A excisão de sequencias intrônicas dos precursores de mRNAs é um passo crítico durante a expressão gênica eucariótica. Essa reação é catalisada pelo complexo macromolecular denominado spliceossomo, composto por partículas ribonucleoproteicas nucleares (U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs), além de inúmeros fatores associados. Em tripanossomatídeos, os genes são transcritos em longas unidades policistrônicas e a reação de SL trans-splicing é requerida para geração de transcritos monocistrônicos maduros. O spliceossomo é uma maquinaria altamente dinâmica e parte das mudanças conformacionais ocorridas neste complexo é mediada por RNA helicases. A RNA helicase/ATPásica Sub2 (em mamífero, UAP56), cujas homólogas foram descritas como membros do complexo TREX (transcrição/exportação do RNA), é essencial na montagem do pré-spliceossomo, além de estudos sugerirem sua participação em outras etapas de montagem desse complexo. Em tripanossomatídeos, a função desta proteína no transporte de mRNA entre núcleo e citoplasma já foi descrita, entretanto, seu envolvimento na reação de splicing permanece indefinido. Neste trabalho, buscou-se estudar esse envolvimento através de técnicas de purificação em tandem e RNA de interferência. A purificação dos parceiros de interação da proteína somada à identificação por espectrometria de massas mostrou que TbSub2 co-purifica com proteínas envolvidas em múltiplas vias do metabolismo do parasito, incluindo proteínas e fatores relacionados ao processamento de mRNA. Além disso, essa proteína é essencial para os parasitos na forma procíclica e sanguínea e apresenta localização nuclear em ambas as linhagens. Análises por qPCR em tempo real e RT-PCR mostraram que o silenciamento de TbSub2 causa defeito na maquinaria de SL trans-splicing mas seu efeito no cis-splicing não é claro. Por fim, foi possível realizar a expressão heteróloga e purificação da proteína TbSub2 recombinante, bem como estudos para avaliar seu estado oligomérico e estabilidade. Dessa forma, foi constatado que essa proteína é estável em diferentes tampões e apresenta estados oligoméricos distintos nas técnicas empregadas nesse trabalho. O estudo aqui apresentado trouxe evidências da participação da proteína TbSub2 na reação de SL trans-splicing em ambas as linhagens, bem como em múltiplas vias do metabolismo do parasito na forma procíclica, contribuindo para uma elucidação das funções dessa proteína em tripanossomatídeos. / The excision of intronic sequences from precursor mRNAs is a critical step during eukaryotic gene expression. This reaction is catalyzed by the macromolecular complex called spliceosome, composed of nuclear ribonucleoprotein particles (U1, U2, U4 / U6, U5 snRNPs), besides numerous associated factors. In trypanosomatids, genes are transcribed in long polycistronic units and the SL trans-splicing reaction is required for the generation of mature monocistronic transcripts. The spliceosome is a highly dynamic machinery and part of this complex\'s conformational changes is regulated by RNA helicases. The RNA helicase / ATPase Sub2 UAP56, in mammalian), whose homologous proteins have been described as members of the TREX complex (transcription / RNA export), is essential in the pre-spliceosome assembly, besides its participation in other assembly steps of this complex, as suggested by other studies. In trypanosomatids, the role of this protein in the nucleus/cytoplasm mRNA transport has already been described, however its involvement in the splicing reaction remains unknown. In this work, we studied this involvement through tandem affinity purification and RNA interference. The purification of this proteins binding partners added to the identification by mass spectrometry showed that TbSub2 co-purifies with proteins involved in multiple metabolism pathways of the parasite, including proteins and factors related to mRNA processing. In addition, this protein is essencial for the parasites in procyclic and bloodstream forms and localizes in the nucleus in both strains. qPCR and RT-PCR analysis showed that the silencing of TbSub2 causes defect in the SL trans-splicing machinery but its effect on cis-splicing is unclear. Finally, it was possible to perform the heterologous expression and purification of recombinant TbSub2 protein, as well as studies to evaluate its oligomeric state and stability. Thus, it was found that this protein is stable in different buffers and presents different oligomeric states in the techniques employed in this work. This study has provided evidence of this helicases participation in the SL trans-splicing reaction in booth strains, as well as in several metabolism pathways of the parasite in prociclic form, contributing to the elucidation of the protein functions in trypanosomatids.

A excisão de sequencias intrônicas dos precursores de mRNAs é um passo crítico durante a expressão gênica eucariótica. Essa reação é catalisada pelo complexo macromolecular denominado spliceossomo, composto por partículas ribonucleoproteicas nucleares (U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs), além de inúmeros fatores associados. Em tripanossomatídeos, os genes são transcritos em longas unidades policistrônicas e a reação de SL trans-splicing é requerida para geração de transcritos monocistrônicos maduros. O spliceossomo é uma maquinaria altamente dinâmica e parte das mudanças conformacionais ocorridas neste complexo é mediada por RNA helicases. A RNA helicase/ATPásica Sub2 (em mamífero, UAP56), cujas homólogas foram descritas como membros do complexo TREX (transcrição/exportação do RNA), é essencial na montagem do pré-spliceossomo, além de estudos sugerirem sua participação em outras etapas de montagem desse complexo. Em tripanossomatídeos, a função desta proteína no transporte de mRNA entre núcleo e citoplasma já foi descrita, entretanto, seu envolvimento na reação de splicing permanece indefinido. Neste trabalho, buscou-se estudar esse envolvimento através de técnicas de purificação em tandem e RNA de interferência. A purificação dos parceiros de interação da proteína somada à identificação por espectrometria de massas mostrou que TbSub2 co-purifica com proteínas envolvidas em múltiplas vias do metabolismo do parasito, incluindo proteínas e fatores relacionados ao processamento de mRNA. Além disso, essa proteína é essencial para os parasitos na forma procíclica e sanguínea e apresenta localização nuclear em ambas as linhagens. Análises por qPCR em tempo real e RT-PCR mostraram que o silenciamento de TbSub2 causa defeito na maquinaria de SL trans-splicing mas seu efeito no cis-splicing não é claro. Por fim, foi possível realizar a expressão heteróloga e purificação da proteína TbSub2 recombinante, bem como estudos para avaliar seu estado oligomérico e estabilidade. Dessa forma, foi constatado que essa proteína é estável em diferentes tampões e apresenta estados oligoméricos distintos nas técnicas empregadas nesse trabalho. O estudo aqui apresentado trouxe evidências da participação da proteína TbSub2 na reação de SL trans-splicing em ambas as linhagens, bem como em múltiplas vias do metabolismo do parasito na forma procíclica, contribuindo para uma elucidação das funções dessa proteína em tripanossomatídeos. / The excision of intronic sequences from precursor mRNAs is a critical step during eukaryotic gene expression. This reaction is catalyzed by the macromolecular complex called spliceosome, composed of nuclear ribonucleoprotein particles (U1, U2, U4 / U6, U5 snRNPs), besides numerous associated factors. In trypanosomatids, genes are transcribed in long polycistronic units and the SL trans-splicing reaction is required for the generation of mature monocistronic transcripts. The spliceosome is a highly dynamic machinery and part of this complex\'s conformational changes is regulated by RNA helicases. The RNA helicase / ATPase Sub2 UAP56, in mammalian), whose homologous proteins have been described as members of the TREX complex (transcription / RNA export), is essential in the pre-spliceosome assembly, besides its participation in other assembly steps of this complex, as suggested by other studies. In trypanosomatids, the role of this protein in the nucleus/cytoplasm mRNA transport has already been described, however its involvement in the splicing reaction remains unknown. In this work, we studied this involvement through tandem affinity purification and RNA interference. The purification of this proteins binding partners added to the identification by mass spectrometry showed that TbSub2 co-purifies with proteins involved in multiple metabolism pathways of the parasite, including proteins and factors related to mRNA processing. In addition, this protein is essencial for the parasites in procyclic and bloodstream forms and localizes in the nucleus in both strains. qPCR and RT-PCR analysis showed that the silencing of TbSub2 causes defect in the SL trans-splicing machinery but its effect on cis-splicing is unclear. Finally, it was possible to perform the heterologous expression and purification of recombinant TbSub2 protein, as well as studies to evaluate its oligomeric state and stability. Thus, it was found that this protein is stable in different buffers and presents different oligomeric states in the techniques employed in this work. This study has provided evidence of this helicases participation in the SL trans-splicing reaction in booth strains, as well as in several metabolism pathways of the parasite in prociclic form, contributing to the elucidation of the protein functions in trypanosomatids.

Chez les eucaryotes, l’information génétique est transcrite en ARN messager qui subit plusieurs étapes de maturation et évènements d’assemblage avant d’être exporté hors du noyau. Ces modifications du transcrit sont effectuées par de nombreux facteurs protéiques recrutés au transcrit naissant, formant ainsi une particule ribonucléoprotéique (mRNP). La biogenèse du mRNP est étroitement liée avec la transcription et le contrôle qualité afin d’assurer l’efficacité et l’exactitude de la production de mRNPs matures. Des études récentes suggèrent que les membres du complexe THO-Sub2 pourraient être des facteurs cruciaux dans le couplage de la transcription, de la biogénèse du mRNP et de l’export. Dans notre groupe, nous avons mis en oeuvre un essai novateur pour étudier la biogénèse du mRNP et le contrôle qualité, basé sur l’expression du facteur Rho bactérien dans Saccharomyces cerevisiae. Rho interfère avec l’assemblage adéquat du mRNP et génère des transcrits aberrants qui sont dégradés par la machinerie de dégradation nucléaire. Dans cette étude, nous avons utilisé le système expérimental Rho pour mieux comprendre Rrp6 et l’implication de l’exosome dans la dégradation des transcrits liée au contrôle qualité, ainsi que pour mieux caractériser le rôle et la fonction du complexe THO-Sub2 dans le processus de biogénèse du mRNP. Les résultats obtenus révèlent une différence intéressante dans le comportement des membres du complexe THO sous l’action de Rho et dévoilent leur dépendance à la liaison à l’ARN, ce qui n’aurait pas pu être observé avec d’autres techniques expérimentales. Cela confirme le potentiel attendu du système expérimental basé sur Rho dans l’étude des facteurs protéiques impliqués dans la biogénèse et le contrôle qualité du mRNP. / In eukaryotes, the genetic information is transcribed into messenger RNA which undergoes various processing and assembly events prior to its export from the nucleus. These transcript modifications are performed by numerous protein factors recruited to the nascent transcript, thus making a messenger ribonucleoprotein particle (mRNP). mRNP biogenesis is tightly interconnected with both transcription and quality control to ensure efficiency and accuracy in production of mature mRNPs. Recent findings suggest that members of THO-Sub2 complex might be crucial factors in coupling transcription, mRNP biogenesis and export. In our group, we have implemented an innovative assay to study mRNP biogenesis and quality control, based on the expression of the bacterial factor Rho in Saccharomyces cerevisiae. Rho interferes with proper mRNP assembly and generates aberrant transcripts degraded by the nuclear degradation machinery. In this study, we use Rho experimental system to expand our findings on Rrp6 and exosome involvement in quality control degradation of transcripts, as well as to better characterize the role and function of THO-Sub2 complex in the process of mRNP biogenesis. Obtained results reveal an interesting difference in behavior of THO complex members upon Rho action and disclose their dependence on binding to the RNA, which could not be observed by other experimental techniques. This substantiates the expected potential of Rho-based experimental system in the study of protein factors involved in mRNP biogenesis and quality control.

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:43:49Z No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Durante seu processo de evolução, os tripanossomatídeos desenvolveram características distintas de outros eucariotos em relação à sua biologia. Desde a transcrição do DNA no núcleo até tradução do RNA mensageiro no citoplasma, estão envolvidos fatores às vezes únicos, que atuam principalmente na regulação gênica pós-transcricional. Entretanto, o transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma é pouco compreendido nesses parasitas. Análises de genômica comparativa revelaram que somente algumas proteínas envolvidas na exportação estão conservadas em espécies divergentes, como tripanossomatídeos, indicando que essa via pode apresentar fatores diferentes, ainda não identificados, ou ela não é tão especializada e complexa como a via descrita em mamíferos e leveduras. Por isso, a função de componentes da via de exportação de mRNA, buscando entender como esse processo funciona em parasitas merece ser melhor investigada. Este trabalho tem como foco o estudo de uma proteína de 45 kDa de T. cruzi, denominada de Hel45, que apresentou alta similaridade com RNA helicases de transporte, envolvidas com a exportação de mRNA em mamíferos e leveduras. Uma análise de filogenia determinou que Hel45 é a ortóloga da eIF4AIII, uma RNA helicase componente de Exon junction complex (EJC) em células de mamíferos. No entanto, até o momento, não existem publicações descrevendo homólogos de eIF4AIII em tripanossomatídeos. Dados experimentais demonstraram que Hel45 é uma proteína que migra entre o núcleo e o citoplasma devido a um sinal de exportação nuclear (NES) funcional. Esta migração depende da transcrição ativa e do receptor de exportação de mRNA Mex67. As análises fenotípicas de uma linhagem de T. cruzi nocaute de Hel45 mostraram que a ausência da proteína não foi letal ao parasita, mas resultou no atraso do crescimento e diminuiu a taxa de metaciclogênese in vitro. Apesar de não causar o acúmulo de mRNA no núcleo, o nocaute afetou a tradução, pois diminuiu a formação de polissomos e a taxa de tradução. No entanto, este efeito não altera a expressão de proteínas de modo geral, visto que ensaios de proteômica revelaram que o nocaute interfere com a expressão de apenas algumas poucas proteínas, indicando que Hel45 pode estar relacionada à modulação da expressão de genes específicos ou existe uma via/proteína compensatória na ausência de Hel45. Foram obtidas evidências de que Hel45 está presente em complexos ribonucleoproteicos que não estão associados aos polissomos e análises de proteômica identificaram as proteínas destes complexos que devem interagir com Hel45. Dados obtidos até o momento mostraram que Mago e Y14, proteínas de EJC que interagem com eIF4AIII, podem estar associadas com Hel45, assim como, Sub2 e FOP, que são proteínas essenciais para o recrutamento de Mex67 durante exportação de mRNA em outras células eucarióticas. Outra proteína que pode estar interagindo com Hel45 é uma exclusiva de tripanossomatídeos, que contém um domínio NTF2-like, típico de receptores de exportação. Assim, o conjunto de dados obtidos indica que Hel45 está envolvida com o metabolismo de mRNA em T. cruzi. Desta forma, tem sustentação a hipótese de que seu papel seria semelhante à eIF4AIII, agindo como um fator que se associa ao mRNA já durante a etapa transcrição/processamento e que é exportado para o citoplasma.

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A atrazina (ATZ) é um herbicida utilizado em larga escala no Brasil de forma intensiva em culturas de cana-de-açúcar, milho e sorgo. A ATZ possui caráter persistente e recalcitrante, de forma que os tratamentos convencionais de efluentes não são capazes de removê-lo. Nesse contexto, os processos oxidativos avançados, como a fotocatálise heterogênea, têm se mostrado eficientes para remoção deste poluente. Este trabalho tem por objetivo avaliar o desempenho dos fotocatalisadores TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos vlp 7000 modificado com carbono para a degradação do pesticida atrazina em solução aquosa, utilizando um reator fotoquímico com coletor parabólico composto irradiado por um simulador solar. Os catalisadores TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos foram caracterizados por meio de difração de raios-X, espectroscopia de infravermelho, área superficial específica BET e análise de reflectância difusa. As concentrações de TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos empregadas foram 500 e 100 mg L&-1, respectivamente. Os resultados obtidos mostraram significativa remoção de ATZ ao final de 120 minutos (100; 98; 98; 93; 86% para concentrações iniciais de ATZ de 1; 5; 10; 20 e 30 mg L-1, respectivamente) com emprego do catalisador TiO2 P25. No entanto, as análises de carbono orgânico total (COT) indicaram que não houve mineralização significativa da ATZ, com valores inferiores a 20% com o uso do TiO2 P25. Para o catalisador C-TiO2 Kronos não se obteve remoção importante da ATZ ao final de 120 minutos de experimento, quando comparado com o TiO2 P25. Neste caso, o catalisador C-TiO2 Kronos permitiu obter remoções do pesticida de 37; 35; 38; 39 e 45%, aproximadamente, para as concentrações iniciais de ATZ de 1; 5; 10; 20 e 30 mg L-1, respectivamente. Apesar disso, o catalisador C-TiO2 Kronos apresentou melhor desempenho em mineralizar a ATZ a CO2 e H2O em relação ao proporcionado pelo TiO2 P25, com aproximadamente 38% de mineralização. O modelo de Langmuir-Hinshelwood (LH) constitui uma aproximação adequada para a cinética de degradação da atrazina para ambos os catalisadores estudados, com valores de Kr e Kads iguais a 1,54 mg L-1 min-1 e 15,47 L mg-1, respectivamente, para o catalisador TiO2 P25 e de 1,34 mg L-1 min-1 e 132,95 L mg-1, respectivamente para o catalisador C-TiO2 Kronos vlp 7000. / Atrazine (ATZ) is a widely used herbicide in Brazil, where it is intensively applied in sugarcane, corn and sorghum cultivations. However, conventional wastewater treatments are not able to remove ATZ due to its persistent and recalcitrant properties. Advanced oxidation processes, such as heterogeneous photocatalysis, have been proved effective for the removal of this pollutant. This study aims to evaluate the performance of TiO2 P25 and carbon-modified TiO2 Kronos vlp 7000 photocatalysts in the degradation of ATZ in aqueous systems using a tubular photochemical reactor equipped with a compound parabolic collector (CPC) irradiated by simulated solar light. Catalysts TiO2 P25 and C-TiO2 Kronos were characterized by X-ray diffraction, infrared spectroscopy, BET analysis and diffuse reflectance analysis. The concentrations of TiO2 P25 and C-TiO2 Kronos were 500 and 100 mg L-1, respectively. For TiO2 P25, the results showed significant ATZ removals after 120 minutes of irradiation (100; 98; 98; 93; 86% for initial ATZ concentrations of 1; 5; 10; 20, and 30 mg L-1, respectively). In contrast, the total organic carbon (TOC) analyses indicated that no significant ATZ mineralization occurred, with values lower than 20% for TiO2 P25. In comparison with TiO2 P25, C-TiO2 was not able to completely remove ATZ at the end of 120 minutes of irradition. In this case, pesticide removals of about 37; 35; 38; 39 and 45% were obtained for initial ATZ concentrations of 1; 5; 10; 20, and 30 mg L-1, respectively. Nevertheless, C-TiO2 Kronos showed better performance for ATZ mineralization to CO2 and H2O in comparison with TiO2 P25, with approximately 38% total carbon organic removal. The Langmuir-Hinshelwood (LH) model was shown to be an appropriate approximation for the degradation kinetics of atrazine for both catalysts, with values of Kr and Kads equal to 1.54 mg L-1 min-1 and 15.47 mg L-1, respectively, for the P25 TiO2 and 1.34 mg L-1 min-1 and 132.95 mg L-1, respectively, for C-TiO2 Kronos vlp 7000.

A atrazina (ATZ) é um herbicida utilizado em larga escala no Brasil de forma intensiva em culturas de cana-de-açúcar, milho e sorgo. A ATZ possui caráter persistente e recalcitrante, de forma que os tratamentos convencionais de efluentes não são capazes de removê-lo. Nesse contexto, os processos oxidativos avançados, como a fotocatálise heterogênea, têm se mostrado eficientes para remoção deste poluente. Este trabalho tem por objetivo avaliar o desempenho dos fotocatalisadores TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos vlp 7000 modificado com carbono para a degradação do pesticida atrazina em solução aquosa, utilizando um reator fotoquímico com coletor parabólico composto irradiado por um simulador solar. Os catalisadores TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos foram caracterizados por meio de difração de raios-X, espectroscopia de infravermelho, área superficial específica BET e análise de reflectância difusa. As concentrações de TiO2 P25 e C-TiO2 Kronos empregadas foram 500 e 100 mg L&-1, respectivamente. Os resultados obtidos mostraram significativa remoção de ATZ ao final de 120 minutos (100; 98; 98; 93; 86% para concentrações iniciais de ATZ de 1; 5; 10; 20 e 30 mg L-1, respectivamente) com emprego do catalisador TiO2 P25. No entanto, as análises de carbono orgânico total (COT) indicaram que não houve mineralização significativa da ATZ, com valores inferiores a 20% com o uso do TiO2 P25. Para o catalisador C-TiO2 Kronos não se obteve remoção importante da ATZ ao final de 120 minutos de experimento, quando comparado com o TiO2 P25. Neste caso, o catalisador C-TiO2 Kronos permitiu obter remoções do pesticida de 37; 35; 38; 39 e 45%, aproximadamente, para as concentrações iniciais de ATZ de 1; 5; 10; 20 e 30 mg L-1, respectivamente. Apesar disso, o catalisador C-TiO2 Kronos apresentou melhor desempenho em mineralizar a ATZ a CO2 e H2O em relação ao proporcionado pelo TiO2 P25, com aproximadamente 38% de mineralização. O modelo de Langmuir-Hinshelwood (LH) constitui uma aproximação adequada para a cinética de degradação da atrazina para ambos os catalisadores estudados, com valores de Kr e Kads iguais a 1,54 mg L-1 min-1 e 15,47 L mg-1, respectivamente, para o catalisador TiO2 P25 e de 1,34 mg L-1 min-1 e 132,95 L mg-1, respectivamente para o catalisador C-TiO2 Kronos vlp 7000. / Atrazine (ATZ) is a widely used herbicide in Brazil, where it is intensively applied in sugarcane, corn and sorghum cultivations. However, conventional wastewater treatments are not able to remove ATZ due to its persistent and recalcitrant properties. Advanced oxidation processes, such as heterogeneous photocatalysis, have been proved effective for the removal of this pollutant. This study aims to evaluate the performance of TiO2 P25 and carbon-modified TiO2 Kronos vlp 7000 photocatalysts in the degradation of ATZ in aqueous systems using a tubular photochemical reactor equipped with a compound parabolic collector (CPC) irradiated by simulated solar light. Catalysts TiO2 P25 and C-TiO2 Kronos were characterized by X-ray diffraction, infrared spectroscopy, BET analysis and diffuse reflectance analysis. The concentrations of TiO2 P25 and C-TiO2 Kronos were 500 and 100 mg L-1, respectively. For TiO2 P25, the results showed significant ATZ removals after 120 minutes of irradiation (100; 98; 98; 93; 86% for initial ATZ concentrations of 1; 5; 10; 20, and 30 mg L-1, respectively). In contrast, the total organic carbon (TOC) analyses indicated that no significant ATZ mineralization occurred, with values lower than 20% for TiO2 P25. In comparison with TiO2 P25, C-TiO2 was not able to completely remove ATZ at the end of 120 minutes of irradition. In this case, pesticide removals of about 37; 35; 38; 39 and 45% were obtained for initial ATZ concentrations of 1; 5; 10; 20, and 30 mg L-1, respectively. Nevertheless, C-TiO2 Kronos showed better performance for ATZ mineralization to CO2 and H2O in comparison with TiO2 P25, with approximately 38% total carbon organic removal. The Langmuir-Hinshelwood (LH) model was shown to be an appropriate approximation for the degradation kinetics of atrazine for both catalysts, with values of Kr and Kads equal to 1.54 mg L-1 min-1 and 15.47 mg L-1, respectively, for the P25 TiO2 and 1.34 mg L-1 min-1 and 132.95 mg L-1, respectively, for C-TiO2 Kronos vlp 7000.