Orientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Jean Guilherme Fernandes Joaquim / Banca: Luciano dos Santos Bersot / Resumo: O tecido muscular de animais sadios é considerado estéril, livre de contaminação por qualquer micro-organismo. Após o abate, a carne passa a apresentar uma microbiota bastante variável, e sujeita a contaminações. Muitos desses micro-organismos são constituintes naturais da microbiota intestinal de bovinos, e procedimentos não adequados na linha de abate podem determinar rupturas de alças intestinais e contaminação das carcaças. Foram colhidas amostras de 100 carcaças em um frigorífico exportador, localizado no interior do Estado de São Paulo, amostradas ao longo de um ano através do método de esponjas, aplicado na região do peito do animal. As amostras foram colhidas em três pontos, denominados A, B e C, sendo cada carcaça amostrada nos três pontos, localizados nas etapas: pós sangria (A); pós esfola (B) e pós lavagem (C). Foram realizadas pesquisas de Listeria sp., E. coli O157, Salmonella spp. e Micro-organismos Indicadores (Petrifilms® AC, EC e EB). Não foram isolados Listeria ou E. coli O157 em nenhuma das 300 amostras. Salmonella spp. foi isolada em 9, sendo oito no ponto A e uma no ponto B. Para Mesófilos, as contagens variaram de 0 a 6,8 log UFC/cm2 , para Coliformes totais, de 0 a 4,57 log UFC/cm2 e para E. coli de 0 a 4,38 log UFC/cm2. Diante dos resultados obtidos, e em comparação com a literatura, conclui-se que o estabelecimento estudado apresenta qualidade, tanto sanitária (devido às baixas prevalências dos patógenos) quanto higiênica (devido à acentuada diminuição da carga microbiana de indicadores ao longo da linha) / Abstract: The muscle tissue of healthy animals is considered sterile, free of any contamination by micro-organism. After slaughter, the meat begins to show a microbiota quite variable and subject to contamination. Many of these micro-organisms are natural constituents of the intestinal tract of cattle, and procedures not appropriate on the slaughter line may determine rupture of the bowel and contamination of carcasses. Samples were collected from 100 carcasses in a slaughterhouse exporter, located within the State of São Paulo, sampled over a year by the sponge method, applied to the chest of the animal. Samples were taken at three points, called A, B and C, each carcass sampled at three points located in steps: after bleeding (A) after skinning (B) and after washing (C). Research was conducted of Listeria sp., E. coli O157, Salmonella spp. and Micro-organism (Petrifilms ® AC, EC and EB). Does not were isolated Listeria or E. coli O157 in any of the 300 samples. Salmonella spp. was isolated in nine, eight at point A and one at point B. To Mesophiles, scores ranged from 0 to 6.8 log UFC/cm2; for Total coliforms, 0 to 4.57 log UFC/cm2 and E. coli from 0 to 4.38 log UFC/cm2. With the results obtained and compared with the literature, it is concluded that the establishment in study has both quality sanitary (due to the low prevalence of pathogens) as hygienic quality (due to the sharp decrease in the microbial load of indicators along the line / Mestre

Orientador : José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Resumo: Sessenta novilhos com seis meses de vida foram acompanhados durante um período de confinamento com o objetivo de se determinar a prevalência de Salmonella spp. durante a fase de engorda e também na etapa de abate. Os trabalhos foram desenvolvidos na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu, SP. Durante os seis meses de confinamento foram analisadas: 15 amostras das instalações pré-chegada dos lotes, 1 amostra de insetos, 1 amostra de conteúdo intestinal de um roedor, 10 de fezes de conjunto obtidas 24 h após a chegada de cada grupo animal, 83 de alimentos e água de dessedentação, 322 de fezes individuais coletadas da ampola retal de cada novilho, 60 amostras de carcaças obtidas na indústria frigorífica após o abate e 30 amostras do ambiente frigorífico (paredes, instalações, instrumentais). Isolou-se Salmonella spp. de amostras de dois alimentos (caroço de algodão e concentrado - 2/83, 2,4%), de amostras de fezes individuais de quatro animais (4/232, 1,3%) e de duas carcaças (2/60, 2,33%). Foram identificados dois sorotipos: Salmonella Mbandaka (caroço de algodão) e Salmonella Tennessee (concentrado, fezes individuais e carcaças). Conclui-se que a prevalência do patógeno durante o confinamento bem como nas carcaças abatidas foi baixa, sendo que o encontro de Salmonella em alguns constituintes da ração pode ter se refletido no aparecimento de carcaças contaminadas, por falhas ocorridas durante as operações de abate. / Abstract: Sixty steers six months old were monitored during a period of feedlot to determine the prevalence of Salmonella spp. during the fattening phases and slaughtering stage. The activities were developed in the Veterinary Medicine and Zootecnist College, UNESP, at Botucatu, SP. During the ten months of feedlot were analyzed: 15 samples of the facilities before the animal loots arrive, 1 sample of the insects, 1 sample of mice intestinal contents, 10 samples of steers mixed feces obtained 24 h after the arrival of each animal group, 83 of feed and drinkable water, 322 of individual feces collected from rectum flask of each steer, 60 samples from bovine carcasses and 30 samples of environment obtained from slaughterhouse (walls, facilities and instrumentals). Salmonella spp. were identified in two samples of feed (cotton seed, protein and mineral mix , 2/83 = 2,4%), samples of individual feces from four animals (4/322 = 1,3%) and from two carcasses (2/60 = 2,33%). Two serotypes were identified: Salmonella Mbandaka (cotton seed) and Salmonella Tennessee (protein and mineral mix, individual feces and carcasses). It follows that the prevalence of the pathogen during the feedlot and in the slaughtered carcasses was low, while the isolation of Salmonella in some ingredients may have influenced the occurrence of contaminated carcasses because of faults occurred during slaughter procedures. / Mestre

Para avaliar a diversidade de Salmonella enterica, foram analisados os sorovares presentes em amostras de Salmonela isoladas de aves e seu ambiente do Sul do Brasil (n=155), Colômbia (n=141) e Mississippi (EUA, n=50). No total, foram examinados 346 isolados de Salmonela pela técnica de ribotipificação de sequências Intergênicas (ISR) usando PCR convencional (para bactérias vivas isoladas no Estado de Mississippi) ou nested PCR (para o DNA de Salmonelas do Brasil e da Colômbia, em cartões FTA). O sequenciamento da região intergênica do gene dkgB avalia polimorfismos de nucleotídeos simples que ocorrem em torno do gene ribossomal 5S. A concordância geral entre o esquema Kauffman-White-LeMinor (KWL) e a ISR foi de 85,2% em isolados do Brasil, e de 89,58% em isolados do Mississippi. É possível que a divergência seja devida à capacidade da ISR de detectar as misturas de sorovares numa cultura. Os sorovares de Salmonella enterica identificados nos isolados brasileiros foram: Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo e Senftenberg. Três sorovares ISR únicos foram detectados (UN0041, UN0042, UN0043). Nos isolados colombianos, foram identificados os sorovares Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen, Braenderup, Yoruba e um sorovar ISR Único (UN0048). Já no tocante aos isolados de Mississippi, foram identificados os sorovares Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg e um ISR Único (UN0094). Em geral, a ISR forneceu mais informações do que KWL sobre a ecologia de Salmonella enterica das aves comerciais. Em 73 isolados da Colômbia e 50 isolados de Mississippi, foram estabelecidas as resistências para 15 e 17 agentes antimicrobianos, respectivamente. Não foram identificados isolados pansusceptíveis. Todas as amostras analisadas foram classificadas como multirresistentes. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados, não só com respeito aos sorovares identificados em cada país, mas também sobre a sua resistência aos antimicrobianos. Os resultados desta pesquisa irão beneficiar a indústria avícola do sul do Brasil, da Colômbia e de Mississippi, porque a caracterização de cepas isoladas de aves comerciais poderá ser usada no futuro para o desenvolvimento e adaptação de programas de controle. / To assess diversity of Salmonella enterica serotypes present in poultry and their environment from Southern Brazil (n=155), Colombia (n=141) and Mississippi (EUA, n=50); 346 isolates were examined with conventional PCR (live bacteria from Mississippi) or nested PCR (Brazilian and Colombian Salmonella DNA in FTA cards) and sequencing of the dkgB-linked intergenic sequence ribotyping (ISR) region that assesses single nucleotide polymorphisms occurring around a 5S ribosomal gene. Overall agreement between Kauffman-White-LeMinor (KWL) scheme and ISR was 85.2% in Brazilian Salmonella isolates, and 89.58% in Mississippi´s isolates. It is possible that the disagreement was due to the ability of ISR to detect mixtures of serotypes in culture. Salmonella enterica serotypes identified among Brazilian isolates were Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo, and Senftenberg. Three unique ISRs were detected (UN0041, UN0042, UN0043). Regarding the Colombian isolates, serotypes Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen Braenderup, Yoruba, and One Unique ISR (UN0048) were identified and among Mississippian isolates, serotypes Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg, and one Unique ISR (UN0094). Overall, ISR provided more information than KWL about the ecology of on-farm Salmonella enterica. In 73 isolates from Colombia and 50 isolates from Mississippi, there were established the antimicrobial resistance against 15 and 17 antimicrobial agents, respectively. No pansusceptible isolate was identified. All analyzed isolates were classified as Multidrug resistant. The results of this study show a great diversity among analyzed isolates, not only in respect to the serotypes, but also about their antimicrobial resistance. The results of this research will benefit the poultry industries of Southern Brazil, Colombia and Mississippi, because the characterization of strains isolated from poultry can be used in the future to the development and adaptation of Salmonella control programs.

O consumo de vegetais e de frutas tem aumentado mundialmente, bem como os surtos alimentares envolvendo esses alimentos, especialmente a alface que é o vegetal folhoso mais consumido em nível mundial. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi realizar uma avaliação quantitativa do risco de infecções causadas por Salmonella spp. e por Escherichia coli O157:H7 a partir do consumo de alface produzida e consumida no Rio Grande do Sul, visto que esses patógenos são os mais relacionados a surtos alimentares envolvendo vegetais folhosos em nível mundial. Para melhor compreender o comportamento desses patógenos na alface, eles foram inoculados nesse vegetal separadamente e armazenados sob condições isotérmicas de 5 a 40°C para Salmonella e de 5 a 42ºC para E. coli O157:H7, bem como sob condições não isotérmicas, simulando temperaturas encontradas da colheita até a venda da alface no Rio Grande do Sul. Dados experimentais demonstraram que ambas as bactérias podem se multiplicar em todas as temperaturas examinadas. Também foi proposto um parâmetro de tempo de multiplicação insignificante (ς), o qual fornece o tempo em que a alface pode ser exposta a uma temperatura específica e não apresentar uma multiplicação expressiva. O ς foi desenvolvido com base na equação do modelo primário de Baranyi e no conceito do potencial de crescimento. ς é o valor da fase lag adicionado do tempo necessário para população microbiana aumentar 0,5 log UFC/g. O ς da alface exposta a 37 °C foi de 1,3 h, enquanto que a 5 °C foi de 3,3 dias. Além dos modelos adequados, dados de prevalência e concentração são primordiais na avaliação de risco. Assim, foi realizada uma revisão sistemática da literatura para buscar esses dados A prevalência mundial encontrada foi de 0,041 para ambos os patógenos na alface. Já a prevalência dos países desenvolvidos foi de 0,028 para Salmonella e de 0,125 para E. coli (EHEC), enquanto que nos países em desenvolvimento foi de 0,064 para Salmonella e 0,024 para E. coli (EHEC). A concentração de Salmonella em alface, em países em desenvolvimento, variou de 4,57 a 218,78 NMP/g, e para E. coli (EHEC) a concentração foi de < 3,0 NMP/g até > 1100 NMP/g. O modelo de avaliação quantitativa de risco microbiológico foi composto por nove módulos, desde o armazenamento da alface nas fazendas produtoras até o consumo. O risco médio (baseado no cenário mais comumente encontrado no Rio Grande do Sul) de infecção por Salmonella por mês foi de 0,017, enquanto que por E. coli O157:H7 foi de 0,006. Assim, de modo geral, o risco de infecção por Salmonella é maior do que por E. coli O157:H7 quando a alface é produzida e consumida nesse estado. Todos os cenários alternativos à correta higienização da alface (lavar as folhas de alface com água potável seguido de imersão em 200 ppm de cloro livre, por 15 minutos e enxaguar com água potável) aumentaram o risco. A principal redução do risco foi identificada no cenário que considerou o uso de refrigeração em todos os módulos do modelo. Análises de sensibilidade indicaram que, além da manutenção da cadeia fria e do procedimento correto de higienização, é importante reduzir a prevalência e a concentração dos patógenos na alface, a fim de diminuir o risco de infecção por essas bactérias. Por fim, a avaliação de risco desenvolvida nessa tese pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias de intervenção para mitigar esse risco. / The consumption of vegetables and fruits has increased worldwide, as well as foodborne outbreaks involving these foods, especially lettuce that is the most consumed leafy vegetable in the world. Thus, the objective of this study was to carry out a quantitative microbial risk assessment of Salmonella spp. and Escherichia coli O157: H7 on lettuce produced and consumed in Rio Grande do Sul, since these pathogens are the most related to foodborne outbreaks involving leafy vegetables worldwide. To study the behavior of these pathogens on lettuce, they were inoculated on this vegetable separately and stored under isothermal conditions of 5 to 40 °C for Salmonella and 5 to 42 °C for E. coli O157:H7, as well as under non-isothermal conditions, simulating temperatures from the harvest until the sale of lettuce in Rio Grande do Sul. Experimental data demonstrated that both bacteria can growth at all temperatures examined. A negligible growth time parameter (ς) has also been proposed, which provides the time that lettuce can be exposed to a specific temperature and does not present an expressive growth. The ς was developed based on the equation of the Baranyi primary model and the concept of growth potential. ς is the lag phase added value of the time required for microbial population to increase 0.5 log CFU/g. The ς of lettuce exposed at 37 ºC was 1.3 h, whereas at 5 ºC it was 3.3 days. In addition, prevalence and concentration data are paramount in the risk assessment studies. Thus, a systematic review of the literature was carried out to collect these data. The global prevalence found was 0.041 for both pathogens in lettuce The prevalence of developed countries was 0.028 for Salmonella and 0.125 for E. coli (EHEC), while in developing countries it was 0.064 for Salmonella and 0.024 for E. coli (EHEC). The concentration of Salmonella in lettuce in developing countries ranged from 4.57 to 218.78 MPN/g, and for E. coli (EHEC) the concentration was < 3.0 MPN/g to > 1100 MPN/g. The quantitative microbial risk assessment model was composed by nine modules, from lettuce storage on farms to consumption. The average risk (based on the scenario most commonly found in Rio Grande do Sul) of Salmonella infection per month was 0.017, whereas for E. coli O157:H7 it was 0.006. Thus, in general, the risk of infection by Salmonella is higher than by E. coli O157:H7 when lettuce is produced and consumed in this State. All scenarios that were alternative to the correct hygiene of lettuce (washing lettuce leaves with drinking water followed by immersion in 200 ppm of free chlorine for 15 minutes and rinsing with potable water) increased the risk. The main risk reduction was identified in the scenario that considered the use of refrigeration in all modules of the model. Sensitivity analyzes indicated that, in addition to maintaining the cold chain and the correct hygienization procedure, it is important to reduce the prevalence and concentration of pathogens in lettuce, in order to reduce the risk of infection by these bacteria. Finally, the risk assessment developed in this thesis can help in the development of intervention strategies to mitigate this risk.

As salmonelas causadoras do Paratifo Aviário, principalmente a Salmonella Enteritidis (SE), têm estado entre as principais causas de toxinfecção alimentar em humanos, causando grandes prejuízos ao setor produtivo. A busca de uma medida única e definitiva para o controle do Paratifo Aviário tem levado a frustração dos esforços empregados, em função das características dos agentes e da infecção provocada. Portanto, ganha força a estratégia de utilizar-se um conjunto de medidas que objetivem a redução gradativa da pressão infectiva em um sistema de produção, levando à melhora crescente do grau de contaminação dos produtos disponibilizados aos consumidores. O objetivo desta tese é fornecer à indústria avícola um conjunto de meios práticos para o controle do Paratifo Aviário e, conseqüentemente, para a produção de alimentos mais seguros ao consumo humano. Para tanto, foram conduzidos quatro estudos, sendo que três estudos foram dedicados ao aumento de resistência das aves à infecção por SE e o quarto estuda a redução do número desta bactéria na ave no período de pré-abate. Em um experimento avaliou-se a imunização das aves com uma bacterina de SE, objetivando o aumento da resistência à infecção por SE em matrizes de frango de corte. Três semanas após o início do desafio, não foram detectadas diferenças entre os grupos testados nos números de SE recuperadas do ceco e no número de cecos e fígados infectados por este agente. Esta conclusão, embora verdadeira para as condições experimentais usadas, necessita de experimentações adicionais em condições de criação tradicional para ser referendada. A Vacinação Maternal e o uso de Probiótico, como medidas para aumentar a resistência inicial de pintos de corte, foram estudados em 3 experimentos. O uso de Probiótico causou uma redução no número de ufc de SE nos cecos de até 1,45 log10. A maior redução, ocorrida no Experimento III, demonstra a importância da antecipação do uso do Probiótico em relação ao início do desafio. Não se verificou nenhum efeito da Vacinação Maternal no número de cecos positivos ou no número de ufc de SE no ceco. Em quatro experimentos foram investigados os efeitos da pulverização da cepa 9R de Salmonella Gallinarum (SG-9R) em pintos de corte de um dia de idade sobre a infecção provocada artificialmente por SE. A aplicação da SG-9R em pintos de um dia apresenta potencial para auxiliar no controle da infecção por SE. Em que pese essa conclusão, estudos adicionais são necessários para verificar a magnitude da efetividade desta medida, bem como determinar a probabilidade de reversão de patogenicidade da SG-9R. Em três experimentos estudou-se a administração de água acidificada no pré abate de frangos de corte. Esta administração nas 24 horas que precedem o carregamento para o abate levou a uma redução de 99% no número de salmonelas no inglúvio dos frangos. Esta medida não é ideal, já que não evita a doença nas aves e, também, não garante a produção de alimentos integralmente livre de Salmonella. Porém, pode tornar-se uma importante ferramenta para redução da contaminação no abate dos lotes de frangos positivos para enfermidade. / Salmonellae that cause paratyphoid infection, mainly the Salmonella Enteritidis (SE), are among the main causes of foodborne diseases in humans, representing great loss for the poultry industry. The search for a unique and decisive control means has been frustrated due to the bacterial characteristics and the resulting infection. So, it becomes important the strategic use of a group of means that gradually reduce the infection pressure over the production system, taken to an increasing improvement of the contamination level of the final products offered to the consumers. The thesis goal is to offer to the poultry industry a group of feasible means to control the paratyphoid infection and, corollary, to produce safer food to human beings. Therefore, four studies were conducted. Three of them were dedicated to the increase of bird resistence to the SE infection and one to the reduction of Salmonella contamination level of the broilers at the pre slaughter period. The increase resistance of broiler breeders due to immunization with a SE bacterin was evaluated through an experiment. Three weeks after the challenge no differences were detected on the number of SE infected livers and ceca among the tested groups. This conclusion, although true under these conditions, needs further experiments under actual production systems to be corroborated. The maternal vaccination and the use of probiotics as means to increase the initial resistance of broiler chickens to SE infection were accessed through three experiments. The probiotics reduced the number of SE colony forming units (CFU) in the ceca up to 1.45 Log10. The greatest reduction occurred at Experiment III, indicating the importance of the administration of the probiotic being prior to the challenge. No effect of maternal vaccination on the number of ceca positive to SE or the number of SE CFU recovered from the ceca. The effect of spraying day old chickens with Salmonella Gallinarum strain 9R (SG- 9R) on SE infection due to artificial challenge was accessed through four experiments. The application of SG-9R to day old chickens has a potential to help in the control of SE infection. In spite of this conclusion, further studies are needed to access the size of the effect, as well to determinate the probability of pathogenicity reversion of SG-9R. Three experiments were done to study the effect of administration of acidified water to the broilers at the pre slaughter period on the presence of SE in the crop. The use of acidified water starting 24 hours before the initial loading of broilers to the slaughter plant caused a reduction of 99% on the number of SE taken from the crop. This is not an ideal approach, since it does not avoid the presence of SE in the broiler and, also, does not warrant the production of food free of Salmonella. Although it can be a important tool to the contamination reduction of broiler flocks positive to Salmonella.

Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.

Orientador: Lucia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-05T00:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kushida_MartaMitsui_D.pdf: 1944227 bytes, checksum: 5343a021abfd5cdca334152ade81151c (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Salmonella é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos (DTAs) em todo o mundo, sendo objeto de preocupação dos principais organismos internacionais relacionados com a saúde pública. A análise deste patógeno faz parte da rotina de qualquer laboratório de controle de qualidade de alimentos e, embora exista uma grande variedade de métodos alternativos, a maioria desses laboratórios ainda utiliza o método cultural tradicional, caro, lento e trabalhoso. A principal barreira à disseminação dos métodos alternativos é o fato de serem presuntivos e, em caso positivo, exigirem o retorno ao método tradicional, para confirmação. Recentemente, entretanto, foi introduzida no Brasil uma técnica que não padece dessa desvantagem, o sistema BAX® de análise de Salmonella por reação de polimerase em cadeia (PCR). Além de ser confirmativo, o BAX® ainda é bem mais rápido, permitindo a obtenção dos resultados em 30h e com o mínimo de manipulação, pois é totalmente automatizado. A substituição do método tradicional pelo BAX® pode elevar significativamente a capacidade de análise dos laboratórios, porém, é um sistema novo, ainda pouco utilizado no país, sendo importante uma avaliação do seu desempenho na análise de produtos brasileiros, objetivo do presente trabalho. Para tanto realizou-se uma avaliação do Sistema BAX® em comparação com o método cultural tradicional, analisando 708 amostras de 22 categorias de alimentos em relação à presença de Salmonella pelos dois métodos, o que permitiu a determinação dos parâmetros de desempenho do sistema BAX®. Os resultados obtidos indicaram sensibilidade de 100%, especificidade de 98,6%, taxa de falsos positivos de 1,4% e taxa de falsos negativos de 0% / Abstract: Salmonella sp is one of most important food born microorganism in all the world, and it always has been focused among international public health organs. The food analysis for this pathogen is a subject of routine in all food quality control laboratories, and, besides there are several alternative methods for Salmonella sp detection, but most of the laboratories still work with the traditional technique of detection, which is very expensive and time consuming. The barrier to alternatives methods is the fact that most of them are considered presumptive, and need the traditional technique to confirm the positives results. An alternative technique that does not present the step of confirmation was recently, introduced in Brazil, the BAX¿ System for Salmonella sp, which works by polymerase chain reaction (PCR). It is a very quick detection method, safety, accurate which shows the analysis result in 30 hours, utilizing very few manipulation of samples, since is automatized. The substitution of traditional Salmonella sp detection method for BAX¿ system, can increase significantly the laboratories analysis capacity, but as it is a very new technique, is still unknown in our country. In despite of this, it is important to evaluate its performance in Brazilian food products, which is the aim of this research. A evaluation of BAX¿ system, compared with the Salmonell traditional method was then carried out, using 708 samples of 22 different food categories. The results showed sensibility of 100%, specificity of 98,6%, falsepositives ratio of 1,4% and false-negatives ratio of 0% for BAX¿ system / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_Sergiode_D.pdf: 5307853 bytes, checksum: de9b6f00c4099ec1ab0d2f50163feb4e (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Salmonella enterica species are intracellular bacteria causative agents of gastroenteritis and typhoid fever in humans. Pregnancy poses an increased risk of severe Salmonellosis in many mammalian species contributing to miscarriage and/or maternal illness. Previous studies indicated that Salmonella infection in pregnant mice caused rapid fetal and maternal death due to massive bacterial proliferation in the placenta. However, the susceptibility of human primary trophoblast cells (cTBCs) to Salmonella infection was not known. We hypothesized that human placental trophoblast cells are productively infected and provide a unique intracellular niche that permits uncontrolled Salmonella replication due to an ineffective maternal innate immune response to the virulent bacteria resulting in placental death. Firstly, we observed that S.Tm strains defective in the Salmonella pathogenicity island (SPI)-1 type III secretion system (TTSS) (S.Tm-ΔinvA) were unable to enter epithelial cells, but efficiently infected placental choriocarcinoma cell lines through scavenger receptor-mediated endocytosis. Next, we observed that S.Tm failed to grow vigorously in macrophages, but replicated rapidly within epithelial and placental trophoblast cells. Further examination of intracellular localization of S.Tm indicated that bacteria were arrested in early Rab5 expressing phagosomal vesicles within trophoblast cells, whereas phagosomal maturation progressed steadily in macrophages (with expression of lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) and cathepsin D). Moreover, human primary cTBCs harboring S.Tm underwent rapid death of the cells. Infected cTBCs expressed phosphorylated-receptor-interacting serine/threonine-protein kinase (RIPK)-1 protein and phosphorylated-mixed lineage kinase domain-like (MLKL), suggesting induction of the necroptosis pathway of cell death. Furthermore, specific inhibition of necroptosis rescued S.Tm-induced death of cTBCs. Finally, S.Tm infected trophoblast cells produced interleukin (IL)-10, and signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 signalling. This correlated to delayed phagosomal maturation which consequently facilitated intracellular pathogen proliferation. Overall, human trophoblast cells may act as reservoirs for S.Tm survival and may aid dissemination in the pregnant host.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La calidad microbiológica del agua que se utiliza en el riego de cultivos y hortalizas, adquiere importancia en términos de salud pública, ya que esta podría ser el vehículo para la transmisión de bacterias patógenas a la población, algunas de las cuales podrían presentar determinantes génicos de resistencia a antimicrobianos. El objetivo de este estudio fue determinar fenotipos de resistencia a antibióticos en cepas de Salmonella spp. aisladas desde diferentes cauces de ríos o canales, y su asociación con las distintas áreas geográficas en la Región Metropolitana. Se tomaron 100 muestras de agua de la Región Metropolitana, desde las cuales se aislaron 35 cepas de Salmonella spp., identificándose 18 serotipos diferentes. Estas cepas fueron analizadas mediante el método de difusión en placa Kirby Bauer según las normas recomendadas por el Clinical Laboratory Standards Institute (2007) para determinar los fenotipos de resistencia. Los antibióticos utilizados fueron: Enrofloxacino, Amoxicilina/Ácido Clavulánico, Gentamicina, Tetraciclina, Sulfametoxazol/Trimetoprim, Ceftiofur, Ampicilina, Cefadroxilo, Cloranfenicol, Amikacina, Azitromicina, Ceftriaxona, Ciprofloxacino, Kanamicina, Ácido Nalidíxico, Estreptomicina, Sulfisoxazole. Posteriormente, se analizó la asociación de los fenotipos y perfiles de resistencia con las distintas áreas geográficas de donde fueron obtenidas las cepas. El 89% de las cepas presentó resistencia a tres o más antibióticos de grupos farmacológicos no relacionados, es decir, fueron multirresistentes. Las drogas que presentaron mayor porcentaje de cepas resistentes fueron: Estreptomicina 97%, Ceftiofur 91%, Kanamicina 91%, y Cefadroxilo 89%; siendo fenicol el único grupo farmacológico con un 100% de sensibilidad. Se establecieron en las cepas un total de 28 perfiles de resistencia distintos. Al establecer si existía o no una asociación entre los perfiles de resistencia observados y las áreas geográficas desde donde se aislaron las cepas, se encontró que no existe asociación entre ambas variables (p>0,05). Sin embargo, dentro de los fenotipos de resistencia, fueron estadísticamente significativo Ácido Nalidíxico (p= 0,0096) y ciprofloxacino (p= 0,039), los cuales están asociados a las áreas rurales. 2 Con los datos presentados se puede concluir que existe una gran variedad de serotipos de Salmonella en las muestras de agua de la Región Metropolitana, con un alto porcentaje de cepas multiresistentes a los antibióticos (89%). Se identificaron una gran diversidad de perfiles de resistencia, lo que sugiere que la multi-resistencia no se debería a una expansión clonal. No hubo asociación entre los perfiles de resistencia y las áreas geográficas, en cuanto a los fenotipos de resistencia, Ácido Nalidíxico y Ciprofloxacino fue asociada al área rural. Por lo tanto, este estudio sugiere que los cursos de aguas superficiales de la Región Metropolitana, representan un riesgo para la población y para los animales, ya que estas corrientes pueden actuar como un vehículo para la difusión de estos organismos patógenos y sus genes de resistencia, las que podrían transmitirse entre diferentes hospedadores o entornos ecológicos. / The microbiological quality of water used to irrigate crops and vegetables, becomes important in terms of public health, as this could be the vehicle for the transmission of pathogen bacteria to the population, some of which could present determining gene of antimicrobial resistance. The objective of this study was to determine antibiotic resistance phenotypes in Salmonella spp. strains isolated from different courses of rivers or channels, and its association with the different geographical areas in the Metropolitan Region. 100 water samples from the Metropolitan Region were taken, from which 35 strains of Salmonella spp. were isolated, and 18 different serotypes were identified. These strains were analyzed by the disk diffusion method of Kirby Bauer as recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute (2007) to determine resistance phenotypes. The antibiotics used were Enrofloxacin, Amoxicillin/Clavulanic Acid, Gentamicin, Tetracycline, Sulfamethoxazole/Trimethoprim, Ceftiofur, Ampicillin, Cefadroxil, Chloramphenicol, Amikacin, Azithromycin, Ceftriaxone, Ciprofloxacin, Kanamycin, Nalidixic Acid, Streptomycin, Sulfisoxazole. Subsequently, the association between the phenotypes and resistance profiles with different geographical areas from which the strains were obtained was analyzed. 89% of the strains showed resistance to three or more antibiotics from unrelated pharmacological groups, namely, were multiresistant. The drugs with a higher percentage of resistant strains were 97% Streptomycin, 91% Ceftiofur, 91% Kanamycin and 89% Cefadroxil; Amphenicol being the only pharmacological group with 100% sensitivity. A total of 28 different resistance profiles were established in the strains. While establishing whether there was an association between the resistance profiles observed and geographical areas from which the strains were isolated, no association was found between the two variables (p> 0.05). However, within the resistance phenotypes they were statistically significant Nalidixic acid (p= 0.0096) and Ciprofloxacin (p= 0.039), which are associated with rural areas. 4 With the presented data, we can conclude that there are varieties of serotypes of Salmonella in samples of water from the Metropolitan Region with a high percentage (89%) of strains being multiresistant to antibiotics. A wide range of resistance profiles were identified, suggesting that multidrug resistance is not due to a clonal expansion. There was no association between resistance profiles and geographical areas, There was no association between resistance profiles and geographical areas, in terms of resistance phenotypes, nalidixic acid and ciprofloxacin was associated to rural areas. Therefore, this study suggests that surface water courses in the Metropolitan Region, pose a risk to people and animals, as these currents can act as a vehicle for the spread of these pathogens and their resistance genes, which could be transmitted between different hosts or ecological environments.