A detecção de Salmonella sp. é fundamental nos programas de controle de salmonelose. Métodos de detecção mais eficientes permitem uma melhor determinação do nível de infecção dos rebanhos, um melhor entendimento da epidemiologia da infecção por Salmonella sp. e o desenvolvimento de programas de controle do patógeno, que visem a segurança biológica do alimento. Nos métodos convencionais, o enriquecimento seletivo é uma etapa crítica, pois inibe a microbiota competitiva e permite a multiplicação de Salmonella sp. Vários caldos de enriquecimento seletivo têm sido comparados quanto à eficiência na recuperação de Salmonella sp. a partir de alimentos, contudo existem poucos estudos relativos a fezes de suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos. Numa primeira fase, amostras de fezes foram contaminadas artificialmente e os caldos Rappaport-Vassiliadis incubado a 42°C (RV), Tetrationato Müller-Kauffmann a 37°C (TMK37) e 42°C (TMK42), e Selenito Cistina (SC) a 37°C foram testados, em associação com meios sólidos seletivos: Rambach (RA), Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4), e Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (VB). Na segunda fase os caldos RV, TMK37 e TMK42, semeados nos meios XLT4 e VB, foram testados com amostras naturalmente contaminadas. Na primeira fase o RV, TMK42 e TMK37 foram mais eficientes que o SC. No isolamento de Salmonella sp. em amostras naturalmente contaminadas os caldos TMK42 e RV foram superiores ao TMK37. O desempenho destes influenciou diretamente a capacidade seletiva e indicadora dos meios sólidos seletivos. No presente estudo, a associação TMK42/XLT4 demonstrou ser mais sensível, e a RV/XLT4 mais específica. O ágar VB também é recomendado para aumentar a probabilidade de detecção do patógeno. Desta forma os caldos RV e TMK42 e o ágar XLT4 e o VB foram considerados os mais indicados para a implantação de protocolos de detecção de Salmonella sp. em fezes suínas. / Detection of Salmonella is a key point in veterinary Salmonella research and surveillance programs. Through an efficient method for pathogen detection, the herd infection leveI could be better determinated, which would permit the understanding of Salmonella infection epidemiology and the developing of pathogen control programs in order to achieve biological food safety. In a conventional isolation method, the selective enrichment is a critical step because it suppresses competitive microflora and permits Salmonella sp. to proliferate. Several selective enrichment broths have been compared for recovering Salmonella sp. from foods. However the isolation ITomswine feces has been conduct in a few studies. The aim of this study was to compare the efficiency of different selective enrichment methods for the isolation of Salmonella sp. from swine feces. In a first step, swine feces samples were artificially contaminated and Rappaport- Vassiliadis broth incubated at 42°C (RV), MüIler-Kauffmann tetrathionate broth at 37°C (MKT37) and 42°C (MKT42), and Selenite Cystine broth at 37°C (SC) were tested, in association with selective plating media: Xylose Lisine Tergitol 4 (XLT4), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BG). Later, in a second step, RV, MKT42 and MKT37 broths were streaked in XLT4 and BG media and tested with naturally contaminated samples. At the first step RV, MKT42 and MKT37 broths were more efficient than SC broth. When Salmonella sp. were isolated from naturally contaminated samples MKT42 and RV broth were superior to MKT37. The performance of the broths affected the selectivity and differentiation capacity of the selective plating media used. In the present study the association MKT42/XLT4 was the most sensitive and RV/XLT4 was the most specific. The use of BG agar is also recommended to improve the likelihood of Salmonella sp. detection. Therefore, RVand MKT42 broth, and XLT4 and VB media were considered the most appropriated to be used in detection protocols of Salmonella sp. from swine feces.

O consumo de vegetais e de frutas tem aumentado mundialmente, bem como os surtos alimentares envolvendo esses alimentos, especialmente a alface que é o vegetal folhoso mais consumido em nível mundial. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi realizar uma avaliação quantitativa do risco de infecções causadas por Salmonella spp. e por Escherichia coli O157:H7 a partir do consumo de alface produzida e consumida no Rio Grande do Sul, visto que esses patógenos são os mais relacionados a surtos alimentares envolvendo vegetais folhosos em nível mundial. Para melhor compreender o comportamento desses patógenos na alface, eles foram inoculados nesse vegetal separadamente e armazenados sob condições isotérmicas de 5 a 40°C para Salmonella e de 5 a 42ºC para E. coli O157:H7, bem como sob condições não isotérmicas, simulando temperaturas encontradas da colheita até a venda da alface no Rio Grande do Sul. Dados experimentais demonstraram que ambas as bactérias podem se multiplicar em todas as temperaturas examinadas. Também foi proposto um parâmetro de tempo de multiplicação insignificante (ς), o qual fornece o tempo em que a alface pode ser exposta a uma temperatura específica e não apresentar uma multiplicação expressiva. O ς foi desenvolvido com base na equação do modelo primário de Baranyi e no conceito do potencial de crescimento. ς é o valor da fase lag adicionado do tempo necessário para população microbiana aumentar 0,5 log UFC/g. O ς da alface exposta a 37 °C foi de 1,3 h, enquanto que a 5 °C foi de 3,3 dias. Além dos modelos adequados, dados de prevalência e concentração são primordiais na avaliação de risco. Assim, foi realizada uma revisão sistemática da literatura para buscar esses dados A prevalência mundial encontrada foi de 0,041 para ambos os patógenos na alface. Já a prevalência dos países desenvolvidos foi de 0,028 para Salmonella e de 0,125 para E. coli (EHEC), enquanto que nos países em desenvolvimento foi de 0,064 para Salmonella e 0,024 para E. coli (EHEC). A concentração de Salmonella em alface, em países em desenvolvimento, variou de 4,57 a 218,78 NMP/g, e para E. coli (EHEC) a concentração foi de < 3,0 NMP/g até > 1100 NMP/g. O modelo de avaliação quantitativa de risco microbiológico foi composto por nove módulos, desde o armazenamento da alface nas fazendas produtoras até o consumo. O risco médio (baseado no cenário mais comumente encontrado no Rio Grande do Sul) de infecção por Salmonella por mês foi de 0,017, enquanto que por E. coli O157:H7 foi de 0,006. Assim, de modo geral, o risco de infecção por Salmonella é maior do que por E. coli O157:H7 quando a alface é produzida e consumida nesse estado. Todos os cenários alternativos à correta higienização da alface (lavar as folhas de alface com água potável seguido de imersão em 200 ppm de cloro livre, por 15 minutos e enxaguar com água potável) aumentaram o risco. A principal redução do risco foi identificada no cenário que considerou o uso de refrigeração em todos os módulos do modelo. Análises de sensibilidade indicaram que, além da manutenção da cadeia fria e do procedimento correto de higienização, é importante reduzir a prevalência e a concentração dos patógenos na alface, a fim de diminuir o risco de infecção por essas bactérias. Por fim, a avaliação de risco desenvolvida nessa tese pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias de intervenção para mitigar esse risco. / The consumption of vegetables and fruits has increased worldwide, as well as foodborne outbreaks involving these foods, especially lettuce that is the most consumed leafy vegetable in the world. Thus, the objective of this study was to carry out a quantitative microbial risk assessment of Salmonella spp. and Escherichia coli O157: H7 on lettuce produced and consumed in Rio Grande do Sul, since these pathogens are the most related to foodborne outbreaks involving leafy vegetables worldwide. To study the behavior of these pathogens on lettuce, they were inoculated on this vegetable separately and stored under isothermal conditions of 5 to 40 °C for Salmonella and 5 to 42 °C for E. coli O157:H7, as well as under non-isothermal conditions, simulating temperatures from the harvest until the sale of lettuce in Rio Grande do Sul. Experimental data demonstrated that both bacteria can growth at all temperatures examined. A negligible growth time parameter (ς) has also been proposed, which provides the time that lettuce can be exposed to a specific temperature and does not present an expressive growth. The ς was developed based on the equation of the Baranyi primary model and the concept of growth potential. ς is the lag phase added value of the time required for microbial population to increase 0.5 log CFU/g. The ς of lettuce exposed at 37 ºC was 1.3 h, whereas at 5 ºC it was 3.3 days. In addition, prevalence and concentration data are paramount in the risk assessment studies. Thus, a systematic review of the literature was carried out to collect these data. The global prevalence found was 0.041 for both pathogens in lettuce The prevalence of developed countries was 0.028 for Salmonella and 0.125 for E. coli (EHEC), while in developing countries it was 0.064 for Salmonella and 0.024 for E. coli (EHEC). The concentration of Salmonella in lettuce in developing countries ranged from 4.57 to 218.78 MPN/g, and for E. coli (EHEC) the concentration was < 3.0 MPN/g to > 1100 MPN/g. The quantitative microbial risk assessment model was composed by nine modules, from lettuce storage on farms to consumption. The average risk (based on the scenario most commonly found in Rio Grande do Sul) of Salmonella infection per month was 0.017, whereas for E. coli O157:H7 it was 0.006. Thus, in general, the risk of infection by Salmonella is higher than by E. coli O157:H7 when lettuce is produced and consumed in this State. All scenarios that were alternative to the correct hygiene of lettuce (washing lettuce leaves with drinking water followed by immersion in 200 ppm of free chlorine for 15 minutes and rinsing with potable water) increased the risk. The main risk reduction was identified in the scenario that considered the use of refrigeration in all modules of the model. Sensitivity analyzes indicated that, in addition to maintaining the cold chain and the correct hygienization procedure, it is important to reduce the prevalence and concentration of pathogens in lettuce, in order to reduce the risk of infection by these bacteria. Finally, the risk assessment developed in this thesis can help in the development of intervention strategies to mitigate this risk.

The overall aim of this project was to determine the molecular mechanisms by which the flagellin gene from Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) activates the NAIP/NLRC4 inflammasome and its contribution to the host protective immune response against salmonellosis. Inflammasomes are multi-protein complexes formed in response to the activation of pattern recognition receptors (PRRs). The NOD-like receptor (NLR)-family of inflammasome complexes are formed from the cytosolic NLR receptors, ASC adaptor and caspase-1 in response to pathogen- associated molecules or danger-associated signals. The NAIP/NLRC4 inflammasome is activated by the S. enterica flagellar filament protein (FliC), the SPI-1 type III secretion system needle (PrgI) and inner rod proteins (PrgJ). Recognition of these bacterial ligands by the NAIP receptors allows oligomerisation with NLRC4 and subsequent recruitment of caspase-1. Caspase-1 mediates pyroptosis, while recruitment of ASC is also required for cleavage of pro-IL-1β and pro-IL-18 to their active forms by caspase-1. Differential recognition of the flagellar filament proteins (flagellin) by the NAIP/NLRC4 inflammasome forms an important part of my thesis. Here, I have looked at the molecular mechanisms and immunological consequences of the differential recognition of flagellin by the NAIP/NLRC4 inflammasome using S. Typhimurium SL1344 and the non-pathogenic E. coli strain K12-MG1655. An important part of my work was to try and determine which regions of fliC are required for NAIP/NLRC4 inflammasome activation and whether they can be mutated while preserving motility. To do this a panel of ten strains expressing chimeric fliC genes were created and characterised in macrophage infection experiments and bacterial motility assays. My results confirm the C-terminus of FliC is critical for both inflammasome activation and motility in agreement with published reports. To further investigate this differential recognition by the NAIP/NLRC4 inflammasome I modified S. Typhimurium strain of moderate virulence (M525P) to express flagellin from E. coli K12-MG1655. This strain (M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR) retained motility and both in vitro and in vivo characterisation was carried out in macrophages and using a murine model of sublethal salmonellosis respectively. Activation of the NAIP/NLRC4 inflammasome was impaired in murine macrophages infected with M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR when compared to those infected with M525P. Mice infected with M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR had increased liver and spleen bacterial burdens compared to those infected with M525P, indicating that optimal NAIP/NLRC4 inflammasome activation is key for efficient control of microbial spread in vivo. The role of NAIP receptors in inflammasome formation was further investigated with the use of CRISPR/Cas9 to generate mutant murine macrophage cell lines. To investigate the consequence of gene deletions cell lines were designed to lack NAIP 1, 2, 5 and 6, while others were designed to express tagged NAIP proteins to elucidate the cellular localisation of the NAIP proteins during inflammasome formation by microscopy. Characterisation of these cell lines is ongoing, with extensive optimisation of the CRISPR/Cas9 technique undertaken during this study.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-03Bitstream added on 2014-11-10T11:57:44Z : No. of bitstreams: 1 000788531_20141231.pdf: 390330 bytes, checksum: af24401fb24e38526931a89f85f4de15 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-05T11:00:53Z: 000788531_20141231.pdf,Bitstream added on 2015-01-05T11:01:49Z : No. of bitstreams: 1 000788531.pdf: 1071602 bytes, checksum: e7f64588712903e7e7cfea4f7076f1c5 (MD5) / Apesar dos recentes avanços tecnológicos na indústria de alimentos, ainda se observa a ocorrência de inúmeras enfermidades de origem alimentar, devido à ingestão de alimentos contaminados por micro-organismos patogênicos, dentre eles os do gênero Salmonella. Dentre os produtos envolvidos em processos de contaminação por este agente, as carnes são as mais importantes, sendo a de aves o veículo em numerosos casos de infecções humanas. Além dos problemas em saúde pública, o micro-organismo causa grandes problemas devido à formação de biofilmes na indústria, sendo que esta ocorre em virtude da adesão dos micro-organismos em uma superfície de contato, a qual se fixam, constituem uma matriz de exopolissacarídeos e iniciam seu crescimento. Estes representam uma preocupação à indústria de alimentos por seu efeito como fonte de contaminação crônica, que aumenta as chances de veiculação do patógeno ao consumidor. Inúmeros são os fatores que condicionam o desenvolvimento do biofilme, entres eles o tipo de superfície e suas propriedades físico-químicas, já que as mesmas exercem influência direta sobre a adesão dos micro-organismos. Diversas medidas de controle para resolver o problema são empregadas na indústria, como o uso de sanitizantes, em destaque os à base de ácido peracético, que embora tenham o seu efeito sob células sésseis comprovado, a sua ação sob biofilmes ainda necessita de maior comprovação científica. Nesse sentido, os dados obtidos por este trabalho ratificaram a importância de Salmonella spp. como formadora de biofilme em diferentes superfícies, o que pode induzir a uma maior permanência destes micro-organismos no ambiente de processamento na indústria e, consequentemente, a uma maior chance de contaminação dos alimentos, com riscos ao consumidor. Nossos resultados também confirmaram que as propriedades físico-químicas da superfície dos diferentes materiais influenciaram ... / Despite recent technological advances in the food industry, still observed the occurrence of numerous food borne illnesses due to ingestion of contaminated by pathogenic microorganisms, including members of the genus Salmonella spp. Among the products involved in processes of contamination by this agent, the steaks are the most important, being the vehicle of birds in numerous cases of human infections. In addition to problems in public health, the microorganism causes big problems due to the formation of biofilms in the industry, and this occurs because of the accession of microorganisms on a surface of contact, which are fixed, are an array of exopolysaccharides and begin their growth. These are a concern to the food industry for its effect as a source of chronic infection, which increases the chances of placement of the pathogen to the consumer. There are many factors that affect biofilm development, entres they the type of surface and its physicochemical properties, since they will directly influence the adhesion of microorganisms. Several control measures to solve the problem are employed in the industry, such as the use of sanitizers, featured in the peracetic acid, though they have proven their effect on sessile cells in biofilms its action still needs more scientific evidence. In this sense, the data obtained from this study confirm the importance of Salmonella spp. as forming biofilm on different surfaces, which can induce a greater permanence of these microorganisms in the processing environment in the industry and hence a greater chance of food contamination, with risks to the consumer. Our results also confirmed that the physicochemical surface properties of different materials directly influence the adhesion of microorganisms and, consequently, the development of the biofilm. In simple terms, the greater the hydrophobicity of the surface, the greater the ability to promote the development of the biofilm, in order that the ...

A detecção de Salmonella sp. é fundamental nos programas de controle de salmonelose. Métodos de detecção mais eficientes permitem uma melhor determinação do nível de infecção dos rebanhos, um melhor entendimento da epidemiologia da infecção por Salmonella sp. e o desenvolvimento de programas de controle do patógeno, que visem a segurança biológica do alimento. Nos métodos convencionais, o enriquecimento seletivo é uma etapa crítica, pois inibe a microbiota competitiva e permite a multiplicação de Salmonella sp. Vários caldos de enriquecimento seletivo têm sido comparados quanto à eficiência na recuperação de Salmonella sp. a partir de alimentos, contudo existem poucos estudos relativos a fezes de suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos. Numa primeira fase, amostras de fezes foram contaminadas artificialmente e os caldos Rappaport-Vassiliadis incubado a 42°C (RV), Tetrationato Müller-Kauffmann a 37°C (TMK37) e 42°C (TMK42), e Selenito Cistina (SC) a 37°C foram testados, em associação com meios sólidos seletivos: Rambach (RA), Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4), e Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (VB). Na segunda fase os caldos RV, TMK37 e TMK42, semeados nos meios XLT4 e VB, foram testados com amostras naturalmente contaminadas. Na primeira fase o RV, TMK42 e TMK37 foram mais eficientes que o SC. No isolamento de Salmonella sp. em amostras naturalmente contaminadas os caldos TMK42 e RV foram superiores ao TMK37. O desempenho destes influenciou diretamente a capacidade seletiva e indicadora dos meios sólidos seletivos. No presente estudo, a associação TMK42/XLT4 demonstrou ser mais sensível, e a RV/XLT4 mais específica. O ágar VB também é recomendado para aumentar a probabilidade de detecção do patógeno. Desta forma os caldos RV e TMK42 e o ágar XLT4 e o VB foram considerados os mais indicados para a implantação de protocolos de detecção de Salmonella sp. em fezes suínas. / Detection of Salmonella is a key point in veterinary Salmonella research and surveillance programs. Through an efficient method for pathogen detection, the herd infection leveI could be better determinated, which would permit the understanding of Salmonella infection epidemiology and the developing of pathogen control programs in order to achieve biological food safety. In a conventional isolation method, the selective enrichment is a critical step because it suppresses competitive microflora and permits Salmonella sp. to proliferate. Several selective enrichment broths have been compared for recovering Salmonella sp. from foods. However the isolation ITomswine feces has been conduct in a few studies. The aim of this study was to compare the efficiency of different selective enrichment methods for the isolation of Salmonella sp. from swine feces. In a first step, swine feces samples were artificially contaminated and Rappaport- Vassiliadis broth incubated at 42°C (RV), MüIler-Kauffmann tetrathionate broth at 37°C (MKT37) and 42°C (MKT42), and Selenite Cystine broth at 37°C (SC) were tested, in association with selective plating media: Xylose Lisine Tergitol 4 (XLT4), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BG). Later, in a second step, RV, MKT42 and MKT37 broths were streaked in XLT4 and BG media and tested with naturally contaminated samples. At the first step RV, MKT42 and MKT37 broths were more efficient than SC broth. When Salmonella sp. were isolated from naturally contaminated samples MKT42 and RV broth were superior to MKT37. The performance of the broths affected the selectivity and differentiation capacity of the selective plating media used. In the present study the association MKT42/XLT4 was the most sensitive and RV/XLT4 was the most specific. The use of BG agar is also recommended to improve the likelihood of Salmonella sp. detection. Therefore, RVand MKT42 broth, and XLT4 and VB media were considered the most appropriated to be used in detection protocols of Salmonella sp. from swine feces.

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

abstract: In sub-Saharan Africa, an invasive form of nontyphoidal Salmonella (iNTS) belonging to sequence type (ST)313 has emerged as a major public health concern causing widespread bacteremia and mortality in children with malaria and adults with HIV. Clinically, ST313 pathovars are characterized by the absence of gastroenteritis, which is commonly found in “classical” nontyphoidal Salmonella (NTS), along with multidrug resistance, pseudogene formation, and chromosome degradation. There is an urgent need to understand the biological and physical factors that regulate the disease causing properties of ST313 strains. Previous studies from our lab using dynamic Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor technology and “classical” NTS strain χ3339 showed that physiological fluid shear regulates gene expression, stress responses and virulence in unexpected ways that are not observed using conventional shake and static flask conditions, and in a very different manner as compared to ST313 strain D23580. Leveraging from these findings, the current study was the first to report the effect of fluid shear on the pathogenesis-related stress responses of S. Typhimurium ST313 strain A130, which evolved earlier than D23580 within the ST313 clade. A130 displayed enhanced resistance to acid, oxidative and bile stresses when cultured in the high fluid shear (HFS) control condition relative to the low fluid shear (LFS) condition in stationary phase using Lennox Broth (LB) as the culture medium. The greatest magnitude of the survival benefit conferred by high fluid shear was observed in response to oxidative and acid stresses. No differences were observed for thermal and osmotic stresses. Based on previous findings from our laboratory, we also assessed how the addition of phosphate or magnesium ions to the culture medium altered the acid or oxidative stress responses of A130 grown in the RWV. Addition of either phosphate or magnesium to the culture medium abrogated the fluid shear-related differences observed for A130 in LB medium for the acid or oxidative stress responses, respectively. Collectively, these findings indicate that like other Salmonella strains assessed thus far by our team, A130 responds to differences in physiological fluid shear, and that ion concentrations can modulate those responses. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Microbiology 2017

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-31Bitstream added on 2014-06-13T19:38:38Z : No. of bitstreams: 1 matos_avr_me_botfmvz.pdf: 605553 bytes, checksum: 8e2ed75543eaa220ad6547f720052fb2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O tecido muscular de animais sadios é considerado estéril, livre de contaminação por qualquer micro-organismo. Após o abate, a carne passa a apresentar uma microbiota bastante variável, e sujeita a contaminações. Muitos desses micro-organismos são constituintes naturais da microbiota intestinal de bovinos, e procedimentos não adequados na linha de abate podem determinar rupturas de alças intestinais e contaminação das carcaças. Foram colhidas amostras de 100 carcaças em um frigorífico exportador, localizado no interior do Estado de São Paulo, amostradas ao longo de um ano através do método de esponjas, aplicado na região do peito do animal. As amostras foram colhidas em três pontos, denominados A, B e C, sendo cada carcaça amostrada nos três pontos, localizados nas etapas: pós sangria (A); pós esfola (B) e pós lavagem (C). Foram realizadas pesquisas de Listeria sp., E. coli O157, Salmonella spp. e Micro-organismos Indicadores (Petrifilms® AC, EC e EB). Não foram isolados Listeria ou E. coli O157 em nenhuma das 300 amostras. Salmonella spp. foi isolada em 9, sendo oito no ponto A e uma no ponto B. Para Mesófilos, as contagens variaram de 0 a 6,8 log UFC/cm2 , para Coliformes totais, de 0 a 4,57 log UFC/cm2 e para E. coli de 0 a 4,38 log UFC/cm2. Diante dos resultados obtidos, e em comparação com a literatura, conclui-se que o estabelecimento estudado apresenta qualidade, tanto sanitária (devido às baixas prevalências dos patógenos) quanto higiênica (devido à acentuada diminuição da carga microbiana de indicadores ao longo da linha) / The muscle tissue of healthy animals is considered sterile, free of any contamination by micro-organism. After slaughter, the meat begins to show a microbiota quite variable and subject to contamination. Many of these micro-organisms are natural constituents of the intestinal tract of cattle, and procedures not appropriate on the slaughter line may determine rupture of the bowel and contamination of carcasses. Samples were collected from 100 carcasses in a slaughterhouse exporter, located within the State of São Paulo, sampled over a year by the sponge method, applied to the chest of the animal. Samples were taken at three points, called A, B and C, each carcass sampled at three points located in steps: after bleeding (A) after skinning (B) and after washing (C). Research was conducted of Listeria sp., E. coli O157, Salmonella spp. and Micro-organism (Petrifilms ® AC, EC and EB). Does not were isolated Listeria or E. coli O157 in any of the 300 samples. Salmonella spp. was isolated in nine, eight at point A and one at point B. To Mesophiles, scores ranged from 0 to 6.8 log UFC/cm2; for Total coliforms, 0 to 4.57 log UFC/cm2 and E. coli from 0 to 4.38 log UFC/cm2. With the results obtained and compared with the literature, it is concluded that the establishment in study has both quality sanitary (due to the low prevalence of pathogens) as hygienic quality (due to the sharp decrease in the microbial load of indicators along the line

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005Bitstream added on 2014-06-13T18:39:11Z : No. of bitstreams: 1 moscardijr_e_me_botfmvz.pdf: 201670 bytes, checksum: 2eb14d48653faede9c3f3d6f4b381325 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Sessenta novilhos com seis meses de vida foram acompanhados durante um período de confinamento com o objetivo de se determinar a prevalência de Salmonella spp. durante a fase de engorda e também na etapa de abate. Os trabalhos foram desenvolvidos na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu, SP. Durante os seis meses de confinamento foram analisadas: 15 amostras das instalações pré-chegada dos lotes, 1 amostra de insetos, 1 amostra de conteúdo intestinal de um roedor, 10 de fezes de conjunto obtidas 24 h após a chegada de cada grupo animal, 83 de alimentos e água de dessedentação, 322 de fezes individuais coletadas da ampola retal de cada novilho, 60 amostras de carcaças obtidas na indústria frigorífica após o abate e 30 amostras do ambiente frigorífico (paredes, instalações, instrumentais). Isolou-se Salmonella spp. de amostras de dois alimentos (caroço de algodão e concentrado – 2/83, 2,4%), de amostras de fezes individuais de quatro animais (4/232, 1,3%) e de duas carcaças (2/60, 2,33%). Foram identificados dois sorotipos: Salmonella Mbandaka (caroço de algodão) e Salmonella Tennessee (concentrado, fezes individuais e carcaças). Conclui-se que a prevalência do patógeno durante o confinamento bem como nas carcaças abatidas foi baixa, sendo que o encontro de Salmonella em alguns constituintes da ração pode ter se refletido no aparecimento de carcaças contaminadas, por falhas ocorridas durante as operações de abate. / Sixty steers six months old were monitored during a period of feedlot to determine the prevalence of Salmonella spp. during the fattening phases and slaughtering stage. The activities were developed in the Veterinary Medicine and Zootecnist College, UNESP, at Botucatu, SP. During the ten months of feedlot were analyzed: 15 samples of the facilities before the animal loots arrive, 1 sample of the insects, 1 sample of mice intestinal contents, 10 samples of steers mixed feces obtained 24 h after the arrival of each animal group, 83 of feed and drinkable water, 322 of individual feces collected from rectum flask of each steer, 60 samples from bovine carcasses and 30 samples of environment obtained from slaughterhouse (walls, facilities and instrumentals). Salmonella spp. were identified in two samples of feed (cotton seed, protein and mineral mix , 2/83 = 2,4%), samples of individual feces from four animals (4/322 = 1,3%) and from two carcasses (2/60 = 2,33%). Two serotypes were identified: Salmonella Mbandaka (cotton seed) and Salmonella Tennessee (protein and mineral mix, individual feces and carcasses). It follows that the prevalence of the pathogen during the feedlot and in the slaughtered carcasses was low, while the isolation of Salmonella in some ingredients may have influenced the occurrence of contaminated carcasses because of faults occurred during slaughter procedures.