). Concluímos que a expressão de HYAL1-v3, HYAL3-v1 e HYAL3-v2 está relacionada a tumores mais diferenciados e com menores taxas de recidiva, podendo ser utilizadas como marcadores na prática clínica identificando candidatos a terapias mais conservadoras. / Hyaluronic acid (HA) is a component of the extracellular matrix that hydrates and maintains the osmotic balance of tissues. HA concentration is elevated in several cancers including prostate. Hyaluronidases (HAases) are a family of enzymes related to the spread of bacterial infections, toxins of venoms and probably cancer progression. Small fragments of HA are generated by HAase Hyal1, Hyal2 and Hyal3, stimulating endothelial proliferation and activating mitogen-activated protein kinase pathway. Several isoforms of HAases have been described as a product of alternative splicing, and are responsible for differences in the enzyme activity. The heterogeneity of HAses expression has been identified in tumors and could be related to the differences in their biological behavior. Fifty-five patients submitted to radical prostatectomy for prostate cancer (PC) were the subject of this study. The mean age was 66 years old and the mean follow-up was 73,7 months. Patients were divided into two groups for the analyses: 1- High Gleason score (GE) >=7 (30) and low Gleason score <=6 (25). 2- Tumor behavior; recurrence - 19 and nonrecurrence - 36. Biochemical recurrence was considered when PSA was higher than 0.2 ng/mL. The control was represented by 11 patients submitted to retropubic prostate resection for benign prostatic hyperplasia. The alternative splicing forms of HYAL were identified by PCR, and the primer sequences identified variants 1, 2, 3, 4, 5 e wt of HYAL1, wt of HYAL2, wt and variants 1, 2 and 3 of HYAL3. The HYAL more frequently expressed by PC was HYAL2-wt (65.4%), HYAL1-v1 (63.3%) and HYAL3-wt (47.2%). In benign prostate tissue the main expressed HAase was HYAL3-v1 in 90.9%, being present in 36% of low Gleason score tumors and not expressed by tumors with high Gleason score (p=<0.001). For tumors that not recurred there was expression of HYAL1-v3 in 30.5% of the cases vs. 5.2% in cases that recurred (p=0.041). The same difference was noted regarding the expression of HYAL3-v2, that was expressed by 33.3% of tumors that not recurred and not expressed by tumors that recurred (p=0.002). We conclude that there is a profile of HAase related to low Gleason score and non-recurrent PC that is characterized by expression of HYAL1-v3, HYAL3-v1 and HYAL3-v2 that could be used in clinical practice to choose a better treatment.

Orientadores: Sérgio Roberto Peres Line, Marcelo Rocha Marques / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_MarianaMartins_D.pdf: 2903322 bytes, checksum: 9e0e5e91a22262495ca9bf8ae1d84cec (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: G-Quadruplexes são estruturas secundárias presentes nas moléculas de DNA e RNA, os quais são formados pelo empilhamento de G-quartetos (interação de quatro guaninas (G-tratos) delimitadas por ligações de hidrogênio do tipo Hoogsteen. O intron 1 do gene PAX9 humano tem um G-quadruplex formado na região localizada perto do exon 1, que é conservada entre os mamíferos placentários. Análises de Dicroísmo Circular (CD), e CD melting mostraram que estas sequências são capazes de formar estruturas quadruplex altamente estáveis. Devido à proximidade da estrutura quadruplex ao limite éxon-íntron foi utilizado um ensaio validado de splicing duplo repórter e PCR em tempo real para analisar o seu papel na eficiência de splicing. O quadruplex humano mostrou ter um papel chave na eficiência de splicing do íntron 1 do gene PAX9, já que uma mutação que aboliu a formação do quadruplex diminuiu drasticamente a eficiência de splicing. O quadruplex de rato, menos estável, mostrou menor eficiência quando comparado com sequências humanas. Além disso, o tratamento com 360A, um forte ligante que estabiliza estruturas quadruplex, aumentou ainda mais a eficiência de splicing do íntron 1 do PAX9 humano. Em conjunto estes resultados fornecem evidências de que as estruturas de G-quadruplex estão envolvidas na eficiência de splicing do intron 1 do gene PAX9 / Abstract: G-Quadruplex are secondary structures present in DNA and RNA molecules, which are formed by stacking of G-quartets (i.e. interaction of four guanines (G-tracts) bounded by Hoogsteen hydrogen bonding). Human PAX9 intron 1 has a putative G-quadruplex- forming region located near exon 1, which is conserved among placental mammals. Using Circular Dichroism (CD) analysis, and CD melting we showed that this region is able to form highly stable quadruplex structures. Due to the proximity of the quadruplex structure to exon-intron boundary we used a validated double reporter splicing assay and real time PCR to analyze its role on splicing efficiency. The human quadruplex was shown to have a key role on splicing efficiency of PAX9 intron 1, as a mutation that abolished quadruplex formation decreased dramatically splicing efficiency. The less stable, rat quadruplex had a less efficient splicing when comparing to human sequences. Additionally, the treatment with 360A, a strong ligand that stabilizes quadruplex structures, further increased splicing efficiency of human PAX9 intron 1. Altogether these results provide evidences that G-quadruplex structures are involved in splicing efficiency of PAX9 intron 1 / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental