Schilddrüsenhormone (TH) regulieren Metabolismus und Energiestoffwechsel. Der TH‐Metabolit (THM) 3,5‐T2 (3,5‐Diiod‐L‐Thyronin) aktiviert Fett‐Oxidation und mitochondriale Atmung. Der THM 3‐Iodothyronamin (3‐T1AM) beeinflusst zusätzlich glukoregulatorische Prozesse. THM können zur Reduktion von Körperfett beitragen. Um 3,5‐T2 im humanen Serum nachzuweisen sollte ein Immunoassay aufgebaut, validiert und angewendet werden. In intakten hepatozellulären (HepG2) sowie pankreatischen ß‐Zellen (MIN6) sollte untersucht werden ob THM durch Modulation der mitochondrialen Aktivität die zelluläre Substratverstoffwechslung (3,5‐T2) und Insulinsekretion (3‐T1AM) regulieren können. Der Immunoassay ist sensitiv, spezifisch und misst zuverlässig 3,5‐T2 im humanen Serum. Hyper‐ und Hypothyreose zeigen vergleichbare 3,5‐T2 Konzentrationen, jedoch akkumuliert 3,5‐T2 bei sekundären Erkrankungen der Schilddrüse und athyreoten Patienten unter Thyroxin‐Supplementation. In HepG2‐Zellen konnte die Aktivierung der mitochondrialen Atmung durch 3,3‘,5‐Triiod‐L‐Thyronin (T3), jedoch nicht durch 3,5‐T2 stimuliert werden. Die Expression von TH‐transporters (THT) war gering verglichen mit Maus‐Hepatozyten. MIN6 exprimiert THT vergleichbar mit Langerhansschen Inselzellen der Maus. 3‐T1AM wird in die Zelle aufgenommen, zu 3‐Iodothyroessigsäure (TA1) metabolisiert, und wieder exportiert. Nach 3‐T1AM Gabe ist die mitochondriale ATP‐Produktion sowie die Glukose‐stimulierte Insulinsekretion (GSIS) vermindert. 3,5‐T2 zirkuliert in euthyreoten Individuen, ist nicht an der zentralen Regulation der TH‐Achse beteiligt, wird extrathyroidal gebildet und niedrige T3‐Werte können durch erhöhtes 3,5‐T2 erklärt werden. HepG2 erwies sich als ungeeignetes Zellmodell, da wenige THT vorhanden sind, 3,5‐T2 die Plasmamembran wahrscheinlich nicht passieren kann und damit die Aktivierung der Mitochondrien aus bleibt. In MIN6 wurde gezeigt, dass die GSIS nicht ausschließlich an der Plasmamembran durch 3‐T1AM reguliert wird. / Thyroid hormones (TH) regulate metabolism and energy metabolism. The TH‐metabolite (THM) 3,5‐T2 (3,5‐diiodo‐L‐thyronine) activates fat oxidation and mitochondrial respiration. The THM 3‐T1AM (3‐iodothyronamine) influences in addition glucoregulatory processes. THM may support reduction in body fat mass. It was the idea to establish, validate and apply an immunoassay to determine 3,5‐T2 in human serum. Using intact hepatocellular (HepG2) as well as pancreatic ß‐cells (MIN6) it should be tested if THM can modulate mitochondrial activity, resulting in increased cellular substrate usage (3,5‐T2) as well as decreased insulin secreation (3‐T1AM). The established immunoassay is sensitive, specific and detects precisely 3,5‐T2 in human serum. Hyper‐ and hypothyroidism shows similar 3,5‐T2 concentrations, although 3,5‐T2 accumulates in secondary thyroidal illness as well as in athyreotic patients under thyroxine‐supplementation. Using HepG2 cells, mitochondrial respiration was stimulated by 3,3‘,5‐triiodo‐L‐thyronine (T3), but 3,5‐T2 had no effect. Expression of TH‐transporters (THT) was low compared to murine hepatocytes. In contrast, MIN6 express THT comparable to murine Langerhans islets. 3‐T1AM is taken up by the cell, metabolized to 3‐iodothyroacetic acid (TA1) and following export. After 3‐T1AM application mitochondrial ATP‐production as well as glucose‐stimulated insulin secretion (GSIS) was reduced. 3,5‐T2 circulates in euthyroid individuals, is not involved in central regulation of TH‐axis, is produced extrathyroidally and low T3 values can be explained by increased 3,5‐T2. HepG2 was shown to be an inappropriate cellmodel, because THT are merely expressed, suggesting that 3,5‐T2 is not able to pass the plasma membrane, thereby preventing mitochondrial activation. In addition, it was shown in MIN6 cells, that GSIS is not exclusively regulated at the plasma membrane level via 3‐T1AM.

Der Monocarboxylattransporter 8 (Mct8) ist ein spezifischer Schilddrüsenhormon (SDH)-Transporter. MCT8-Mutationen führen zu einer psychomotorischen Retardierung in Kombination mit abnormalen SDH-Serumkonzentrationen. Das konstitutiv Mct8-defiziente Mausmodell repliziert den endokrinologischen, jedoch nicht den humanen neurologischen Phänotyp. Um die Hypothese eines stark beeinträchtigten T3-Transportes speziell in Neuronen als Ursache zu untersuchen, wurde das Neuron-spezifische Mct8-defiziente Mausmodell (CamK-Cre;Mct8fl/fl) generiert. Neben einer funktionalen, Mct8-exprimierenden Blut-Hirn-Schranke liegt eine funktionale Hypophysen-Hypothalamus-Schilddrüsen Achse vor. NMR-Analysen des zerebralen Energiestoffwechsels von CamK-Cre;Mct8fl/fl-Mäusen zeigen nach [1-13C] Glukoseinfusion verringerte Laktatintensitäten sowie eine reduzierte Laktatdehydrogenase-Aktivität. Zudem sind Astrozyten-spezifische Transporter und Enzyme des Neurotransmitterstoffwechsels und deren Biosynthese in ihrer Genexpression reduziert. Somit führt der neuronale Mct8-Verlust zu einem verlangsamten zerebralen Metabolismus sowie einer reduzierten neuronalen Aktivität. Die Rolle von Mct8 im Energiestoffwechsel wurde außerdem in primären Mct8-defizienten Astrozyten- und Neuronkulturen mittels Seahorse Flux Analyzer untersucht. In Mct8-defizienten Neuronen kommt es zu einer verringerten SDH-Aufnahme, was in einer verringerten Expression von OXPHOS-relevanten Proteinen sowie in einer verringerten Sauerstoffverbrauchsrate resultiert. Somit stützen die in vitro Daten die des CamK-Cre;Mct8fl/fl-Mausmodelles bezüglich einer reduzierten neuronalen Aktivität sowie eines verlangsamten zerebralen Stoffwechsels. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass grundlegende Mechanismen des zerebralen Stoffwechsels bei neuronaler Mct8-Defizienz beeinträchtigt sind und die Rolle von Mct8 mit Hilfe weiterer konditioneller Mausmodelle (Astrozyten-spezifisch) und primären Ko-Kulturmodellen untersucht werden muss. / The monocarboxylate transporter 8 (Mct8) is the most specific thyroid hormone (TH) transporter. Mutations lead to a severe form of psychomotor retardation in combination with abnormal TH concentrations in sera. The global Mct8-deficient mouse model was intensively studied and it replicates the endocrine, but not the human neurological phenotype. To test the hypothesis, that a disturbed uptake of T3 especially into neurons is responsible for the phenotype, we generated a neuron-specific Mct8-deficient mouse model (CamK-Cre;Mct8fl/fl). CamK-Cre;Mct8fl/fl mice exhibit a functional Mct8-expressing blood-brain-barrier and a functional hypothalamus pituitary thyroid axis. NMR analyses of the cerebral energy metabolism of CamK-Cre;Mct8fl/fl mice after [1-13C] glucose injection revealed less enrichment of lactate and a reduced lactate dehydrogenase activity. Moreover, especially astrocyte-specific expressed transporter and enzymes of neurotransmitter metabolism and their biosynthesis are significantly reduced in comparison to control mice. These results point to a decelerated cerebral metabolism as well as a reduced neuronal activity caused by the neuronal loss of Mct8. In addition, we studied the impact of Mct8 on the energy metabolism in primary wildtype and Mct8-deficient astrocyte and neuron cultures by use of the Seahorse Flux Analyzer. Mct8-deficient neurons show a reduced uptake of TH, which results in a reduced expression of OXPHOS relevant proteins as well as a reduced oxygen consumption rate. Therefore, the in vitro raised data provide the observed changes of the CamK-Cre;Mct8fl/fl mice regarding a reduced synaptic activity as well as a reduced cerebral metabolism. Taken together, the data clearly shows that basic mechanisms of the cerebral metabolism are hampered in neuronal Mct8 deficiency. The role of Mct8 in this context needs further analyses with the help of conditional mouse models (astrocyte-specific) and primary co-culture models.

Das Schilddrüsenhormon Triiodthyronin (T3) ist ein essenzieller Regulator physiologischer Prozesse der Entwicklung, des Wachstums und im Intermediärstoffwechsel. Täglich werden zahlreiche natürliche und synthetische Stoffe aufgenommen, die mit dem endokrinen System interferieren und deshalb als Endokrine Disruptoren (ED) bezeichnet werden. Zur Untersuchung einer direkten Interferenz von ED mit den Schilddrüsenhormonrezeptoren (TR) und ihrer transkriptionellen Aktivität wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues Luziferase-basiertes T3 Reportergensystem mit TRalpha1-transfizierten humanen Leberzellen aufgebaut. Durch Validierung mit dem synthetischen TR-Agonisten GC-1 und dem Antagonisten NH-3 konnte nachgewiesen werden, dass dieser Assay ein hoch-sensitives System zur Analyse von agonistischen sowie antagonistischen Effekten von Testsubtanzen darstellt. Zur Bestimmung der endokrinen Aktivitäten einiger humanrelevanter Vertreter aus den Stoffkategorien der Nahrungsmittel, Kosmetika, Pestizide und Industriechemikalien wurden Dosis-Wirkungskurven in Aktivierungs- und T3-Kompetitionsexperimenten ermittelt. In mikromolaren Konzentrationen wirkten von insgesamt 21 Testsubstanzen einige als reine Agonisten oder Antagonisten während andere gemischt agonistische/antagonistische Effekte hatten. Aufgrund ihrer hier beobachteten Effekte und der gegebenen Humanexposition wird eine eingehendere Analyse von 4-Methylbenzyliden Campher, 4-Nonylphenol, Acetochlor, Benzophenon 2, Benzophenon 3, Bisphenol A, Genistein, Octylmethoxycinnamat, Tetrabromobisphenol A und Xanthohumol empfohlen. Außerdem erwiesen sich einige Metaboliten von Schilddrüsenhormonen als potente Agonisten im T3-Reportergenassay und bedürfen weiterer Aufmerksamkeit. Für die molekulare Charakterisierung der Einflüsse solcher Substanzen auf die T3-regulierte Transaktivierung konnte mit dem hier etablierten Bioassay ein zuverlässiges neues Testsystem für reproduzierbare Screeningserien geschaffen werden. / Triiodothyronine (T3) is a crucial regulator of many physiological processes during development, growth and metabolism. A variety of natural and synthetic substances, which are collectively termed endocrine disrupters (ED) due to their interference with the endocrine system, is taken up on a daily base. A novel luciferase-based T3-responsive reporter gene system employing a human liver cell line transfected with thyroid hormone receptor (TR) alpha1 was established in this work to elucidate the potential molecular interference of certain ED with TR and their transcriptional activity. This assay was validated to be a highly sensitive and reliable tool for analyzing agonistic and antagonistic effects of test compounds using the synthetic TR agonist GC-1 and the antagonist NH-3. Dose-response data of test compounds contained in food, cosmetics, pesticides, plasticizers and other industrial chemicals were obtained after applying the substances alone in activation assays or in combination with T3 in competition assays. In total 21 test compounds were screened of which some acted as pure agonists or antagonists while others were mixed agonists/antagonists in the micromolar concentration range and only one was without effect. Follow-up studies are recommended for some of these substances with regard to their effects as determined in this bioassay and in light of information known on human exposure, i.e., 4-methylbenzyliden camphor, 4-nonylphenol, acetochlor, benzophenone 2, benzophenone 3, bisphenol A, genistein, octylmethoxycinnamate, tetrabromobisphenol A and xanthohumol. In addition some endogenous metabolites of thyroid hormones were surprisingly potent agonists in the T3 reporter gene assay and merit further attention. The novel bioassay established here represents a reliable tool for the screening and molecular characterization of substances interfering with T3-mediated transactivation of gene expression.