O presente trabalho teve como objetivo a caracterização da xilanase presente no extrato bruto de Bacillus pumilus, com a finalidade de usá-la na extração de xilana do bagaço de cana-de-açúcar. Foram testados dois meios de cultura em pHs 8,5 e 9,5 com diferentes substratos. As maiores atividades de xilanase foram produzidas em xilana comercial de oat spelts (228 U/mL) e em farelo de trigo (220 U/mL), no pH 8,5. Independentemente das condições de cultivo empregada, não foi detectada atividades de &szlig;-xilosidase, &szlig;-glicosidase e arabinofuranosidase e a produção de endoglucanase foi baixa (< 0,7 U/mL). O perfil de proteínas em eletroforese foi amplo, e a banda com 23 kDa correspondeu a uma xilanase. A xilanase apresentou pH ótimo na faixa de 7-8, temperatura ótima entre 45-50 ºC e se apresentou mais estável a 40 ºC (pH8,0). A hidrólise de xilanas comerciais produziu xilotriose, xilotetraose, xilopentaose e xilo-oligossacarídeos (XOS) com massas maiores, que não foram identificados por cromatografia em camada fina (TLC). A influência de vários fatores, tais como a carga de xilanase, tipo de substrato, temperatura e a adição de vários compostos foi avaliada no rendimento de extração de xilanas desde o bagaço de cana-de-açúcar prétratado. O extrato bruto de B. pumilus, rico em xilanases, foi aplicado em um bagaço pré-tratado com sulfito/álcali, e em um bagaço deslignificado por clorito em meio ácido, evidenciando que a menor quantidade de lignina residual como principal fator para aumentar a extração de xilana, aumentando a extração de 4,2 para 42,5%. A lavagem extensiva do material pré-tratado com sulfito alcalino também auxiliou no aumento do rendimento de xilana, de 18,5 para 25,1 %. Foram testadas outras alternativas para aumentar o rendimento de hidrólise da xilana do bagaço pré-tratado, sem a necessidade da lavagem do material. A reutilização do licor sulfito alcalino, a adição de tween 80, polietileno glicol, albumina não favoreceram a extração de xilanas, enquanto que a adição de MgSO4 teve um pequeno efeito positivo na extração da xilana (de 18% para 20,9 %). A extração alcalina a frio, realizada após a extração enzimática, influenciou positivamente o rendimento de extração da xilana do bagaço pré-tratado com 10% Na2SO3/5%NaOH. A extração de xilana obtido pela aplicação de xilanase (20 U/g) seguida da extração com 20% de NaOH produziu o mesmo resultado que utilizando apenas NaOH (70%), de 24,1 e 24,9 %, respectivamente. A extração enzimática da xilana permitiu a obtenção de um resíduo com características favoráveis para a completa sacarificação, com Cellic CTec2 na carga de 10 FPU/g de material. / The present work aimed to characterize the xylanase present in the crude extract of Bacillus pumilus, with the purpose of using it in the xylan extraction of the sugarcane bagasse. Two culture media were tested at pHs 8.5 and 9.5 with different substrates. The highest xylanase activities were produced in commercial xylan oat spelled (228 U / mL) and wheat bran (220 U / mL) at pH 8.5. Regardless of the culture conditions employed, &szlig;xylosidase, &szlig;-glycosidase and arabinofuranosidase activities were not detected and endoglucanase production was low (<0.7 U/mL). The protein profile on electrophoresis was extensive, and the 23 kDa band corresponded to a xylanase. The xylanase presented optimum pH in the range of 7-8, optimal temperature between 45-50ºC and was more stable at 40 ºC (pH8.0). Hydrolysis of commercial xylanes produced xylotriose, xylotetraose, xylopentaose and xylooligosaccharides (XOS) with larger masses, which were not identified by thin layer chromatography (TLC). The influence of various factors, such as xylanase loading, substrate type, temperature and the addition of various compounds was evaluated in the xylan extraction yield from the pretreated sugarcane bagasse. The crude extract of B. pumilus, rich in xylanases, was applied to a bagasse pretreated with sulfite/alkali, and to a bagasse delignified by chlorite in acid medium, showing that the lower amount of residual lignin as the main factor to increase the extracting xylan, increasing the extraction from 4.2 to 42.5%. Extensive washing of the alkaline sulfite pretreated material also assisted in increasing xylan yield, from 18.5 to 25.1%. Further alternatives were tested to increase the hydrolysis yield of pretreated bagasse xylan without the need for material washing. The reuse of the alkali sulfite liquor, the addition of tween 80, polyethylene glycol, albumin did not favor xylan extraction, while addition of MgSO4 had a small positive effect on xylan extraction (from 18% to 20.9%). The cold alkaline extraction, after enzymatic extraction, positively influenced the xylan extraction yield of the pretreated bagasse with 10% Na2SO3/5% NaOH. Extraction of xylan obtained by applying xylanase (20 U / g) followed by extraction with 20% NaOH produced the same result as using only NaOH (70%), 24.1 and 24.9%, respectively. The enzymatic extraction of xylan allowed to obtain a residue with favorable characteristics for the complete saccharification, with Cellic CTec2 in the load of 10 FPU / g of material.

O presente trabalho teve como principal objetivo selecionar uma linhagem termotolerante de Kluyveromyces marxianus e avaliar a sua aplicação em processos de produção de etanol a partir da celulignina de palha de arroz. Inicialmente, foram avaliadas oito diferentes linhagens de K. marxianus em meio semissintético contendo 50 g/L de glicose sob temperatura de 45 °C. De acordo com os principais parâmetros fermentativos obtidos, a linhagem K. marxianus NRRL Y-6860 foi selecionada e o efeito da oxigenação do meio sobre os parâmetros fermentativos desta levedura foi realizado de acordo com um planejamento experimental 22. Os resultados revelaram que a produção de etanol foi favorecida nas menores condições de agitação e aeração estudadas (100 rpm e relação Vfrasco/Vmeio de 2,5) sendo obtido um valor de conversão de glicose em etanol (YP/S) de 0,44 g/g e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,63 g/L.h. Nestas condições, K. marxianus NRRL Y-6860 foi também capaz de fermentar elevada concentração de glicose (112 g/L), apresentando valores de YP/S = 0,42 g/g e QP = 3,24 g/L.h. Numa segunda etapa, ensaios de sacarificação da celulignina (8% m/v) permitiram definir a carga de Cellubrix (25 FPU/g) e Novozyme 188 (25 UI/g) as quais promoveram um rendimento de hidrólise de aproximadamente 50 % em 12 horas. A celulignina foi obtida após o pré-tratamento da palha de arroz com H2SO4 diluído e apresentou a seguinte composição (g/100g de matéria seca): celulose (54,9), hemicelulose (7,9), lignina (24,9) e cinzas (8,0). Para os ensaios de sacarificação e fermentação da celulignina com a levedura K. marxianus NRRL Y-6860 duas estratégias foram avaliadas: 1) sacarificação e fermentação em separado (SHF), com e sem inativação das enzimas e 2) sacarificação e fermentação simultânea (SSF) em que o inóculo e as enzimas foram adicionados no início do processo. Os resultados revelaram que na estratégia SHF a inativação das enzimas antes da inoculação não influenciou o desempenho fermentativo da levedura. Além disso, o emprego de um maior teor de celulignina (12 % m/v) proporcionou um ganho de 42 % na produtividade total do processo (QPT) em relação ao teor de 8 % (m/v), atingindo o valor de 0,97 g/L.h. O emprego da estratégia SSF a partir de 8 % (m/v) de celulignina permitiu um incremento de 177 % e 287 % nos valores de QPT quando comparados ao processo SHF com 12 e 8 % de celulignina (m/v), respectivamente. Ensaios de SSF com Saccharomyces cerevisiae mostraram que para ambas as temperaturas avaliadas (30 °C ou 45 °C) a termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 mostrou-se superior com relação a produtividade total do processo. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que a levedura termotolerante K. marxianus NRRL Y-6860 é um micro-organismo em potencial para produção de etanol celulósico a partir da estratégia SSF devido aos elevados valores de produtividade volumétrica (QPT = 2,69 g/L.h) obtidos a partir da celulignina de palha de arroz. / This work aimed to select a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus and evaluate its application on ethanol production by using rice straw cellulignin. Initially, were evaluated eight different strains of K. marxianus on semi-synthetic media containing 50 g/L of glucose at 45 °C. According to the main fermentation parameters, the strain K. marxianus NRRL Y-6860 was selected and the effect of oxygenation on ethanol production by this yeast was investigated through a 22 factorial design. The best results of ethanol yield factor (YP/S = 0.44 g/g) and ethanol volumetric productivity (QP = 3.63 g/L.h) were found at the lowest agitation and aeration conditions (100 rpm and 2.5 Vflask/Vmedium ratio) employed. Under this conditions, K. marxianus NRRL Y-6860 was also able to ferment at high glucose concentration (112 g/L), with values of YP/S = 0.42 g/g and QP = 3.24 g/L.h. In a second step, the effect of Cellubrix loading and its supplementation with Novozyme 188 on the cellulignin saccharification were evaluated. The results showed that the highest hydrolysis yield (50 %) was attained when a load of Cellubrix (25 FPU/g dry matter) and Novozyme 188 (25 IU/g dry matter) was used. The cellulignin obtained from dilute sulfuric acid pretreatment of rice straw showed the following composition (g/100g dry matter): cellulose (54.9), hemicellulose (7.9), lignin (24.9) and ash (8.0). For the studies of cellulignin saccharification and fermentation with K. marxianus NRRL Y-6860 two strategies were evaluated: 1) Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF), with and without inactivation of enzymes, which inoculum was added after the hydrolysis step and 2) Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF), which inoculum and enzymes were added at the beginning of the process. The results revealed that the enzyme inactivation step prior to inoculation in SHF did not influence the yeast\'s fermentation performance. In addition, the use of a higher loading of cellulignin (12 % w/v) increased the overall ethanol productivity (QPT) in 42 %, reaching a value of 0.97 g/L.h as compared to the loading of 8 % (w/v). The SSF process from 8 % (w/v) of cellulignin increased the values of QPT in 177 % and 287 % when compared to SHF loading of 12 and 8 % (w/v), respectively. By using Saccharomyces cerevisiae in SSF process under different temperatures (30 °C or 45 °C) the overall ethanol productivity was lower in relation with the thermotolerant K. marxianus NRRL Y-6860. Based on the experimental results of this work, it can be concluded that K. marxianus NRRL Y-6860 herein selected represents a potential microorganism to application on ethanol production from lignocellulosic materials in SSF process due to its high fermentative potential at elevated temperatures.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-03-29T11:29:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 890046 bytes, checksum: c64c252fc31992d05ef9ec060e3b832d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T11:29:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 890046 bytes, checksum: c64c252fc31992d05ef9ec060e3b832d (MD5) Previous issue date: 2015-07-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fontes de energia alternativas e sustentáveis têm recebido enorme atenção devido ao aumento dos preços, da esgotabilidade e dos problemas ambientais associados ao petró- leo, tornando a produção de biocombustíveis de segunda geração um objeto de grande interesse internacional. As gramíneas são as principais fontes destes biocombustíveis, e Brachypodium distachyon foi eleita um modelo para o estudo das gramíneas. Plantas em estágio juvenil foram avaliadas após o tratamento por duas semanas com metil jas- monato (MJ) ou ácido salicílico (AS) (ambos 100 μM). Os dois tratamentos reduziram o alongamento foliar, provavelmente resultante do efeito da inibição da elongação celu- lar e divisão celular associadas com o aumento do ácido ferúlico (FA), ácido p- cumárico (p-CA) e ABA, e com a redução no teor de AIA. A aplicação de MJ e AS também produziu vários efeitos na parede celular das folhas, como o aumento da celu- lose (MJ), xilose, arabinose e galactose (ambos tratamentos), aumento das razões arabi- nose/celulose (AS) e parede celular/massa seca total (MJ), e redução do teor de lignina (AS). Em paralelo a estas mudanças, houve aumento de fenóis solúveis totais, ácido cafeico e naringerina (para ambos tratamentos), e ácido sinápico (AS). Estas alterações não foram explicadas por mudanças na expressão de 12 genes da rota de biossíntese da parede estudados. A aplicação de AS reduziu em 15% a eficiência da sacarificação en- zimática. Este efeito foi fortemente correlacionado negativamente com o aumento de FA, p-CA, e arabinose, mas não se correlacionou com o teor de lignina. Embora o tra- tamento com MJ tenha aumentado os teores de FA e p-CA, este efeito foi contraposto pelo simultâneo aumento da celulose. Os resultados obtidos demonstram a importância do AS e do MJ para a regulação dos componentes e da digestibilidade da parede celu- lar, e a influência dos metabólitos secundários na recalcitrância da parede à sacarificação. / Renewable and sustainable sources of energy have received a lot of attention, due to the price fluctuations and environmental issues associated with the depletion of oil re- serves, prompting worldwide interest in the production of second generation biofuels. Grass species are the main biomass resources used in biofuel production, and Brachy- podium distachyon was described as a model species for grasses and cereals. Juvenile plants were analyzed after two weeks treatment with methyl jasmonate (MJ) or salicylic acid (SA) (both at 100 μM). Both treatments reduced leaf growth rate, probably be- cause of an inhibitory effect on cellular elongation and division, caused by an increase in ferulic acid (FA), p-coumaric acid (p-CA) and ABA, and lower levels of IAA. Modi- fications in cell wall compounds were observed mainly in leaf tissues, such as an in- crease of cellulose (MJ), xylose, arabinose and galactose (both treatments), arabi- nose/cellulose ratio (SA), and cell wall/biomass ratio (MJ), and reduction of lignin con- tent (SA). There was an increase in total phenolic content, cafeic acid and narigenin (for both treatments), and in sinapic acid (SA). Alterations of these compounds could not be related to the expression of 12 genes involved in cell wall biosynthesis. The ap- plication of SA reduced in 15% the saccharification yield. This effect was strongly neg- ative correlated with higher levels of FA, p-CA and arabinose, but was not associated with lignin content. MJ treatment also increased the levels of FA and p-CA, but chang- es in saccharification yield were not observed, possibly caused by an increase in cellu- lose content. These results show the importance of SA and MJ in the regulation of cell wall compounds and digestibility, and the influence of secondary metabolites in cell wall saccharification recalcitrance. / Dissertação enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-07. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:55Z : No. of bitstreams: 1 000846173_20160507.pdf: 175843 bytes, checksum: cc1b5a4632f6867bdd6b16501c5e684d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-09T17:15:59Z: 000846173_20160507.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-09T17:16:41Z : No. of bitstreams: 1 000846173.pdf: 2029632 bytes, checksum: e355dd2ad8b2cd1af7fdc1e7c65acf03 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Celulases são essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos visando à produção de etanol de segunda geração. A fermentação em estado sólido é um processo que proporciona altas concentrações de enzimas que podem ser aplicadas nessa hidrólise. O objetivo do presente trabalho foi produzir enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas empregando os fungos Trichoderma reesei e Myceliophthora thermophila por fermentação em estado sólido em biorreator de leito empacotado e aplicar essas enzimas, combinadas ou não, na sacarificação de bagaço de cana-deaçúcar. Foram empregados bagaço in natura, bagaço pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e bagaço com pré-tratamento hidrotérmico. A produção de enzimas foi avaliada pelas atividades CMCase, atividade sobre papel de filtro (FPU), xilanase e β-glicosidase. Para os experimentos de sacarificação com extratos dos fungos não combinados, foi adotado um planejamento de superfície de resposta central composto com 5 repetições do ponto central, tendo como fatores o volume de extrato enzimático e o tempo de hidrólise. Os resultados com os dois extratos indicaram como ótimos um volume de 7,0 mL e 6 horas de hidrólise para os bagaços in natura, pré-tratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino e com pré-tratamento hidrotérmico, exceto o extrato de M. thermophila que resultou em 5,0 mL e 6,8 horas para o bagaço hidrotérmico. Os melhores resultados de conversão em glicose com os dois extratos foram obtidos com o bagaço prétratado com ozônio e irradiação de ultrassom em meio alcalino, tendo sido de 34,0 % para M. thermophila e de 21,2 % para T. reesei. A partir destes resultados, foi elaborado um planejamento fatorial completo para os experimentos de hidrólises empregando coquetéis enzimáticos. Os fatores empregados foram composição (1:1; 1:3; 3:1) e temperatura... / Cellulases are essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials aiming to the production of second generation ethanol. The solid-state fermentation is a process that allows obtaining high concentrations of enzymes which can be applied in this hydrolysis. The purpose of the current work was producing cellulolytic and hemicellulolytic enzymes by employing the fungi Trichoderma reesei and Myceliophthora thermophila by solid-state fermentation in packed-bed bioreactor and apply these enzymes, combined or not, in the saccharification of sugarcane bagasses. Bagasse in natura, bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and bagasse with hydrothermal pretreatment have been employed. The enzymes production was evaluated by CMCase, filter paper activitie (FPU), xylanase and β-glucosidase activities. For the saccharification experiments with extracts from both fungi no-combined, it has been adopted a central-composed response surface design with 5 replications of the central point, having as factors the volume of enzyme extract and the duration of hydrolysis. The results with both extracts indicated as optimal a volume of 7,0 mL and 6 hours of hydrolysis for the bagasses in natura, pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium and with hydrothermal pretreatment, except the extract of M. themophila that resulted in 5,0 mL and 6,8 hours for the hydrothermal bagasse. The best results of conversion in glucoses with both extracts were obtained with the bagasse pretreated with ozone and ultrasound irradiation in alkaline medium, which have been 34,0 % for M. themophila and 21,2 % for T. reesei. From these results, it has been elaborated a full factorial design for the hydrolysis experiments employing enzymatic cocktails. The factors used were composition (1:1; 1:3; 3:1) and temperature (45, 55, 65 ºC and alternated). The best result was obtained by... / FAPESP: 2013/1756-1

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-21Bitstream added on 2015-04-09T12:47:18Z : No. of bitstreams: 1 000811719.pdf: 610346 bytes, checksum: 43ef4062346b4ecd81a0a778e882bcf9 (MD5) / O capitulo 1 deste trabalho descreve o Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar e avalia a sua sacarificação enzimática a partir de diferentes extratos enzimáticos dos fungos Penicillium viridicatum RFC3, Trichodermareesei QM9414, Thermoascus aurantiacus CBMAI756 e Thermomyces lanuginosus, obtidos a partir da fermentação estado sólido. Dentre essas fermentações, o melhor resultado individual de eficiência de hidrólise foi obtido com o extrato enzimático do fungo T.aurantiacus, o qual foi então utilizado na sacarificação dos bagaços pré-tratados com espécies reativas de oxigênio. A melhor taxa de sacarificação foi obtida no bagaço pré-tratado com NaClO, que resultou em 19,8% de rendimento, contra 12,2% no bagaço in natura. O capitulo 2 do trabalho descreve a importância do sinergismo e da inibição enzimática, na forma da β-glicosidase, na sacarificação do bagaço. Foi verificado sinergismo entre os extratos enzimáticos dos fungos P.viridicatum e T.reesei e a melhor combinação dos dois extratos foi na proporção 1:1, resultando na liberação de 0,73 mg/mL de glicose. As atividades de β-glicosidases presentes nos extratos enzimáticos foram avaliadas quanto aos efeitos de inibição por glicose. Os parâmetros cinéticos Km e Vmax foram obtidos com a enzima do T. aurantiacus sem inibidor apresentou Vmáx 4,60 μmol/min e Km 0,31 mM e com glicose Vmáx 2,3 μmol/min e Km 0,37 mM. Sem glicose a enzima do P. viridicatum apresentou Vmáx 166,7 μmol/min e Km 0,2mM e com glicose Vmáx 13,8 μmol/min e Km 1,2 mM. A β- glicosidase do T.aurantiacus sofreu inibição não-competitiva, enquanto a enzima do P.viridicatum sofreu inibição mista. Também foram avaliados os efeitos da frutose e da glicose isomerase como supressora do efeito inibidor da glicose. A presença da frutose proporcionou um efeito positivo nas atividades de β-glicosidases desses fungos. A sacarificação do bagaço de cana com a combinação ... / The first chapter of this work describes the pretreatment of sugarcane bagasse cane and evaluates its enzymatic saccharification from different enzymatic extracts of Penicillium viridicatum RFC3, Trichoderma reesei QM9414 , Thermoascus aurantiacus and Thermomyces lanuginosus CBMAI756 obtained from the solid state fermentation. Among these fermentations, the best individual result of hydrolysis efficiency was obtained with the enzymatic extract of the fungus T.aurantiacus, which was then used in the saccharification of bagasse pretreated with reactive oxygen species . The best rate of saccharification was achieved on bagasse pretreated with NaClO resultins in 19.8 % of yield, versus 12.2% in the bagasse in natura. The chapter 2 of this work describes the importance of synergism and inhibition of the enzyme in the form of β - glucosidase in the saccharification of bagasse. Synergism between the enzymatic extracts of fungi P.viridicatum and T.reesei the best combination of the two extracts was observed for the ratio 1:1, resulting in the release of 0.73 mg / mL glucose . The activities of β - glucosidase enzyme present in the extracts were analyzed for the effects of inhibition by glucose. The kinetic parameters Km and Vmax of the β-glucosidase enzyme presented, in case of T. aurantiacus Vmax of 4.60 μmol/min and Km 0.31 mM and with glucose Vmax 2.3 μmol/min and Km 0.37 mM. For the enzyme from P.viridicatum values were Vmax 166.7 μmol/min and Km 0.2 mM and with glucose Vmax 13.8 μmol/min and Km 1.2 mM. The β-glucosidase T.aurantiacus suffered from non-competitive inhibition, while P.viridicatum suffered mixed enzyme inhibition. We also evaluated the effects of fructose and glucose isomerase as suppressing the inhibitory effect of glucose. The presence of fructose resulted in a positive effect on the β - glucosidase activity of these fungi. The saccharification of sugarcane bagasse with the combination of glucose isomerase enzyme ...

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cassava is an important source of nutrients, and also of great importance as agro-industrial raw materials and can be used to produce ethanol. Through the process of hydrolysis, acid or enzyme, starch is converted into sugars. The hydrolyzed by enzymes are the most important commercial modified starches such as dextrins, maltose, etc. This paper aims at the use of cassava "in natura" disposal, to determine the optimal conditions for hydrolysis step, through the use of pectinolytic and amylolytic enzymes. We developed a Central Composite Rotational Design, 24, with four repetitions of the center point and eight trials with the axial points, which were used as independent variables pectinase dosage (0; 2,35; 4,7; 7,05 and 9,4 μL/g mat.seca) dose of amyloglucosidase (0,36; 0,52; 0,68; 0,84 and 1μL/g starch), diluting the cassava/water (1:1; 1:1,41; 1:2; 1:2,59 and 1:3) and hydrolysis time (4, 21, 38, 55 and 72 hours after the addition of the last enzyme) being kept constant dose of α-amylase (0.8mL/g starch) for all tests. The dependent variables analyzed were °Brix and efficiency of hydrolysis. The Brix is directly related to the amount of soluble solids, and therefore the greatest value found was 19°Brix, who used the test dilution cassava/water 1:1, independent of changes in other factors. The optimum process conditions was found using the following parameters: Dosage of amyloglucosidase of 0,84mL/g starch; pectinase dosage of 7,05mL/g mat.seca; Dilution of cassava solution/water 1:1,41, and hydrolysis time (after the last addition of enzyme) for 21 hours, with an efficiency of 100% hydrolysis. The presence of pectinase did there was a 20% increase in the efficiency of hydrolysis, compared with trials that have not used it. / A mandioca é uma importante fonte de nutrientes, e também de grande importância como matéria-prima agroindustrial, podendo ser utilizada para a produção de etanol. Através do processo de hidrólise, ácida ou enzimática, o amido é convertido em açúcares. Os hidrolisados por enzimas são os mais importantes amidos modificados comerciais, como dextrinas, maltoses, etc. Este trabalho objetivou a utilização da mandioca in natura , de descarte, para a determinação das condições ótimas para a etapa de hidrólise, através da utilização de enzimas amilolíticas e pectinolítica. Foi desenvolvido um Delineamento Composto Central Rotacional, 24, com 4 repetições do ponto central e 8 ensaios com os pontos axiais, onde foram utilizados como variáveis independentes dosagem de pectinase (0; 2,35; 4,7; 7,05 e 9,4μL/g de mat.seca), dosagem de amiloglicosidase (0,36; 0,52; 0,68; 0,84 e 1μL/g de amido), diluição da solução mandioca/água (1:1, 1:1,41, 1:2, 1:2,59 e 1:3) e tempo de hidrólise (4, 21, 38, 55 e 72 horas, após adição da última enzima), sendo mantido constante a dosagem de α-amilase (0,8μL/g amido) para todos os ensaios. As variáveis dependentes analisadas foram °Brix e Eficiência da hidrólise. O Brix está diretamente relacionado com a quantidade de sólidos solúveis, logo o maior valor encontrado foi de 19°Brix, no ensaio que utilizou a diluição mandioca/água 1:1, independente da variação dos demais fatores. A condição ótima de processo foi encontrada com a utilização dos seguintes parâmetros: Dosagem de amiloglicosidase de 0,84μL/g de amido; Dosagem de pectinase de 7,05μL/g de mat.seca; Diluição da solução mandioca/água de 1:1,41 e tempo de hidrólise (após a adição da última enzima) de 21 horas, com uma eficiência de hidrólise de 100%. A presença da pectinase fez que houvesse um aumento de 20% na eficiência da hidrólise, comparada com ensaios que não a utilizaram.

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Diogo pdf.pdf: 2699953 bytes, checksum: 09315b0edaa52c24cb3e4ee84d5626e7 (MD5) Previous issue date: 2011-06-20 / The Tiquira is a distilled alcoholic beverage prepared from the saccharification and subsequent fermentation of cassava. The processes of saccharification and fermentation are performed by micro-organisms that grow naturally in beijus exposed to the environment. The growth of these micro-organisms occurs over a period of approximately 8 days and as many strains are collected, the process yield and the quality of distillate are compromised. The objective is therefore to improve the quality of spirit cassava (Tiquira) produced in the state of Maranhão through the identification and selection of the best micro-organisms and fermentation and saccarifiying employed in artisanal process. The selected strains were subjected to studies, which identified the presence of filamentous fungi, bacteria and yeast. We identified three (3) species of filamentous fungi: Aspergillus niger, Aspergillus flavus and Rhizopus oryzae, which were tested before their power of sporulation in different culture media at 30oC, and the SDA medium provided the best composition for obtaining the fungal growth more quickly. Samples of R.oryzae, A.niger and A.flavus previously shown to be the best producers were selected for testing enzymatic saccharification of starch to evaluate and confirm the ability of conversion to glucose. The strain R. oryzae reached a conversion value of 78.02% on average using a standard temperature of 30oC, amount of 5.5 x 107 spores, pH 5 and 50g/l of soluble starch, giving a greater yield of saccharification, followed by A.flavus 71.55%, A.niger 57.17% and mixture of spores 48,02%. Therefore, it is evident that the use of filamentous micro-organisms native becomes an option for use in starch saccharification samples. / A Tiquira é uma bebida alcoólica destilada e preparada a partir da sacarificação e posterior fermentação da mandioca. Os processos de sacarificação e fermentação são realizados por micro-organismos que se desenvolvem naturalmente nos beijus expostos ao meio ambiente. O crescimento desses micro-organismos ocorre por um período aproximado de 8 dias e, como são diversas as linhagens coletadas, o rendimento do processo bem como a qualidade do destilado ficam comprometidos. O objetivo deste trabalho é, portanto, o de contribuir para a obtenção de uma maior qualidade da aguardente de mandioca (Tiquira) produzida no estado do Maranhão através da identificação e seleção dos melhores micro-organismos sacarificantes e fermentativos empregados no processo artesanal. As cepas selecionadas foram submetidas a estudos, onde identificamos a presença de fungos filamentosos, bactérias e uma levedura. Foram identificadas 3 (três) espécies de fungos filamentosos: Aspergillus niger, Aspergillus flavus e Rhizopus oryzae, os quais foram testados perante o seu poder de esporulação em diferentes meios de cultura a 30oC, tendo o meio SDA (Saboroud Dextrose Ágar) fornecido a melhor composição para o obtenção do crescimento dos fungos mais rapidamente. As amostras de R. oryzae, A. niger, A. flavus e a mistura destes esporos, que previamente mostraram ser melhores produtoras enzimáticas foram selecionadas para testes de sacarificação do amido para avaliar e confirmar a capacidade de conversão à glicose. A cepa R. oryzae alcançou um valor de conversão de 78,02% em média utilizando-se uma temperatura padrão de 30oC, quantidade de esporos 5,5 x 107, pH 5 e 50g/l de amido solúvel, obtendo o maior rendimento de sacarificação, seguida pelo A. flavus 71,55% , A. niger 57,17% e mistura dos esporos 48,02%. Portanto, evidencia-se que a utilização de micro-organismos filamentosos autóctones torna-se uma opção para uso em sacarificação de amostras amiláceas.

Orientador: Roberto da Silva / Resumo: Esta tese aborda a produção de enzimas celulolíticas por cultivo sólido (CS) dos fungos termofílicos Myceliophthora thermophila I-1D3b e Thermoascus aurantiacus CBMAI756 e do mesofílico Trichoderma reesei QM9414 em substrato composto por bagaço de cana-deaçúcar (BC) e farelo de trigo (FT); a caracterização dos extratos obtidos quanto a temperatura e pH ótimos e a estabilidade; a formulação de coquetéis enzimáticos para aplicação na hidrólise de bagaço de cana não tratado (BNT), pré-tratado com ozônio, álcali e ultrassom (BOU) e com pré-tratamento hidrotérmico (BHT); e, por fim, as condições e a cinética da reação de sacarificação enzimática. O CS de M. thermophila levou à obtenção de extratos com as maiores atividades de endoglucanase (32 U/mL), β-glicosidase (3,5 U/mL) e FPA (0,7 U/mL). Os extratos apresentaram diferentes perfis de atividade e estabilidade em função de variações de pH e temperatura de reação e incubação, características desejáveis para aplicação na hidrólise de biomassa visando a produção de etanol de segunda geração (E2G). Após 24 h de hidrólise, maiores rendimentos em açúcares redutores totais (ART) foram atingidos empregando coquetel 1:1 v/v de extratos enzimáticos provenientes do CS de T. aurantiacus (TA) e T. reesei (TR) no BOU. Foi possível obter maior teor de ART (464 mg/g BOU vs. 396 mg/g BOU) com menor carga enzimática (9,9 FPA/g BOU com coquetel TA:TR 1:1 v/v vs. 12,6 FPA/g BOU com extrato de TA, respectivamente). Denota-se que há sinergismo entre ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This thesis addresses the production of cellulolytic enzymes by solid cultivation (CS) of the thermophilic fungi Myceliophthora thermophila I-1D3b and Thermoascus aurantiacus CBMAI756 and of the mesophilic Trichoderma reesei QM9414 on a substrate composed of sugarcane bagasse (SCB) and wheat bran (WB); the characterization of the extracts obtained in terms of optimum temperature and pH and stability; the formulation of enzymatic cocktails for application in the hydrolysis of untreated SCB (BNT), pretreated with ozone, alkali and ultrasound (BOU) and with hydrothermal pretreatment (BHT); and, finally, the conditions and kinetics of the enzymatic saccharification reaction. The CS of M. thermophila provided extracts with the highest activities of endoglucanase (32 U/mL), β-glucosidase (3.5 U/mL) and FPA (0.7 U/mL). The extracts showed different profiles of activity and stability due to variations in pH and temperature of reaction and incubation, desirable characteristics for application in the hydrolysis of biomass aiming the production of second generation ethanol (E2G). After 24 h of hydrolysis, higher yields of total reducing sugars (TRS) were achieved using cocktail 1:1 v/v of enzymatic extracts from the CS of T. aurantiacus (TA) and T. reesei (TR) in BOU. It was possible to obtain a higher TRS content (464 mg/g BOU vs. 396 mg/g BOU) with lower enzyme load (9.9 FPA/g BOU with cocktail TA:TR 1:1 v/v vs. 12.6 FPA /g BOU with TA extract, respectively). It denotes there is syner... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

O presente trabalho tem como objetivo estudar as modificações ocorridas na cana-de-açúcar, com diferentes composições químicas e estruturais, pelo pré-tratamento sulfito alcalino. A remoção de lignina e hemicelulose, bem como a introdução de grupos sulfônicos em cana-de-açúcar que ocorrem durante o pré-tratamento sulfito alcalino tornam mais fácil a hidrólise da celulose. A compreensão das modificações químicas e físicas em materiais lignocelulósicos que ocorrem durante este pré-tratamento é fundamental para a geração de processos mais eficazes. Neste trabalho, bagaço e entrenós de cana-de-açúcar, selecionados de plantas híbridas com composição química variada, foram pré-tratados em condições brandas com 10% de sulfito e 5% de hidróxido de sódio por diferentes tempos. No início do pré-tratamento, a deslignificação aumentou rapidamente, o mesmo não aconteceu com a hemicelulose. Nos primeiros 30 min de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar houve remoção de 50% da lignina inicial e 30% da hemicelulose, o que ocasionou uma melhora significativa na conversão de celulose, atingindo 64%. Mesmo sem remoção adicional de lignina e hemicelulose, o processo continuou a introduzir os grupos ácidos, o que contribuiu para o inchamento da fibra. A largura da fibra do bagaço não tratado aumentou de 10,4 ?m para 30 ?m no material pré-tratado com 120 min. Estas modificações na fibra foram responsáveis pelo aumento na eficiência da hidrólise enzimática da celulose, a qual atingiu 92%. Híbridos experimentais com teores reduzidos de lignina apresentaram taxas iniciais de hidrólise mais elevadas e um menor tempo de pré-tratamento para alcançar a conversão total de celulose do que a cana de referência. Diferentes regiões (medula, interface, córtex e fração externa) dos entrenós das canas foram hidrolisadas por celulases. O pré-tratamento da interface, córtex e fração externa com sulfito-alcalino produziu substratos menos recalcitrantes com o aumento do tempo de reação e resultou na melhora da hidrólise enzimática. Foram utilizadas várias técnicas para avaliar as mudanças que ocorreram durante o pré-tratamento, as quais foram capazes de estudar a morfologia da superfície e as características químicas das amostras. O tratamento químico ocasionou uma intensa deslignificação e alterações morfológicas nas superfícies das fibras da cana-de-açúcar. A redução na absorção a 285 nm e 315 nm das paredes celulares das fibras, parênquima e dos vasos aumentou substancialmente os valores de conversão enzimática da celulose e da hemicelulose. Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM) revelou que as fibras da região do córtex e, especialmente, da interface mostrou paredes celulares colapsadas após a parcial deslignificação. Após o tratamento sulfito alcalino, os dados de espectroscopia fotoelétrica de raio-X (XPS) e espectrometria de massa de íons secundários por tempo de vôo (TOF-SIMS) apresentaram um aumento das intensidades dos sinais nas superfícies das fibras, os quais foram atribuídos à presença de carboidratos em algumas amostras. Em conformidade, os sinais de lignina diminuíram nas superfícies das fibras das mesmas amostras. / The present work aims to study the changes occurring in sugar cane, with different in structure and chemical compositions, by sulfite-alkaline pre-treatment. Removing lignin and hemicellulose as well as introducing sulfonic groups in sugar cane pretreated with alkaline sulfite made cellulose hydrolysis easier. Understanding the chemical and physical alterations occurring during this pretreatment of lignocellulosic materials is fundamental for the generation of effective pretreatment methods. In the present work, sugarcane bagasse and also sugar cane internodes, selected from experimental hybrid plants, were pretreated with the alkaline-sulfite process under mild conditions with varied cooking times. The first 30 min of pretreatment of sugar cane bagasse, which removed approximately half of the initial lignin and 30% of hemicellulose seemed responsible for a significant enhancement of the cellulose conversion level, which reached 64%. After the first 30 min of pretreatment, delignification increased slightly and hemicellulose removal was not enhanced. However, the process continued to introduce acid groups into the residual lignin that enhanced the fiber swelling up to 120 min of cooking. The fiber widths increased from 10,4 ?m in the untreated bagasse to 30 ?m in the 120 min-pretreated material. These changes were responsible for an additional increase in the efficiency of enzymatic hydrolysis of the cellulose, which reached 92%. Experimental hybrids with less original lignin presented higher initial hydrolysis rates than reference sugar cane and required lower time of pretreatment to achieve the total cellulose conversion. Different regions (pith, interface, rind and outermost fraction) of the internodes of types of sugarcanes were hydrolyzed by cellulases. The pretreatment of the interface, rind and outermost fraction with alkaline sulfite produced less recalcitrant substrates with increasing reaction time and resulted in improvement enzymatic hydrolysis. Several techniques enabling the study of surface morphological and chemical characteristics were used to evaluate the changes occurring during the pretreatment step. The chemical treatment caused intense delignification and morphological changes on the sugar cane fiber surfaces. The reduction in the absorption at 285 nm and 315 nm of the cell walls of the fibers, parenchyma and vessel, substantially increased the values of enzymatic conversion of cellulose and hemicellulose. Field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) indicated that the fibers from rind regions and especially from the interface showed collapsed cell walls after partial delignification. After the alkaline sulfite treatment, X-ray photoelectrom spectroscopy (XPS) and time-of-flight-secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) data showed increased signal intensities on the fibers surfaces assigned to carbohydrates of some samples. In accordance, the lignin signals diminished on the fiber surfaces of the same samples.